化瘀無糖顆粒HPLC 指紋圖譜研究

陳金娜，萬齊越，劉向紅

（山東大學齊魯醫(yī)院，山東 濟南 250012）

化瘀無糖顆粒是由山東大學齊魯醫(yī)院經(jīng)驗方化瘀顆粒經(jīng)工藝優(yōu)化制成的無糖劑型［1］，由人參、蒲公英、土茯苓、漏蘆、水蛭、柴胡、蒼術(shù)、當歸、蒲黃等13味中藥組成。 方中人參苦甘而溫，大補元氣、生津養(yǎng)血，為君藥；蒲公英配伍土茯苓、漏蘆清熱解毒、消癰散結(jié)，共為臣藥；柴胡、郁金行氣活血，蒲黃、當歸補血活血止痛，水蛭破血消癥，牛膝逐瘀通經(jīng)、引血下行，蒼術(shù)健脾安胃，熟地黃補血滋陰，以上共為佐藥；炙甘草補脾和胃，調(diào)和諸藥，為使藥。 諸藥合用共奏補益正氣、消腫散結(jié)之功效。 目前，化瘀無糖顆粒的質(zhì)量控制方法為部分成分的定性定量檢測［2］，而中藥復(fù)方成分復(fù)雜，具有靶點多、整體協(xié)同等特點，單一組分或幾種成分的定性定量分析無法準確、全面反映中藥復(fù)方制劑的整體質(zhì)量［3-4］。

中藥色譜指紋圖譜利用現(xiàn)代分析方法，以圖、表、數(shù)據(jù)的形式綜合、可量化地識別中藥中的復(fù)雜成分，具有整體性和模糊性的特點，能更全面地反映中藥化學成分的多樣性和中藥方劑功效的整體性，近幾十年來在中藥及其復(fù)方制劑質(zhì)量控制中得到廣泛應(yīng)用［5-8］。 課題組首次采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）建立化瘀無糖顆粒指紋圖譜，確定并指認共有峰，以期全面評價化瘀無糖顆粒制劑質(zhì)量，為進一步研究其作用機制提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

分析天平（CP2250，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）、高效液相色譜儀（6CE，美國 Waters 公司）、Waters 2996 DAD 檢測器、Empower600 色譜工作站、KDM型控溫電熱套（V1000 mL，山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）、876-Ⅰ型真空干燥箱（南通科學儀器廠）、超聲波清洗機（SK5200H）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

次黃嘌呤（批號140661-200903）、咖啡酸（批號110885-200102）、香蒲新苷（批號 111573-200604）、異鼠李素-3-O-新橙皮苷（批號 111571-200604）、落新婦苷（批號 111798-201102）、人參皂苷 Rg1（批號110703-201027）、人參皂苷 Re（批號 110754-201123）、人參皂苷 Rb1（批號 110704-201122）、甘草酸銨（批號110731-201116）、柴胡皂苷 a（批號 110777-201108），均購自中國食品藥品檢定研究院。 化瘀無糖顆粒處方中13 味中藥飲片購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，12 批次（S1～S12）化瘀無糖顆粒樣品由山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室制備。 乙腈、磷酸為色譜純，余試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法

2.1 色譜條件

Phenomenex Luna C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）（0～7 min，10%A；7～12 min，10%～15%A；12～18 min，15%A；18～23 min，15%～17%A；23～28 min，17%A；28～33 min，17%～18%A；33～38 min，18%A；38～43 min，18%～19%A；43～53 min，19%A；53～75 min，19%～29%A；75～80 min，29%A；80～100 min，29%～40%A；100～120 min，40%A）。 檢測波長 203 nm，流速1.0 mL/min，進樣量 10 μL，柱溫 25 ℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取次黃嘌呤1.77 mg、咖啡酸 2.03 mg、香蒲新苷 1.96 mg、異鼠李素-3-O-新橙皮苷1.86 mg、落新婦苷2.06 mg、人參皂苷Rg12.55 mg、人參皂苷Re 2.82 mg、人參皂苷Rb12.93 mg、甘草酸銨1.72 mg、柴胡皂苷a 2.12 mg。上述對照品共置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解，定容，作為混合對照品溶液。 次黃嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新婦苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、甘草酸銨、柴胡皂苷a 的質(zhì)量濃度分別為 70.8 μg/mL、81.2 μg/mL、78.4 μg/mL、74.4 μg/mL、82.4 μg/mL、102.0 μg/mL、112.8 μg/mL、117.2 μg/mL、68.8 μg/mL、84.8 μg/mL。

2.2.2 化瘀無糖顆粒樣品溶液 精密稱取化瘀無糖顆粒2.0 g，加入甲醇30 mL，于50 ℃加熱回流30 min，濾過，精密量取續(xù)濾液15 mL，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加入水飽和正丁醇萃取3 次，每次10 mL，合并正丁醇提取液，加入純水洗滌3 次，每次30 mL，取正丁醇層蒸干，加入適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL 容量瓶中，定容，0.22 μm 微孔濾膜濾過，作為化瘀無糖顆粒樣品溶液。

2.3 參照峰的選擇

考察化瘀無糖顆粒HPLC 指紋圖譜，所有色譜峰中10 號峰，即落新婦苷峰吸收強而穩(wěn)定，峰面積大，分離效果良好，且落新婦苷是臣藥土茯苓的指標成分［9］，也是藥理活性成分［10-13］，因此選取 10 號峰為參照峰（S）。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取S1 樣品按照2.2.2 項下方法制備樣品溶液，以2.1 項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，以落新婦苷峰作為參照峰，計算各峰相對保留時間（tR）和相對峰面積。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取S1 樣品按照2.2.2 項下方法制備樣品溶液，按 2.1 項下色譜條件分別在 0、2、4、8、12、24 h 依次進樣測定，計算各峰tR和相對峰面積。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取S1 樣品按照2.2.2 項下方法制備樣品溶液6 份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，計算各峰tR和相對峰面積。

2.5 指紋圖譜的建立與相似度評價

2.5.1 指紋圖譜建立與分析 取化瘀無糖顆粒樣品S1～S12 按照2.2.2 項下方法平行制備樣品溶液，按照2.1 項下色譜條件測定混合對照品溶液和樣品溶液，記錄色譜圖。

2.5.2 相似度評價 將所得指紋圖譜導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系件”（2004A版），以對照譜圖上標示的色譜峰作為匹配點，進行多點校正。

3 結(jié)果

3.1 方法學考察結(jié)果

精密度實驗中，色譜圖中各主要色譜峰tR的相對標準偏差（RSD）為0.04%～1.48%，相對峰面積RSD 為2.66%～4.82%，表明儀器精密度良好。 穩(wěn)定性實驗中，色譜圖中各主要色譜峰tR的RSD 為0.03%～1.28%，相對峰面積的RSD 為2.30%～4.32%，表明樣品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。 重復(fù)性實驗中，色譜圖中各主要色譜峰tR的RSD 為0.04%～0.72%，相對峰面積的RSD 為3.28%～4.80%，表明該方法重復(fù)性良好。見表1。

表1 化瘀無糖顆粒指紋圖譜方法學考察結(jié)果（相對標準偏差）

（續(xù)）表1 化瘀無糖顆粒指紋圖譜方法學考察結(jié)果（相對標準偏差）

3.2 化瘀無糖顆粒指紋圖譜的建立

將12 批樣品色譜圖導入國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2004A 版），見圖1。12 批樣品中共標定21 個共有峰，其中10 個共有峰與對照品色譜圖中的保留時間一致，可指認1、4、6、9、10、13、14、17、20、21 號峰分別為次黃嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新婦苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、甘草酸銨、柴胡皂苷a，見圖2。 其余11 個共有峰仍需進一步研究。 相似度評價結(jié)果顯示，12 批樣品指紋圖譜的相似度值依次為 0.974、0.981、0.981、0.981、0.952、0.973、0.983、0.981、0.977、0.938、0.940、0.969， 平 均值為 0.9692，RSD 值為 1.69%（n=12），內(nèi)在成分整體化學譜峰信息表明12 批化瘀無糖顆粒樣品質(zhì)量相對穩(wěn)定。

圖1 12 批化瘀無糖顆粒高效液相色譜指紋圖譜疊加圖（A）和對照指紋圖譜（B）

圖2 混合對照品高效液相色譜色譜圖（A）及化瘀無糖顆粒高效液相色譜色譜圖（B）

4 討論

化瘀無糖顆粒為13 味藥組成的中藥復(fù)方制劑，其提取工藝為水煎煮提取法，成分復(fù)雜。 本實驗考察了樣品溶液制備方法，采集不同濃度的甲醇提取液進行HPLC 分析，存在雜質(zhì)峰干擾嚴重、色譜峰分離效果較差等問題。 實驗過程中發(fā)現(xiàn)采用甲醇回流、水飽和正丁醇萃取、純水充分洗滌的方法可消除大部分干擾峰，實現(xiàn)較好的分離效果，且色譜峰信息較多，故選擇此方法。

本實驗考察了不同體積分數(shù)、不同比例的甲醇-水、甲醇-磷酸、乙腈-水，乙腈-磷酸作為流動相時的色譜圖保留時間和分離效果，比較各流動相系統(tǒng)等度洗脫和梯度洗脫模式，最終選定乙腈-0.1%磷酸為流動相梯度洗脫。 通過DAD 檢測器全波長（200～400 nm）掃描，可見203 nm 時檢出峰信息較多，各峰分離效果較好，峰高比例適宜，基線較平穩(wěn)，故本研究選擇203 nm 為檢測波長。

研究建立了化瘀無糖顆粒HPLC-DAD 指紋圖譜檢測分析方法，12 批化瘀無糖顆粒特征圖譜有21個共有峰（相對保留時間RSD 均小于1%），指認特征峰 10 個，1、4、6、9、10、13、14、17、20、21 號峰分別對應(yīng)的化學物質(zhì)為次黃嘌呤、咖啡酸、香蒲新苷、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、落新婦苷、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、甘草酸銨和柴胡皂苷a，其中10 號峰落新婦苷分離度好，最為穩(wěn)定，選作參照峰。

首次建立的化瘀無糖顆粒HPLC-DAD 指紋圖譜，圖譜出峰數(shù)目、出峰強度及共有峰整體分離度等均表現(xiàn)良好，能夠較全面地反映樣品整體化學組分的信息特征。 化瘀無糖顆粒樣品HPLC 指紋圖譜的相似度計算結(jié)果顯示，12 批樣品相似度均大于0.938，使得制劑質(zhì)量控制標準更為完善、合理，可用于該制劑質(zhì)量的綜合評價，為化瘀無糖顆粒作用機制研究提供理論基礎(chǔ)，亦可為其他中藥復(fù)方制劑建立HPLCDAD 指紋圖譜分析方法提供參考。