洋川芎內酯A 聯合表柔比星干預膀胱癌5637 細胞的作用機制研究

林 磊，楊樹立，孫超群，李寶山

（1.平頂山市第一人民醫(yī)院泌尿外科，河南 平頂山 467000；2.河南大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南 開封 475000）

膀胱癌的發(fā)病率和病死率在泌尿系統惡性腫瘤中居首位，其發(fā)病率預計在未來十年內將持續(xù)上升，嚴重損害公眾健康［1］。 膀胱癌分為非肌層浸潤性膀胱癌和肌層浸潤性膀胱癌，大多數患者為非肌層浸潤性膀胱癌，經尿道膀胱腫瘤切除術后復發(fā)率為 75%［2］。 膀胱癌由于其高復發(fā)率和轉移率而不易治愈，化療或其他全身治療對其療效有限，五年生存率低于 50%［3］。 表柔比星（EPI）也稱表阿霉素，是經尿道前切除至非肌層浸潤性膀胱癌，用以預防癌癥復發(fā)和進展最常用的膀胱內化療藥物之一［4］。但隨著耐藥性的出現，使其應用受到很大限制。因此，迫切需要尋找聯合用藥方案，增加膀胱癌細胞對EPI 的敏感性。 洋川芎內酯類化合物提取自中藥川芎、當歸等傘形科植物，主要包括洋川芎內酯A（SEA）、洋川芎內酯H、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯D、洋川芎內酯F、洋川芎內酯J、洋川芎內酯M、洋川芎內酯 Q 等［5］。 現代藥理學證明，洋川芎內酯化合物具有抗氧化損傷、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗凝及抗血小板聚集、舒張血管等多種藥理作用［6-11］。 近年來的臨床應用和實驗研究表明，中藥及中藥活性成分治療膀胱癌具有明顯優(yōu)勢。 已有研究報道，SEA 具有抑制結腸癌細胞增殖的作用［11］。 但目前還沒有關于SEA 調節(jié)膀胱癌細胞對EPI 敏感性方面的研究，本文旨在研究SEA 影響膀胱癌5637 細胞對EPI 敏感性的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物

SEA（批號M4427）購自美國AbMole 生物技術公司。 化學式 C12H16O2，相對分子質量為 192.25424，純度＞98%。

1.2 試驗動物

12 只SPF 級裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，雄性，6 周齡，體質量（20±3）g，許可證號 SCXK（京）2015-0001。 于 SPF 級別動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)。 保持濕度30%，氣溫20～25 ℃，每周更換滅菌墊料，按時添加裸鼠飼料及飲水。 動物實驗倫理審批號：2020-1011。

1.3 試驗試劑

EPI（批號 XY-1752-250）購自美國 biovision 公司；洛斯維·帕克紀念研究所（RPMI）1640 培養(yǎng)基（批號 61870-127）、胎牛血清（批號 26400-036）、青-鏈霉素（批號 15140-122）、胰蛋白酶（批號 25200-056）購自美國 Gibco 公司；CCK-8 試劑盒（批號 C0037）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號P0012）購自上海碧云天生物技術研究所；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒（批號G003-1-2）購自南京建成生物工程研究所；Anti 多藥耐藥關聯蛋白 1（MRP1，批號 ab233383）、增殖細胞核抗原（PCNA，批號ab92552）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved caspase-3，批號ab2302）、拓撲異構酶-Ⅱ（Topo-Ⅱ，批號 ab109524）購自英國 Abcam 公司；Anti 肺耐藥蛋白（LRP，批號610512）購自美國 BD 公司。

1.4 試驗儀器

全自動多功能酶標儀（型號BS-1101）購自北京華泰和合商貿有限公司；流式細胞儀購自美國BD公司；全自動凝膠成像分析系統（型號ZF-288）購自上海金鵬分析儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號DHP-360S）購自上海高致精密儀器有限公司。

1.5 細胞培養(yǎng)

人輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1 和人膀胱癌細胞5637 來源于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，將細胞培養(yǎng)于RPMI 1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和 1×105U/L 鏈霉素）中，置于5%二氧化碳、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 培養(yǎng)基 2 d 更換一次，3～4 d 傳代一次，實驗用細胞為對數生長期細胞。

1.6 CCK-8 檢測細胞活力與增殖

將人輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1 和人膀胱癌細胞 5637 接種于 96 孔板（100 μL/孔）孵育 24 h 后，用不同劑量（0、0.5、1、5、10、20、40、80、160 μmol/L）SEA 處理細胞，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液孵育 4 h，在450 nm 處用酶標儀測定光密度（OD）值，并計算半數抑制濃度（IC50）值。 選用人膀胱癌細胞5637 進行后續(xù)實驗。

1.7 細胞分組

采用SEA 處理人膀胱癌細胞5637 細胞，將細胞分為對照組、SEA 低劑量組（SEA10 組）、SEA 中劑量組（SEA20 組）、SEA 高劑量組（SEA40 組）、EPI 單獨處理組（EPI 組）和聯合處理組（SEA40+EPI 組）。SEA 低、中、高劑量組分別用 10、20、40 μmol/L 劑量 SEA 處理細胞，EPI 質量濃度為 1.2 μg/mL［4］，聯合處理組SEA 劑量為40 μmol/L。

1.8 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數生長期細胞離心5 min，棄上清，收集細胞，用PBS 重懸細胞并計數；取1×105重懸細胞，3500 r/min 離心5 min，離心半徑 8 cm，棄上清，加入500 μL 結合液輕輕重懸細胞，加入 5 μL Annexin VFITC，輕輕混勻；再加入5 μL 碘化丙啶，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min。 用流式細胞儀進行檢測，Annexin V-FITC 為綠色熒光，PI 為紅色熒光。 Q1 為壞死細胞，Q2 為晚期凋亡細胞，Q3 為正常細胞，Q4為早期凋亡細胞，細胞凋亡率=Q2+Q4。

1.9 裸鼠移植瘤模型建立［12］

各組裸鼠后肢腹側皮下分別注射0.2 mL 的1×107個/mL 膀胱癌細胞5637 懸液，接種24 h 后將裸鼠隨機分為對照組、SEA 藥物組、EPI 藥物組和SEA+EPI組。 SEA 組裸鼠灌胃 SEA 20 mg/kg［13-15］，EPI 組裸鼠皮下接種部位注射 EPI 0.002 mg/kg［16］，SEA+EPI組灌胃SEA 20 mg/kg 并同時于皮下接種部位注射EPI 0.002 mg/kg，對照組灌胃等量生理鹽水并于皮下接種部位注射等量生理鹽水，連續(xù)30 d。

1.10 腫瘤體積

模型建立后每隔5 天用游標卡尺記錄所成瘤的長徑和短徑，腫瘤體積 = 長徑×短徑2×1/2［17］。 在第30 天記錄移植瘤的長徑和短徑后，斷頸法處死裸鼠。

1.11 免疫蛋白質印跡（Western Blot）法檢測MRP1、LRP、Topo-Ⅱ、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白表達

先將各組待測細胞與裸鼠移植瘤腫瘤組織用PBS 清洗3 次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA 試劑盒測定蛋白質含量，提取等量的蛋白質樣品，100 ℃變性5 min。 然后進行SDS-PAGE 凝膠電泳分離并轉移至PVDF 膜，5%的BSA 室溫封閉1～2 h 后加入相應的一抗，4 ℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。 最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用ImageJ 軟件統計灰度值，計算相對表達量。 GAPDH 作為上樣量參照，至少重復三個獨立的實驗。

1.12 統計學方法

使用SPSS 17.0 軟件對實驗數據進行統計學分析。 數據表示為，各組間比較采用方差分析法。取α=0.05 為檢驗水準。

2 結果

2.1 SEA 對SV-HUC-1 細胞和人膀胱癌5637 細胞活力的影響

采用CCK-8 試劑盒檢測SV-HUC-1 細胞和5637癌細胞活力，見圖 1。 與 0 μmol/L 劑量時相比，5637癌細胞 10、20、40 μmol/L 劑量時細胞存活率顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05），SV-HUC-1 細胞80 μmol/L 劑量時細胞存活率顯著降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；5637 癌細胞 40 μmol/L 劑量時細胞存活率顯著低于SV-HUC-1 細胞40 μmol/L劑量，差異具有統計學意義（P＜0.05）。 通過計算得出 SV-HUC-1 細胞 IC50值為 148.754 μmol/L，5637 膀胱癌細胞 IC50值為 94.273 μmol/L，說明 SEA 對 SVHUC-1 細胞和5637 癌細胞具有殺傷力，且對5637膀胱癌細胞殺傷力高于SV-HUC-1 細胞。

圖1 洋川芎內酯A 對SV-HUC-1 細胞和人膀胱癌5637 細胞活力的影響

2.2 SEA 對人膀胱癌5637 細胞凋亡和增殖的影響

采用流式細胞儀檢測人膀胱癌5637 細胞凋亡結果。 對照組細胞凋亡率顯著低于SEA20 組和SEA40組，EPI 組細胞凋亡率顯著高于對照組，SEA40+EPI組細胞凋亡率顯著高于EPI 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。 對照組 450 nm 處 OD 值顯著高于SEA20 組、SEA40 組和 EPI 組，SEA40+EPI 組 450 nm處OD 值顯著低于EPI 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。 見圖 2、表 1。

表1 洋川芎內酯A 對人膀胱癌5637 細胞凋亡與增殖的影響（）

表1 洋川芎內酯A 對人膀胱癌5637 細胞凋亡與增殖的影響（）

注：SEA 為洋川芎內酯 A，EPI為表柔比星，OD 為光密度。 與對照組比較，*P＜0.05；與 EPI 組比較，#P＜0.05。

組別 細胞凋亡率/% OD 值（450 nm）對照組 3.01±0.41 5.3±0.50 SEA10 組 4.32±0.52 5.1±0.38 SEA20 組 7.31±0.27* 4.9±0.42*SEA40 組 12.38±2.23* 4.3±0.40*EPI 組 45.27±5.59* 3.2±0.45*SEA40+EPI 組 60.23±7.06# 1.8±0.34#

圖2 洋川芎內酯A 對人膀胱癌5637 細胞凋亡的影響

2.3 SEA 對人膀胱癌 5637 細胞 MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平的影響

采用Western Blot 檢測人膀胱癌細胞5637 中MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平，結果如表 2、圖 3 所示。 對照組MRP1 蛋白水平顯著高于SEA20 組和SEA40 組，EPI 組MRP1 蛋白水平顯著高于對照組，SEA40+EPI 組MRP1 蛋白水平顯著低于 EPI 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；對照組LRP 蛋白水平顯著高于 SEA20 組和 SEA40 組，EPI 組 LRP 蛋白水平顯著高于對照組，SEA40+EPI 組LRP 蛋白水平顯著高于 EPI 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；對照組Topo-Ⅱ蛋白水平顯著低于SEA20 組和SEA40組，EPI 組 Topo-Ⅱ蛋白水平顯著低于對照組，SEA40+EPI 組Topo-Ⅱ蛋白水平顯著高于EPI 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 洋川芎內酯A 對人膀胱癌5637 細胞MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平的影響

表2 洋川芎內酯 A 對人膀胱癌 5637 細胞 MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平的影響（，kDa）

表2 洋川芎內酯 A 對人膀胱癌 5637 細胞 MRP1、LRP、Topo-Ⅱ蛋白水平的影響（，kDa）

注：SEA 為洋川芎內酯A，EPI為表柔比星，MRP1 為多藥耐藥相關蛋白1，LRP 為肺耐藥蛋白，Topo-Ⅱ為拓撲異構酶-Ⅱ。 與對照組比較，*P＜0.05；與 EPI 組比較，#P＜0.05。

組別 MRP1 LRP Topo-Ⅱ對照組 0.35±0.04 0.40±0.05 0.39±0.04 SEA10 組 0.27±0.02 0.36±0.02 0.51±0.06 SEA20 組 0.18±0.01* 0.25±0.03* 0.63±0.07*SEA40 組 0.10±0.02* 0.18±0.02* 0.86±0.09*EPI 組 1.06±0.12* 1.15±0.15* 0.16±0.02*SEA40+EPI 組 0.43±0.04# 1.42±0.05# 0.45±0.05#

2.4 SEA 對裸鼠移植瘤模型腫瘤生長的影響

構建裸鼠移植瘤模型，檢測30 d 內腫瘤體積的變化，如圖4 所示。 對照組腫瘤體積顯著大于SEA藥物組和EPI 藥物組，SEA+EPI 組腫瘤體積顯著小于EPI 藥物組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖4 洋川芎內酯A 對腫瘤生長的影響

2.5 SEA 對裸鼠移植瘤模型 MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平的影響

Western Blot 檢測裸鼠移植瘤中MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平結果如表 3、圖5 所示。對照組MRP1 蛋白水平顯著高于SEA 藥物組，EPI藥物組MRP1 蛋白水平顯著高于對照組，SEA+EPI組MRP1 蛋白水平顯著低于EPI 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；對照組PCNA 蛋白水平顯著高于SEA藥物組和 EPI 藥物組，SEA+EPI 組 PCNA 蛋白水平顯著低于EPI 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；對照組cleaved caspase-3 蛋白水平顯著低于SEA藥物組和EPI 藥物組，EPI 藥物組cleaved caspase-3蛋白水平顯著低于SEA+EPI 組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖5 洋川芎內酯A 對裸鼠移植瘤MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平的影響

表3 洋川芎內酯A 對裸鼠移植瘤MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平的影響（，kDa）

表3 洋川芎內酯A 對裸鼠移植瘤MRP1、PCNA、cleaved caspase-3 蛋白水平的影響（，kDa）

注：SEA 為洋川芎內酯A，EPI為表柔比星，MRP1 為多藥耐藥相關蛋白1，PCNA 為增殖細胞核抗原，cleaved caspase-3 為裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。 與對照組比較，*P＜0.05；與EPI 藥物組比較，#P＜0.05。

組別 MRP1 PCNA cleaved caspase-3對照組 0.58±0.06 1.30±0.10 0.27±0.04 SEA 藥物組 0.10±0.02* 0.95±0.09* 0.48±0.05*EPI 藥物組 0.98±0.12* 0.32±0.03* 0.79±0.08*SEA+EPI 組 0.40±0.04# 0.06±0.01# 0.96±0.09#

3 討論

膀胱癌是常見的尿路上皮惡性腫瘤，雖然可通過手術、化療或放療消除原發(fā)膀胱癌腫瘤，但腫瘤經常復發(fā)并可能發(fā)展為肌肉浸潤性疾病［18-19］。 復發(fā)性腫瘤獲得耐藥性是限制癌癥治療的關鍵因素，常見化學制劑的耐藥性涉及多種機制，這些機制可以是內在的，也可以是在治療過程中獲得［20］。

川芎多用于治療腦血管和心血管疾病，包括中風、高血壓、心率失常和內分泌失調等［21］。 SEA 是川芎的主要成分之一，用于治療心腦血管疾病和偏頭痛［22］。 Wang 等［23］研究發(fā)現 SEA 對結腸癌細胞 HT-29具有細胞毒性，并以劑量依賴的方式抑制其增殖。PCNA 又稱周期數，是評價細胞增殖的指標，PCNA在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，檢測其蛋白表達水平，可輔助常規(guī)病理診斷，改善膀胱癌患者的預后［24］。 本研究發(fā)現，SEA 具有下調 PCNA 蛋白表達、降低人輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1 和人膀胱癌細胞5637 細胞活力、抑制人膀胱癌細胞5637 細胞增殖的作用，與EPI 聯合應用對膀胱癌細胞的殺傷性優(yōu)于單獨使用EPI。

細胞凋亡是響應異常和細胞損傷的重要細胞機制，異常凋亡反應在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中十分常見［25］。 細胞凋亡是細胞程序性死亡，治療癌癥的化學預防策略之一就是誘導細胞凋亡［26］。 楊帆等［27］研究發(fā)現茶多酚聯合EPI 可通過上調cleaved caspase-3蛋白表達，增強EPI 對膀胱癌T24 細胞的致凋亡敏感性。 本研究結果與上述研究結果一致，SEA 上調人膀胱癌細胞5637 cleaved caspase-3 蛋白表達，促進人膀胱癌細胞5637 凋亡。 且SEA 與EPI 聯合促細胞凋亡效果優(yōu)于單獨使用EPI，說明SEA 能增強EPI 對膀胱癌的敏感性。

對化學治療藥物的耐藥性通過幾種藥物代謝發(fā)生。 MRP1 作為重要的ATP 結合盒轉運蛋白，通過改變藥物流入或外排影響細胞內藥物濃度，且多重耐藥是膀胱癌治療的嚴重障礙［28］。 MRP1 的過表達可減少細胞內濃度、降低抗癌藥物的細胞毒性，因此，抑制多藥耐藥蛋白表達是提高化療敏感性的潛在途徑。 Topo-Ⅱ是許多抗癌藥的主要靶標。 當靶酶Topo-Ⅱ的活性和敏感性通過下調或突變降低時，發(fā)生對Topo-Ⅱ的耐藥性［29］。 LRP 通過胞吐囊泡或泵分子從細胞內藥物靶標中泵出藥物來介導耐藥性［30］。Wang等［31］研究發(fā)現川芎嗪通過下調 MRP1、LRP，上調 Topo-Ⅱ逆轉人膀胱癌多藥耐藥。 Wang 等［32］研究發(fā)現白藜蘆醇通過降低MRP1、LRP 表達水平，增加Topo-Ⅱ表達水平，從而改善膀胱癌耐藥性。 本研究結果與上述研究結果一致，SEA 在體內與體外實驗均可下調MRP1 水平，體外實驗下調人膀胱癌細胞5637 LRP 蛋白水平，上調人膀胱癌細胞5637 Topo-Ⅱ蛋白水平，且與EPI 聯合應用效果優(yōu)于單獨使用EPI。 說明SEA 具有降低EPI 耐藥性的作用。

本文揭示了SEA 增加人膀胱癌5637 細胞對EPI 敏感性的作用：SEA 降低人輸尿管上皮永生化細胞SV-HUC-1 和人膀胱癌細胞5637 細胞活力，促進人膀胱癌細胞5637 細胞凋亡，降低人膀胱癌細胞5637 MRP1、LRP 蛋白水平，升高人膀胱癌細胞5637 Topo-Ⅱ蛋白水平，抑制體內移植瘤生長，降低體內移植瘤MRP1、PCNA 蛋白水平，升高體內移植瘤cleaved caspase-3 蛋白水平，且與EPI 聯合應用效果優(yōu)于單獨應用EPI。 本研究為治療膀胱癌提供了新的方法和思路，也為EPI 與SEA 的聯合應用提供了實驗基礎，但具體臨床效果還待進一步研究。