HPLC法測定鄧氏清毒飲中綠原酸的含量

黃明文，黃水華★，陸國壽

（1. 廣東博羅縣中醫(yī)院，廣東 博羅 516100 ；2. 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530020）

鄧氏清毒飲為博羅縣的新型冠狀病毒肺炎（新冠肺炎）疫情預防方。2020 年1 月25 日起，博羅縣衛(wèi)健局組織縣中醫(yī)醫(yī)院按照鄧氏清毒飲方煎制中藥預防湯劑，向一線醫(yī)護人員派發(fā)了5 9309 份中藥湯劑，并為從湖北返回博羅縣進行醫(yī)學監(jiān)測人群、部分工勤人員派發(fā)了免費的預防中藥湯劑。同時，將鄧氏清毒飲派發(fā)給有需要的市民，已累計面向社會派發(fā)了12萬份中藥湯劑。為了更好地將鄧氏清毒飲應用于新冠肺炎疫情防控中，我們綜合中醫(yī)處方解析、藥材化學物質基礎、藥材的相關藥理作用三方面來對鄧氏清毒飲用于新冠肺炎防控的可行性進行分析，并根據(jù)分析結果采用高效液相色譜法（HPLC）對鄧氏清毒飲中活性成分綠原酸進行了含量測定研究?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 高效液相色譜儀（2998 PDA Detector，Waters e2695 Separations Module，Empower 3 色譜工作站，美國Waters）；XS-205 天平（瑞士梅特勒）；JJ224BC 天平（常熟雙杰）；KS-3200DE 超聲儀（昆山潔力美）。

1.2 試藥

鄧氏清毒飲（自制，批號：DSQDY20201101、D S Q D Y 2 0 2 0 1 1 0 2 、 D S Q D Y 2 0 2 0 1 1 0 3 、DSQDY20201104、DSQDY20201105），綠 原 酸 對 照品（中國食品藥品鑒定研究院提供，批號：110753-202018，含量測定用）。甲醇等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5-Micron），流動相：乙腈-0.1% 磷酸（10:90），流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，波長：326 nm，進樣量：10μL。在上述色譜條件下，綠原酸與其他色譜峰分離度＞1.5，且陰性樣品無干擾。色譜圖詳見圖1。

圖1 對照品（A）、供試品（B）和陰性樣品（C）的高效液相色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

取綠原酸用50% 甲醇溶液制備得對照品儲備液（278.25 μg/mL）。

2.3 供試品溶液的制備

取鄧氏清毒飲5 mL，置于10 mL 量瓶中，加水稀釋，即得供試品溶液。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方除去金銀花、野菊花、蒲公英藥材，水煮制得陰性樣品適量，按“2.3”項下方法制成陰性樣品溶液。

2.5 線性關系考察

精密量取“2.2”項下的對照品溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、10.0 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋，精密吸取 10μL，進樣測定，以進樣質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積（A）為縱坐標（Y），進行線性回歸。結果顯示，綠原酸在13.91 ～278.25 μg/mL 范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=23745.2X-30573.8，r=0.9999。

2.6 精密度試驗

取綠原酸對照品溶液，連續(xù)進樣6 次測定，計算得出綠原酸峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.56%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品（批號：DSQDY20201101）溶液，在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h 依次進樣測定，計算得出綠原酸峰面積的RSD 為0.73%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

取同一批樣品（批號：DSQDY20201101）6 份，制備，測定，計算得出樣品中綠原酸的平均含量為109.16 μg/mL，RSD 為1.09%（n=6），表明該方法重復性較好。

2.9 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：DSQDY20201101）6份，各2.5mL，加入1mL 含綠原酸（278.25μg/mL）的對照品溶液，按“2.3”項下方法制備對照品溶液，測定并計算綠原酸的回收率，如表1 所示，綠原酸的平均回收率為100.03%，RSD 為1.23%。

表1 綠原酸加樣回收率試驗結果

2.10 含量測定

取不同批次的樣品5 mL，制備，測定，計算不同生產批次鄧氏清毒飲中綠原酸的含量，如表2 所示，5 個生產批次鄧氏清毒飲中綠原酸的平均含量為114.07 μg/mL。

表2 不同生產批次鄧氏清毒飲中綠原酸含量的測定結果（μg/mL）

3 討論

3.1 鄧氏清毒飲防控新冠肺炎的可行性分析

鄧氏清毒飲由金銀花、野菊花、桑葉、蒲公英、白茅根、葦莖、訶子、烏梅、黨參、五指毛桃、谷芽、甘草12 味中藥材組成。方中各味藥材中的化學成分及藥理活性如下：1）金銀花[1]中含有綠原酸、木犀草素、木犀草苷等成分，具有抗菌、解熱、抗炎、抗病毒、增強免疫力等藥理作用；2）野菊花[2-3]中含有月桂酸、反丁香烯、綠原酸等成分，具有抗菌、清除自由基、抗微生物等藥理作用；3）桑葉[4]中含有桑呋喃F1、yunanensin E、異槲皮苷等成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、清除自由基、抗衰老等藥理作用；4）蒲公英[5]中含有東莨菪內酯、傘形花內酯、綠原酸、蒲公英甾醇等成分，具有抗菌、抗病毒、提高免疫力等藥理作用；5）白茅根[6]中含有蘆竹素、白茅素、麥黃酮、白頭翁素、薏苡素等成分，具有利尿、抗菌、免疫調控、抗炎等藥理作用；6）葦莖[7]中含有咖啡酸、阿魏酸、禾草堿、蟾毒色胺等成分，具有免疫促進、解熱、抗菌等藥理作用；7）訶子[8]中含有Fragment1 ～8、單寧酸等成分，具有抑菌、提高免疫功能等藥理作用；8）烏梅[9]中含有檸檬酸、愈創(chuàng)木酚、叔丁基脲等成分，具有抗菌、鎮(zhèn)咳等藥理作用；9）黨參[10]中含有黨參堿、黨參炔苷、蒲公英萜醇、柯伊利素、苜蓿素、芹菜素、咖啡酸等成分，具有調節(jié)免疫系統(tǒng)、抗菌、抗病毒等藥理作用；10）五指毛桃[11]中含有補骨脂素、佛手柑內酯、柚皮素等成分，具有止咳、祛痰、平喘、提高免疫功能、抑菌等藥理作用；11）谷芽[12]中含有多糖類成分，具有清除超氧陰離子自由基、抗氧化等藥理作用；12）甘草[13]中含有甘草酸、甘草查爾酮甲、甘草苷等成分，具抗炎、抗病毒、解毒、鎮(zhèn)咳祛痰等藥理作用。

中國中西醫(yī)結合學會發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎中西醫(yī)結合防治專家共識》中認為新冠肺炎發(fā)病的中醫(yī)病因為感受“疫癘”之氣，病機特點為“濕、熱、瘀、毒、虛”。博羅縣位于南方濕瘴之地，故考慮鄧氏清毒飲中以金銀花為君藥，根據(jù)其“歸肺經(jīng)，功能清熱解毒，疏散風熱”等歸經(jīng)及功效特點，首從解決本“疫”病的“濕、熱、毒”病機入手。野菊花可“清熱解毒，瀉火平肝”、桑葉可“疏散風熱，清肺潤燥”、蒲公英可“清熱解毒”、白茅根可“涼血止血，清熱利尿”，此四味藥味為臣藥，共助金銀花解決“濕、熱、毒”病機。蒲公英可“消腫散結”，兼顧解決本“疫”病的“瘀”病機。葦莖、訶子、烏梅皆歸肺經(jīng)，其中功效分別為葦莖可“清肺解毒，止咳排膿”、訶子可“斂肺止咳”、烏梅可“斂肺”，三者為佐藥，共達“清肺斂肺，止咳排膿”之功效。黨參歸脾、肺經(jīng)，功效“健脾益肺，養(yǎng)血生津”；五指毛桃歸脾、肺、胃經(jīng)，功效“健脾益氣，行氣利濕”；谷芽歸脾、胃經(jīng)，功效“消食和中，健脾開胃”，三者為使藥，考慮以其歸脾、肺經(jīng)，功能健脾益肺、益氣和中，此歸經(jīng)及功效特點，能解決本“疫”病病機中的“虛”癥。甘草具有“清熱解毒，祛痰止咳，調和諸藥”之功效，在協(xié)助各藥味解決“熱、瘀”病機的同時，亦起到緩解藥物毒性、烈性的作用。綜上所述，本方具有解毒御邪、清肺潤燥、顧護元氣的功效。

從傳統(tǒng)中醫(yī)角度來解析，鄧氏清毒飲主要從清熱解毒、斂肺止咳、健脾益肺等角度來解決新冠肺炎這一中醫(yī)范疇的“疫”病，解決其“濕、熱、瘀、毒、虛”等病機。從藥理學角度分析，本方的藥效主要與抗病毒、抗菌、鎮(zhèn)咳祛痰、免疫調節(jié)、抗氧化五個方面的藥理作用有關。值得關注的是，處方的部分中醫(yī)功效能較好地采用現(xiàn)代藥理機制來解釋，如清熱解毒的功效可以用抗病毒、抗菌等藥理作用來解釋，斂肺止咳的功效可以用鎮(zhèn)咳祛痰的藥理作用來解釋，顧護元氣的功效可以用免疫調節(jié)等藥理作用來解釋。從藥味中活性成分的角度來分析，方中部分藥味的活性成分亦能在一定程度上對本方的功效進行解釋，如金銀花中的綠原酸具有抗病毒、抗菌的作用，黨參中的多糖成分具有免疫調節(jié)的作用。

3.2 含量測定指標成分的選擇及實驗條件摸索

查閱文獻[1-3]，金銀花、野菊花、蒲公英中均含有綠原酸成分。綠原酸具有較好的抗病毒作用[14-15]，是本方的主要藥物活性成分之一，故選擇其作為含量測定的指標成分具有較好的質量監(jiān)控作用。依據(jù)文獻方法[5-8]，本實驗比較了乙腈-甲酸水、乙腈-磷酸水、甲醇- 磷酸水等不同流動相在鄧氏清毒飲中活性成分綠原酸含量測定中的價值，結果表明，以乙腈-0.1%磷酸水為流動相，綠原酸的分離效果較好，干擾成分少，分離度達到要求。本研究采用PDA 檢測器，在200 ～400 nm 范圍內對綠原酸進行全波長掃描，其在326 nm 處有最大吸收，故選擇波長為326 nm。

本研究通過開展相應含量測定等質量監(jiān)控工作，可更好地保證鄧氏清毒飲質量的穩(wěn)定性，使其能更好地在新冠肺炎防控工作中發(fā)揮作用。