miR-133在急性冠脈綜合征中表達(dá)水平及臨床意義

張文靜 孫璐 孫彬

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬益都中心醫(yī)院，山東 濰坊 262500)

急性冠脈綜合征(ACS)是一組由心肌嚴(yán)重缺血所導(dǎo)致的進(jìn)展性臨床綜合征，多為冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成引起〔1〕。研究指出，內(nèi)皮細(xì)胞功能的正常發(fā)揮及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)是ACS發(fā)生和進(jìn)展過程中重要環(huán)節(jié)〔2〕。目前對于ACS的診斷主要依賴高分辨率影像學(xué)成像技術(shù)和循環(huán)血生化標(biāo)志物的檢測，但是存在費用昂貴，診斷準(zhǔn)確率有限的問題〔3，4〕。因此，亟需更加準(zhǔn)確的診斷和治療方法來對ACS患者進(jìn)行早期診斷并提供及時治療。微小RNA(miRNAs)是一系列內(nèi)源性無蛋白編碼功能的小RNAs〔5〕。研究表明，miRNAs是ACS診斷和治療的潛在靶點〔6，7〕。miRNAs通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及炎癥反應(yīng)兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，發(fā)揮改善ACS預(yù)后的作用〔8，9〕。雖然目前已經(jīng)揭示了部分功能miRNAs〔10〕，但是miRNAs在ACS中發(fā)揮作用的分子機制尚不清晰，極大阻礙了ACS疾病治療的發(fā)展和創(chuàng)新。本實驗評估m(xù)iR-133在ACS患者中的診斷價值，并探究其對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集80例ACS患者(ACS組)及80例健康人為對照(對照組)。患者在濰坊市益都中心醫(yī)院通過冠狀動脈造影進(jìn)行確診。本研究不包括有腎病史、糖尿病史和嚴(yán)重左室收縮功能障礙的ACS患者。在行冠狀動脈造影之前收集患者血清。血清經(jīng)離心分離后保存于-80℃進(jìn)行進(jìn)一步分析。本研究經(jīng)濰坊市益都中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有患者都簽署書面的知情同意書。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HUVECs在含有10%胎牛血清(FBS；PAN，Aidenbach，Germany)和含1%鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度37℃，5% CO2。待細(xì)胞長至對數(shù)生長期，按照說明書使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國)分別轉(zhuǎn)染模擬物對照物(mimic NC)、miR-133模擬物(miR-133 mimic)、抑制劑對照物(inhibitor NC)、miR-133抑制劑(miR-133 inhibitor)。

1.3RNA提取及實時熒光定量PCR(qRT-PCR) qRT-PCR檢測血清miR-133水平。使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，美國)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以U6位內(nèi)參，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(購自美國Biosystems公司)對miR-133的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。反應(yīng)條件：95℃ 15 min；94℃ 15 s；55℃ 30 s；70℃ 34 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，使用2-ΔΔCt方法對miR-133的相對表達(dá)量進(jìn)行計算。

1.4CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔1 000個細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)接種于96孔板中，連續(xù)培養(yǎng)3 d，每隔24 h進(jìn)行檢測，檢測前向培養(yǎng)孔中添加10 μl CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱中孵育2 h后，放置酶標(biāo)儀上震蕩10 min，檢測490 nm處的吸光值，連續(xù)檢測3 d，用來評估m(xù)iR-133對細(xì)胞活力的影響。

1.5Transwell法檢測細(xì)胞侵襲能力 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(5×104個/孔)懸液添加至Transwell的上室中，下室添加500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。放置培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，取出小室，用棉簽將上室的細(xì)胞及基質(zhì)膠擦拭掉，小室放在4%的多聚甲醛中固定10 min，加0.1%的結(jié)晶紫染色20 min，雙蒸水清洗后，在顯微鏡下隨機選取5個視野進(jìn)行拍照并計數(shù)，檢測細(xì)胞的遷移能力。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0和GraphPad Prism5.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析χ2檢驗。受試者工作特征(ROC)曲線評估血清miR-133在NPC患者中的診斷價值，計算曲線下面積 (AUC)。通過Pearson相關(guān)系數(shù)分析血清miR-133表達(dá)水平與臨床各指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1研究群體臨床病理特征 兩組年齡、性別、吸煙史、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白均無顯著差異(P>0.05)。ACS組心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白、血管性血友病因子、血清白細(xì)胞介素(IL)-6、血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、血清IL-1β水平均顯著高于對照組(P<0.001)。見表1。

表1 兩組臨床病理特征比較

2.2兩組血清miR-133的表達(dá)水平 miR-133在ACS組血清中的表達(dá)水平高于對照組(1.463±0.233 vs 1.006±0.283)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.3miR-133在ACS中的診斷準(zhǔn)確性 miR-133診斷ACS的AUC為0.892，靈敏度82.5%，特異度85.0%，臨界值為1.275。見圖1。

圖1 miR-133在ACS中診斷準(zhǔn)確性ROC曲線

2.4ACS患者中miR-133與內(nèi)皮損傷和炎癥的關(guān)系 ACS患者的血清miR-133的表達(dá)水平與心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(r=0.576)、血管性血友病因子(r=0.707)、血清IL-6(r=0.725)、血清TNF-α(r=0.654)、血清IL-1β的水平呈顯著正相關(guān)(r=0.420，均P<0.001)。

2.5miR-133對VSMC細(xì)胞增殖和遷移的影響 VSMC細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-133 mimic后，miR-133的表達(dá)水平顯著升高，相反，轉(zhuǎn)染miR-133 inhibitor顯著抑制了miR-133的表達(dá)水平。miR-133高表達(dá)顯著促進(jìn)了VSMC細(xì)胞增殖和遷移能力，相反，miR-133低表達(dá)則顯著抑制了VSMC細(xì)胞的增殖和遷移能力。見表2。

表2 miR-133對HUVEC細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

3 討 論

miRNAs在包括心腦血管疾病在內(nèi)的多種人類疾病中起到關(guān)鍵作用〔11〕。循環(huán)miR-195-3p升高被證明是心力衰竭患者的診斷性生物標(biāo)志物〔12〕。miR-487b能夠通過IL-33/ST2信號通路減少心肌凋亡和炎癥反應(yīng)，從而改善慢性心力衰竭〔13〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-133在ACS中高表達(dá)。研究表明，miR-133在各種心血管疾病中發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能。Navickas等〔14〕發(fā)現(xiàn)，血清miR-133在心血管疾病中顯示出一定的診斷的潛力。過表達(dá)miR-133具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的作用〔15〕。

ACS是一種復(fù)雜的表型，受環(huán)境和遺傳因素的影響，其病理過程包括內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、炎癥改變及血栓成分之間的相互作用〔16〕。ACS患者的冠狀動脈疾病的病理進(jìn)展非常迅速，早期診斷和預(yù)后治療治療ACS是至關(guān)重要的〔17〕。本研究相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACS患者血清miR-133的表達(dá)水平與血管內(nèi)皮損傷標(biāo)志物的水平顯著正相關(guān)。炎癥和內(nèi)皮功能障礙在ACS患者急性治療和長期管理中也起重要作用。已有研究報道，miR-133通過調(diào)控機體的炎癥反應(yīng)，參與多種疾病的進(jìn)展〔18，19〕。本研究結(jié)果說明miR-133可能通過調(diào)控機體的炎癥反應(yīng)，參與ACS的進(jìn)程。

雖然在臨床方法中已經(jīng)有了一些進(jìn)展，但ACS患者的預(yù)后仍然不佳〔20〕。研究表明，在ACS的發(fā)展過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)功能障礙是參與ACS發(fā)病機制的重要因素〔21〕。此外，已有miRNAs被證實參與HUVECs細(xì)胞的增殖和遷移進(jìn)程的調(diào)控〔22〕。例如，Luo等〔2〕在小鼠中研究發(fā)現(xiàn)，miR-150通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移參與ACS的進(jìn)程。在本研究中，我們進(jìn)一步驗證了miR-133在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙中的作用。通過調(diào)控miR-133在HUVECs細(xì)胞中的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)，miR-133高表達(dá)顯著促進(jìn)了VSMC細(xì)胞的增殖和遷移能力，相反，miR-133低表達(dá)則顯著抑制了VSMC細(xì)胞的增殖和遷移能力。綜上所述，miR-133在ACS患者中高表達(dá)，是ACS早期診斷的一個潛在生物標(biāo)志物，miR-133可能通過調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移參與疾病的進(jìn)程。