豆粕添加和發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜象草青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與細(xì)菌多樣性的影響

何 秀，徐美余，辛維崗，張棋麟，王 峰，林連兵，*

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500； 2.云南省高校飼用抗生素替代技術(shù)工程研究中心，云南 昆明 650500)

青貯飼料是通過(guò)在細(xì)碎的青綠植物中添加益生菌進(jìn)行密封發(fā)酵得到的一種能長(zhǎng)期保存的飼料。青貯發(fā)酵不僅能延長(zhǎng)飼料的保存時(shí)間，還避免了秸稈焚燒帶來(lái)的環(huán)境污染，青貯后的飼料具有適口性好和營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)。隨著我國(guó)畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，青貯原料也逐漸多樣化。近年來(lái)，青貯飼料的研究主要集中于青貯的原料、添加劑、微生物發(fā)酵和防腐措施等方面。甜象草()是近年來(lái)普遍流行使用的飼用牧草，具有低成本高收益的優(yōu)勢(shì)，不僅糖分含量高，其汁液也鮮嫩可口。研究表明，用甜象草與豬飼料混合飼喂可使土肥豬肉質(zhì)風(fēng)味得到改善。賴大偉等、王玉麒等研究表明，甜象草能促進(jìn)肉牛的增重，提高奶牛的泌乳量，是飼喂的最佳粗飼料。因此，在養(yǎng)殖畜牧業(yè)的發(fā)展中甜象草作為優(yōu)質(zhì)飼用牧草具有廣闊的應(yīng)用前景。

因甜象草所攜帶的乳酸菌等有益菌群在發(fā)酵初期不占據(jù)優(yōu)勢(shì)，可能導(dǎo)致飼料腐敗變質(zhì)，加劇營(yíng)養(yǎng)成分的流失。復(fù)合乳酸菌菌劑的添加可增加乳酸菌數(shù)量，促進(jìn)乳酸發(fā)酵，降低飼料中的pH值，抑制有害菌群的增長(zhǎng)，提高飼料的安全性。乳酸菌的添加能提高青貯料的乳酸含量和消化率，保證青貯料的發(fā)酵品質(zhì)。復(fù)合菌劑的添加不僅可以改善青貯品質(zhì)，還能縮短青貯發(fā)酵周期，降低養(yǎng)殖成本。除此之外，甜象草收割后含水量較高，碳水化合物含量少，不宜單獨(dú)青貯，一般通過(guò)添加碾碎的谷物來(lái)改善飼料營(yíng)養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)，豆粕的蛋白質(zhì)和氨基酸含量較高，是青貯飼料的常用輔料。因此，本研究以豆粕為氮源補(bǔ)充原料，以期提高青貯發(fā)酵品質(zhì)，從而獲得高質(zhì)量畜禽食品。

青貯飼料的品質(zhì)由青貯過(guò)程中微生物菌群的演繹變化和最終的發(fā)酵產(chǎn)物共同決定。目前，有關(guān)甜象草青貯發(fā)酵飼料的研究較少，主要集中在甜象草的飼喂效果和與其他秸稈原料混合青貯后的發(fā)酵品質(zhì)等方面，關(guān)于豆粕的添加和發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜象草青貯的相關(guān)研究尚未有報(bào)道。因此，本研究主要以甜象草為主要原料，在復(fù)合菌劑和玉米粉的基礎(chǔ)上添加豆粕，以探究豆粕的添加與發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜象草青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)和細(xì)菌多樣性的影響，以期為畜牧養(yǎng)殖業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的甜象草青貯飼料，促進(jìn)無(wú)抗養(yǎng)殖更好發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

玉米粉和豆粕購(gòu)買(mǎi)于云南昆明某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。所用復(fù)合菌劑由唾液乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、香腸乳桿菌、福萊乳桿菌組成(每種乳酸菌的活菌數(shù)均控制在1×10CFU·mL，噴霧干燥后按1∶1∶1∶1∶1配比備用)，菌種均分離于昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院噬菌體與腸道微生物課題組提供的植物酵素。甜象草由云南省飼用抗生素替代工程研究中心種植基地種植并提供，9月份收割時(shí)原料的含水量約80%。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)以甜象草為發(fā)酵原料，參照高曉梅等研究中的組方二，并在此基礎(chǔ)上略有改動(dòng)。兩組飼料配方均以100 kg為總量且以80 kg發(fā)酵原料(甜象草68 kg、玉米粉10 kg、復(fù)合菌粉2 kg)為基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上HSL飼料添加20 kg豆粕作為試驗(yàn)組，LSL飼料添加20 kg甜象草作為對(duì)照組。甜象草收割后晾曬1 d，將菌粉溶解后噴灑在原料上，充分混勻后分裝入青貯袋中，壓實(shí)后用封口機(jī)密封，每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，于室溫(約22 ℃)發(fā)酵60 d。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 感官評(píng)定

每10 d采集飼料樣品進(jìn)行感官評(píng)定，參照德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)頒布的青貯飼料感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2 水分含量與pH值測(cè)定

每10 d采集飼料樣品。稱取10 g放入水分含量測(cè)定儀中進(jìn)行水分含量的測(cè)定。另取10 g青貯飼料于200 mL廣口三角錐形瓶中，加入90 mL水，于4 ℃冰箱浸泡24 h；用4層紗布過(guò)濾后，測(cè)定pH值。

1.3.3 養(yǎng)分含量測(cè)定

在10、30、60 d采集飼料樣品。通過(guò)馬弗爐-干法灰化法測(cè)定粗灰分(Ash)；苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定氨態(tài)氮(ammonia nitrogen，AN)；凱氏法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量(crude protein，CP)和總氮含量(total nitrogen，TN)；范氏洗滌纖維法測(cè)定中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量。

1.3.4 有機(jī)酸含量的測(cè)定

處理方法參照文獻(xiàn)[21]，具體如下：在10、30、60 d取10 g青貯飼料于200 mL廣口三角錐形瓶中，加90 mL水，4 ℃冰箱中浸泡24 h，期間搖晃4次以上，取80 mL抽濾的液體，濃縮至20 mL后，置于150 mL碘量瓶中，加入50 mL 12.5%硫酸甲醇溶液，混勻后置入30 ℃，150 r·min恒溫?fù)u床中酯化24 h，在3 000×離心5 min。取上清液150 mL，用20 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液；加入20 mL飽和氯化鈉溶液洗滌3次，加入10 g無(wú)水硫酸鈉靜置過(guò)夜。濾出硫酸鈉，用GC-MS儀器測(cè)定有機(jī)酸含量。

1.4 微生物多樣性分析

1.4.1 DNA的提取與PCR擴(kuò)增

在10、30、60 d取青貯飼料樣品10 g，浸泡在90 mL 0.85% NaCI溶液中，150 r·min振蕩2 h后，用4層紗布過(guò)濾，5 000×轉(zhuǎn)速下離心20 min，收集菌體沉淀，存放于-20 ℃冰箱，用E.Z.N.A.soil DNA kit試劑盒提取青貯飼料中細(xì)菌的總DNA。用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mmol·LdNTPs 2μL，上下游引物各0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，補(bǔ)足至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)。

1.4.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建庫(kù)，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺(tái)測(cè)序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。用fastp軟件質(zhì)控后，用FLASH軟件拼接；在UPARSE軟件中，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行operational taxonomic unit (OTU)聚類。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS(IBM SPSS 26)軟件對(duì)LSL飼料和HSL飼料同一指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)同一種飼料不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。微生物相對(duì)豐度和物種組成分析采用UPARSE軟件在美吉生物平臺(tái)進(jìn)行。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 青貯飼料品質(zhì)

2.1.1 感官評(píng)價(jià)

兩組青貯飼料感官評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。HSL飼料隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，芳香酸味逐漸濃郁，質(zhì)地愈加松軟，色澤偏黃，無(wú)腐敗現(xiàn)象，發(fā)酵60 d時(shí)色澤為黃色且具有面包酸香味，飼料品質(zhì)為優(yōu)等(22分)；發(fā)酵10 d時(shí)LSL飼料的色澤為青綠色，與原料接近，發(fā)酵60 d時(shí)為黃綠色，質(zhì)地松散，芳香酸香味濃郁，發(fā)酵品質(zhì)優(yōu)等(20分)。兩組飼料發(fā)酵30 d時(shí)感官評(píng)價(jià)的等級(jí)均達(dá)到優(yōu)良，LSL飼料的總體評(píng)價(jià)稍低于HSL飼料。

表1 飼料的感官評(píng)價(jià)

圖1 飼料發(fā)酵圖Fig.1 Fermentation of feeds

2.1.2 水分含量變化

發(fā)酵期間，青貯飼料的含水量和pH值隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，其中含水量在發(fā)酵30 d后逐漸穩(wěn)定(圖2)。HSL飼料發(fā)酵10 d含水量便從65.19%下降至59.30%，后緩慢下降為57.20%，pH值從5.30逐漸下降至4.08；LSL飼料的含水量在發(fā)酵10 d內(nèi)下降了10.00%，最終下降至57.88%，pH值從5.20下降至4.14。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中LSL飼料的含水量和pH值均略高于HSL飼料。

圖2 飼料發(fā)酵過(guò)程中含水量和pH值的變化趨勢(shì)Fig.2 Trends of water content and pH value during feed fermentation

2.1.3 養(yǎng)分含量

由表2可知，發(fā)酵過(guò)程中HSL飼料中粗蛋白質(zhì)含量始終高于LSL飼料，發(fā)酵30 d后粗蛋白質(zhì)含量均顯著(<0.05)降低，HSL飼料中的NDF和ADF含量低于LSL飼料，兩種纖維含量在兩組飼料中隨發(fā)酵時(shí)間增加而顯著下降(<0.05)；粗灰分含量在兩組飼料之間無(wú)顯著差異。兩組飼料隨發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)AN/TN越高，但比值均低于10%，發(fā)酵期間HSL飼料中的AN/TN顯著低于LSL飼料(<0.05)。

表2 發(fā)酵期間5種養(yǎng)分含量變化趨勢(shì)

2.1.4 有機(jī)酸含量

由表3可以看出，發(fā)酵10 d飼料中已產(chǎn)生有較多的乳酸和少量乙酸，發(fā)酵期間乳酸和乙酸迅速增加后趨于穩(wěn)定，最終乳酸在HSL飼料中含量較高，乙酸在LSL中的含量較高。兩組飼料在發(fā)酵30 d后均檢測(cè)到少量丙酸，含量相差不多。發(fā)酵至30 d前無(wú)丁酸的存在，而60 d時(shí)在兩組飼料中都檢測(cè)到少量的丁酸。

表3 青貯期間有機(jī)酸含量的變化

2.2 細(xì)菌多樣性

2.2.1 飼料中細(xì)菌多樣性指數(shù)分析

如圖3所示，飼料青貯過(guò)程中，隨著樣品序列數(shù)的增加，檢測(cè)到的OTU數(shù)量的增加量逐漸減小，Shannon稀釋曲線逐漸趨于平坦，其覆蓋度均達(dá)到99%以上(表4)，測(cè)序數(shù)據(jù)合理，其深度基本全面覆蓋樣品中絕大多數(shù)的微生物信息。

圖3 飼料樣品菌群稀釋曲線Fig.3 Flora dilution curve of feed samples

Chao和Ace指數(shù)反映群落相對(duì)豐度，值越高群落物種豐富度越高。基于Alpha多樣性分析(表4)，物種豐度在發(fā)酵過(guò)程中具有先下降后升高的趨勢(shì)，HSL飼料的Chao和Ace指數(shù)在3個(gè)時(shí)間段無(wú)顯著差異(>0.05)。而LSL飼料的Chao和Ace指數(shù)在發(fā)酵10 d時(shí)最大，發(fā)酵至30 d時(shí)顯著減小(<0.05)。兩組飼料的Chao和Ace指數(shù)均在發(fā)酵10 d時(shí)有顯著(>0.05)差異。LSL飼料的Chao指數(shù)只在發(fā)酵30 d時(shí)低于HSL，在其他相同發(fā)酵時(shí)間下LSL的Chao和Ace指數(shù)都高于HSL。

表4 兩組飼料不同發(fā)酵時(shí)間的Alpha多樣性分析

Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)綜合反映群落中物種種類和物種均勻程度，飼料菌群的Shannon指數(shù)先降低后升高，Simpson指數(shù)逐漸降低。發(fā)酵不同時(shí)間，Shannon指數(shù)在LSL飼料中均有顯著差異(<0.05)，在HSL飼料中無(wú)顯著差異(>0.05)；兩組飼料的Shannon和Simpson指數(shù)均在發(fā)酵10 d時(shí)有顯著差異(<0.05)，10 d后有所降低。青貯發(fā)酵過(guò)程中物種多樣性下降，且相同發(fā)酵時(shí)間LSL飼料的物種多樣性高于HSL飼料，LSL飼料的物種均勻程度低于HSL飼料。發(fā)酵30 d，Alpha多樣性指數(shù)在兩組飼料中無(wú)顯著差異(>0.05)。

2.2.2 飼料中菌群相似性

根據(jù)距離判斷樣品間的相似度，距離越近，樣品間的物種組成相似度越高。由圖4可知，HSL和LSL兩組飼料整體看來(lái)，在10 d時(shí)細(xì)菌菌群各自聚集且距離較遠(yuǎn)，群落構(gòu)成存在一定的差異性，且樣品重復(fù)性好，群落構(gòu)成存在一致性(圖4-A)。兩組飼料單獨(dú)分析時(shí)，在3個(gè)時(shí)間段之間均存在一定差異，HSL飼料在青貯發(fā)酵30 d和60 d的菌群距離較近，具有一定的相似度(圖4-B)，而LSL飼料在3個(gè)時(shí)間段距離較遠(yuǎn)，差異性較大(圖4-C)。當(dāng)兩組飼料單獨(dú)從10、30、60 d比較時(shí)，除30 d時(shí)距離較近外，其他兩時(shí)間點(diǎn)距離較遠(yuǎn)(圖4-D、4-E、4-F)。

A，兩組飼料在發(fā)酵10、30、60 d的PcoA圖；B，HSL飼料發(fā)酵10、30、60 d的PcoA圖；C，LSL飼料發(fā)酵10、30、60 d的PcoA圖；D，2組飼料在發(fā)酵10 d時(shí)的PcoA圖；E，2組飼料在發(fā)酵30 d時(shí)的PcoA圖；F，2組飼料在發(fā)酵60 d的PcoA圖。A， PCoA diagram of two groups of feed fermented for 10 days， 30 days and 60 days； B， PCoA diagram of HSL feed fermentation for 10 days， 30 days and 60 days； C， PCoA diagram of LSL feed fermentation for 10， 30 and 60 days； D， PCoA diagram of two groups of feed at 10 days of fermentation； E， PCoA diagram of two groups of feed at 30 days of fermentation； F， PCoA diagram of two groups of feed at 60 days of fermentation.圖4 兩組飼料的聚類圖Fig.4 PcoA on OTU level diagram of two feed groups

2.2.3 門(mén)水平上細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

兩組飼料基于門(mén)水平的微生物菌群結(jié)構(gòu)和豐度比值如圖5所示。兩組飼料在發(fā)酵期間，均以厚壁菌門(mén)(Firmicutes)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，變形菌門(mén)(Proteobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteriota)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)和綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)少量存在。發(fā)酵10 d，HSL飼料中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度(87.86%)高于LSL飼料(70.05%)，HSL飼料變形菌門(mén)的相對(duì)豐度(8.583%)低于LSL飼料(17.28%)，HSL飼料中放線菌門(mén)相對(duì)豐度(2.78%)低于LSL飼料(7.99%)。兩組飼料的厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度在30 d均達(dá)到最高，LSL飼料(93.94%)略高于HSL飼料(94.90%)，變形菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度最低，其中，HSL飼料的變形菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度(4.656%、0.85%)高于LSL飼料(4.04%、0.71%)。發(fā)酵60 d，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度略有降低，其他門(mén)類均略有升高且低于發(fā)酵10 d的相對(duì)豐度。兩組飼料各自在青貯發(fā)酵的30～60 d，各門(mén)水平上的物種差異不顯著(>0.05)。

圖5 門(mén)分類水平的細(xì)菌群落組成Fig.5 Composition of bacterial community at the phylum level

2.2.4 屬水平上細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)分析

兩組飼料基于屬水平微生物菌群結(jié)構(gòu)如圖6所示。相對(duì)豐度大于1%的屬有8個(gè)，分別是乳桿菌屬()、片球菌屬()、魏斯氏屬()、腸桿菌屬()、鏈霉菌屬()、乳球菌屬()、微桿菌屬()、纖維菌屬()。兩組飼料在發(fā)酵10 d的優(yōu)勢(shì)菌為片球菌屬，且在HSL中的相對(duì)豐度(49.99%)較LSL飼料(28.12%)高，腸桿菌屬的相對(duì)豐度在HSL飼料中為6.04%，在LSL飼料中為10.44%。發(fā)酵第30天乳酸菌屬占據(jù)主導(dǎo)地位，在HSL和LSL飼料中的相對(duì)豐度分別為88.20%和88.96%，腸桿菌屬相對(duì)豐度均降低至3.35%和2.95%。發(fā)酵60 d，兩組飼料中乳桿菌屬相對(duì)豐度略有降低，其他屬類相對(duì)豐度均略有增加；其中LSL飼料中乳桿菌屬的相對(duì)豐度顯著降低至77.25%，腸桿菌屬相對(duì)豐度增加至4.76%。兩組飼料各自在發(fā)酵的30～60 d，物種間差異均不顯著(>0.05)，與門(mén)水平結(jié)果相同。

圖6 基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)分析Fig.6 Composition of bacterial community at the genus level

3 討論

3.1 豆粕添加和發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜象草青貯感官評(píng)價(jià)的影響

青貯飼料品質(zhì)評(píng)定最直接快速的方法是考察飼料的顏色、質(zhì)地和氣味等。本試驗(yàn)中的HSL和LSL飼料發(fā)酵30 d感官評(píng)價(jià)等級(jí)已達(dá)到優(yōu)良，發(fā)酵60 d均處于優(yōu)等，其中，HSL飼料在色澤和氣味上略優(yōu)于LSL飼料，表明兩組飼料在發(fā)酵30 d后就可供使用，而豆粕的添加可為青貯發(fā)酵飼料的表觀品質(zhì)增色。含水量是飼料青貯成敗的關(guān)鍵，青貯飼料含水量在65.00%～70.00%最佳。兩組飼料在發(fā)酵前含水量均約為65.00%，為飼料的青貯提供了有利的條件。含水量在發(fā)酵60 d后均下降至約57.00%，其中前10 d下降明顯，30 d后趨于平穩(wěn)，這可能是乳酸菌的快速增殖消耗了水分。而含水量的降低使細(xì)胞中糖分濃縮，更有利于乳酸的發(fā)酵，提高飼料品質(zhì)。除含水量外，pH值是衡量青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的另一指標(biāo)，優(yōu)質(zhì)飼料的pH值應(yīng)在4.20以下。本試驗(yàn)的兩組飼料發(fā)酵60 d時(shí)pH值下降至4.20以下，而玉米青貯的pH值在第2 d下降到4.00以下，筍殼與稻殼混合發(fā)酵至45 d時(shí)pH值下降到4.2以下，表明飼料青貯過(guò)程中pH值的變化可能與牧草本身的性質(zhì)有關(guān)。發(fā)酵60 d，LSL飼料的pH值略低于HSL飼料，表明添加豆粕可能會(huì)促進(jìn)乳酸菌發(fā)酵，降低飼料中的pH值，這與感官評(píng)價(jià)的結(jié)果相一致。

3.2 豆粕添加和發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜象草青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)是決定青貯飼料價(jià)值的關(guān)鍵因子之一，其中粗蛋白質(zhì)、AN/TN、ADF、NDF和灰分含量是營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要組成部分。粗蛋白質(zhì)含量與飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)呈正比；AN/TN低于10.00%則為優(yōu)質(zhì)飼料；NDF和ADF含量越低飼料消化率越高，灰分含量與有機(jī)物含量損失的程度呈正比。試驗(yàn)中，發(fā)酵60 d時(shí)LSL飼料中的AN/TN含量高于HSL飼料和，表明添加豆粕可顯著降低AN/TN，提高飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。發(fā)酵期間HSL飼料的NDF、ADF和粗灰分含量低于LSL飼料，說(shuō)明添加豆粕不僅有利于可被吸收的營(yíng)養(yǎng)成分保存，還能減緩有機(jī)物含量的損失。飼料中幾組營(yíng)養(yǎng)成分發(fā)酵30 d含量均顯著增加，發(fā)酵至60 d便略有降低，表明兩組飼料發(fā)酵30 d最佳。此外，有機(jī)酸也是青貯飼料品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中，乳酸能有效提高飼料品質(zhì)。兩組飼料中的乳酸含量在發(fā)酵60 d內(nèi)均先增加后略下降，說(shuō)明乳酸菌在發(fā)酵期間逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵到一定程度時(shí)，乳酸開(kāi)始分解為乙酸、丙酸等有機(jī)酸，導(dǎo)致乳酸含量增加緩慢。發(fā)酵30 d時(shí)丙酸出現(xiàn)，無(wú)丁酸存在，表明丙酸桿菌在發(fā)酵30 d活動(dòng)較強(qiáng)烈，將部分乳酸分解為丙酸；而在60 d均檢測(cè)到少量的丁酸，這可能是取樣時(shí)空氣進(jìn)入導(dǎo)致羧酸菌的生長(zhǎng)，由此說(shuō)明厭氧是青貯的重要條件，也證明了本試驗(yàn)中兩組飼料在發(fā)酵30 d品質(zhì)最佳，與營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定結(jié)果相一致。然而，雖然丁酸在青貯飼料中被認(rèn)為是飼料腐敗的標(biāo)志，但研究表明，丁酸能增強(qiáng)食物風(fēng)味，因此，丁酸在飼料中存在的標(biāo)準(zhǔn)還有待進(jìn)一步研究證明。

3.3 豆粕添加和發(fā)酵時(shí)間對(duì)甜象草青貯細(xì)菌多樣性的影響

青貯飼料是一個(gè)多種微生物共同參與的復(fù)雜體系，微生物的群落結(jié)構(gòu)也影響著飼料品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分。從樣品稀釋曲線可以看出，樣本測(cè)序量飽和，覆蓋了樣本中絕大多數(shù)細(xì)菌物種信息。Alpha多樣性指數(shù)表明，豆粕的添加影響了微生物的群落結(jié)構(gòu)，能減少飼料中微生物群落結(jié)構(gòu)差異。聚類分析結(jié)果表明，兩組飼料發(fā)酵期間存在一定差異，但總體上發(fā)酵30 d后兩組飼料的物種組成相似度較高，可能是因?yàn)閺?fù)合菌劑促進(jìn)了優(yōu)勢(shì)菌乳酸菌的生長(zhǎng)，使飼料中細(xì)菌物種相似度趨于統(tǒng)一化。兩組飼料在發(fā)酵時(shí)期以厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這與大麥和苜蓿青貯時(shí)的菌群研究結(jié)果一致，厚壁菌門(mén)中大多細(xì)菌可降解纖維素、蛋白質(zhì)等大分子化合物，而變形菌門(mén)包含多種病原菌。發(fā)酵10 d時(shí)HSL和LSL飼料的厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度分別為87.86%和70.05%，表明厚壁菌門(mén)在發(fā)酵10 d時(shí)已占據(jù)優(yōu)勢(shì)，而豆粕的添加能提高厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度，減少變形菌門(mén)(Proteobacteria)在飼料中的相對(duì)豐度，降低有害微生物的數(shù)量。發(fā)酵30 d厚壁菌門(mén)和乳酸菌屬的相對(duì)豐度達(dá)到最高，變形菌門(mén)和腸桿菌屬相對(duì)豐度最低，表明兩組飼料的最佳青貯發(fā)酵時(shí)間為30 d，與營(yíng)養(yǎng)成分和有機(jī)酸含量的結(jié)果一致。乳酸菌的增殖與變化情況在一定程度上決定著青貯飼料的品質(zhì)，乳桿菌屬()在兩組飼料發(fā)酵至60 d略有降低，其他菌屬略有升高，這可能是由于取樣過(guò)程中飼料與空氣接觸從而抑制了乳桿菌的生長(zhǎng)，反之促進(jìn)了其他好氧菌的生長(zhǎng)。在發(fā)酵的30～60 d，HSL飼料中的厚壁菌門(mén)和乳酸菌屬降低的相對(duì)豐度值明顯小于LSL飼料，變形菌門(mén)和腸桿菌屬增加的相對(duì)豐度值小于LSL飼料，表明豆粕添加能在長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵過(guò)程中保證乳酸菌屬的數(shù)量，從而減少其他病原菌在飼料中的占比。

4 結(jié)論

添加20%豆粕可提高甜象草青貯飼料的蛋白質(zhì)含量，降低pH值和氨態(tài)氮比值，提高厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度，降低變形菌門(mén)相對(duì)豐度，有效改善青貯品質(zhì)。隨甜象草發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，含水量有所降低，養(yǎng)分損失增加；但pH值降低，乳桿菌屬相對(duì)豐度提高，變形菌門(mén)和腸桿菌屬相對(duì)豐度降低，改善了青貯品質(zhì)。發(fā)酵30 d甜象草青貯品質(zhì)最優(yōu)。