茶葉抗菌肽粗提物的抑菌活性及其對冷卻肉保鮮的影響

王麗芳，葉 良，謝忠穩(wěn)，黨向利，*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 園藝學(xué)院；b. 植物保護(hù)學(xué)院；c. 茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036)

隨著抗生素和化學(xué)防腐劑被過度依賴和廣泛使用，菌株耐藥性、環(huán)境安全和食品安全等問題不斷加重，尋找新的抗菌資源已成為研究焦點(diǎn)。為了應(yīng)對以上問題，研究人員利用各種技術(shù)對植物、動物和微生物進(jìn)行新型抗菌藥物研發(fā)?？咕?antimicrobial peptides，AMPs)是一類潛力巨大的新型抗菌藥物和食品防腐保鮮劑，它是一類小分子肽類生物活性物質(zhì)，對細(xì)菌、真菌、病毒和原蟲等具有抑殺效果，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，在天然防御系統(tǒng)中起重要作用。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽具有廣譜抗菌、高效性和快速殺菌等優(yōu)點(diǎn)，對正常的哺乳動物細(xì)胞無毒性，極少誘發(fā)抗性產(chǎn)生，多數(shù)抗菌肽的水溶性較好，熱穩(wěn)定性好，對較大離子強(qiáng)度、較低或較高pH值都有較強(qiáng)的耐受性。

目前有3種途徑獲取抗菌肽：分離純化、化學(xué)合成和生物工程(重組技術(shù))。生物工程存在不能正確轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致蛋白質(zhì)折疊不準(zhǔn)確等問題，化學(xué)合成則受到合成起始點(diǎn)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)的限制；而從植物、動物和微生物中提取的抗菌肽具有來源豐富、產(chǎn)物天然等優(yōu)點(diǎn)，倍受科研工作者的青睞。植物可以在含有較多病原物的多種環(huán)境中存活，除了依靠細(xì)胞壁的物理性防御、啟動過敏防御反應(yīng)這兩種防御機(jī)制外，還依賴植物抗菌肽。植物抗菌肽是非特異性寄主防御系統(tǒng)的組成部分，對多種微生物都有抑制或殺傷作用。

茶葉從最初的藥用到如今作為飲料，已經(jīng)被人類利用了上千年。流行病學(xué)調(diào)查和現(xiàn)代藥理學(xué)研究均表明，飲茶對人體健康具有積極作用，茶葉在抗衰老、抗氧化、抗血脂、抗菌、抗過敏、抗輻射等方面具有重要作用。茶葉的抗氧化和抑菌活性在食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)上有著重要前景。冷卻肉由于其營養(yǎng)價值高、衛(wèi)生、新鮮等優(yōu)點(diǎn)逐漸被消費(fèi)者所青睞。冷卻肉保鮮劑可分為化學(xué)保鮮劑和天然保鮮劑兩大類?；瘜W(xué)保鮮劑具有較好的防腐保鮮效果，但長期攝入會危害人體健康；天然保鮮劑由于其來源豐富、安全高效、抑菌譜廣等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為冷卻肉保鮮劑研究開發(fā)的熱點(diǎn)。

國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)從植物中發(fā)現(xiàn)了許多具有新穎結(jié)構(gòu)的抑菌活性物質(zhì)，比如皂苷、生物堿類、芳香類、甾體類、酚類和酚酸類等。從植物中分離純化的植物抗菌肽也有研究，但未見從茶葉中分離、提取抗菌肽及其應(yīng)用的報道。本研究以龍井茶葉為材料，提取茶葉抗菌肽粗提物，對茶葉抗菌肽粗提物的抑菌活性進(jìn)行檢測，對其作用機(jī)制進(jìn)行分析。并將茶葉抗菌肽粗提物應(yīng)用于冷卻肉的防腐保鮮，以期為冷卻肉等食品保鮮提供一種新的保鮮途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

龍井茶葉為市售。乳酸鏈球菌素(Nisin)，洛陽奇泓生物有限公司。磷鉬酸測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。新鮮冷卻肉購于沃爾瑪超市(合肥)。所有試劑如無特殊說明，均采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

金黃色葡萄球菌()和大腸埃希菌()購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，使用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g·L、酵母粉5 g·L、NaCl 10 g·L)在37 ℃培養(yǎng)。

蛋白提取液：0.7 mol·L蔗糖、0.1 mol·LNaCl、0.5 mol·LTris-HCl (pH值7.5)、50 mmol·LEDTA-2Na、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%苯甲基磺酰氟。

1.2 茶葉抗菌肽粗提物提取

利用Tris-丙酮-酚植物蛋白提取、熱處理和超濾處理方法提取茶葉抗菌肽粗提物，具體方法如下。

(1)稱取龍井茶茶葉10 g，加入40 mL蛋白提取液，勻漿研磨；(2)補(bǔ)充蛋白提取液至100 mL，加入100 mL Tris平衡酚飽和溶液(pH值8.0)，4 ℃混合30 min；(3)4 ℃ 5 000×離心30 min，收集上清，加入5倍體積預(yù)冷0.1 mol·L醋酸銨-甲醇溶液，-20 ℃過夜沉淀茶葉中的蛋白質(zhì)；(4)4 ℃ 12 000×離心10 min，收集沉淀，加入5倍體積預(yù)冷甲醇清洗；混合后在4 ℃ 12 000×離心10 min，收集沉淀，重復(fù)1次；以丙酮代替甲醇重復(fù)上述步驟2遍；4 ℃ 12 000×離心10 min，收集沉淀；(5)沉淀冷凍干燥后溶解于100 mL無菌水中，95 ℃水浴加熱5 min，然后在室溫12 000×離心10 min，取上清；(6)將上清轉(zhuǎn)移至10 ku超濾離心管，4 ℃，12 000×離心15 min，收集濾過液。濾過液轉(zhuǎn)移到3 ku超濾離心管中，同樣條件離心15 min，收集濾過液，濾過液即為提取茶葉抗菌肽粗提物(tea AMP extraction，TAE)。

1.3 茶葉抗菌肽粗提物電泳檢測

利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)檢測提取的茶葉抗菌肽成分。將8 μL樣本與2 μL上樣緩沖液混合后95 ℃水浴加熱5 min，按順序點(diǎn)在點(diǎn)樣孔中。濃縮膠(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)電泳電壓80 V，待電泳到分離膠(質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%)后將電壓調(diào)至120 V直至跑至膠底部。電泳結(jié)束后將凝膠加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%考馬斯亮藍(lán)染色液中，待條帶清晰后倒出染色液，加入脫色液，振蕩過夜脫色并拍照。

1.4 茶葉抗菌肽粗提物濃度測定

用二喹啉甲酸(BCA)法檢測茶葉抗菌肽粗提物濃度。利用無菌水配制不同濃度牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)液(0、0.025、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg·mL)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取100 μL茶葉抗菌肽粗提物，加入2 mL BCA工作液(100 mL 1% BCA-2Na，2 mL 4% CuSO)，37 ℃孵育30 min，檢測其在562 nm的吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品蛋白質(zhì)濃度。

1.5 茶葉抗菌肽粗提物氨基酸含量測定

向水解管中加入100 μL茶葉抗菌肽粗提物與1 mL 6 mol·LHCl，充滿氮?dú)獠⒎夤?，置?05 ℃烘箱中水解22 h。用娃哈哈純凈水將水解后的樣品定容至5 mL，取2 mL于60 ℃真空干燥箱中干燥。加入1 mL HCl(0.02 mol·L)復(fù)溶，用0.22 μm的水膜過濾器過濾后，取20 μL參照Lu等的方法利用日立L-8900高速氨基酸分析儀測定氨基酸含量。

1.6 茶葉抗菌肽粗提物抗菌活性測定

通過平板抑菌圈法測定茶葉抗菌肽粗提物對細(xì)菌的抑菌活性。將對數(shù)生長期金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌稀釋成為0.3的菌懸液。取無菌LB固體培養(yǎng)基20 mL冷卻至50 ℃，加入30 μL為0.3的菌懸液，搖勻后倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)基凝固后在平板上打孔(4 mm)，每孔加入100 μL茶葉抗菌肽(100 μg·mL)。待樣品完全擴(kuò)散到平板后37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑，重復(fù)3次。陽性對照為同等濃度的乳酸鏈球菌肽(Nisin)，陰性對照為無菌水。

1.7 茶葉抗菌肽粗提物對細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率的影響

選用金黃色葡萄球菌檢測茶葉抗菌肽粗提物對細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率的影響。膜滲透率的測定根據(jù)Dang等的方法進(jìn)行。用10 mmol·L磷酸鹽緩沖液(PBS)將對數(shù)生長期細(xì)菌稀釋至終濃度為10CFU·mL的菌懸液。分別用終濃度為100 μg·mL的抗菌肽粗提物和Nisin處理菌懸液，37 ℃分別培養(yǎng)0、0.5、1、2、4、8 h。陰性對照(CK)為PBS，陽性對照為2 mg·mL的Triton X-100。用0.22 μm水系針筒過濾器過濾菌液，收集濾液。測量濾液在260 nm的吸光度，用下述公式計算細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率：

細(xì)胞膜滲透率(%)=(-)/(-)×100。

(1)

式(1)中：為茶葉抗菌肽粗提物處理的吸光度，為PBS處理的吸光度，為Triton X-100處理的吸光度。

1.8 茶葉抗菌肽粗提物對細(xì)菌磷離子泄漏的影響

用滅菌的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9% NaCl溶液將對數(shù)生長期金黃色葡萄球菌稀釋至濃度為10CFU·mL的菌懸液。用終濃度為100 μg·mL的茶葉抗菌肽粗提物處理菌懸液，37 ℃分別培養(yǎng)0、2、4、8 h。陰性對照(CK)為無菌水，Nisin為陽性對照。將孵育后的菌液1 000×g 離心10 min，取上清，按照磷鉬酸測定試劑盒說明測定細(xì)菌上清中細(xì)胞外泄的磷離子濃度。用下列公式計算磷離子濃度。

磷離子濃度(mmol·L)=-。

(2)

式(2)中：為茶葉抗菌肽處理磷離子濃度，為無菌水處理磷離子濃度。

1.9 基因組DNA電泳遷移率變動分析

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Solarbio)提取金黃色葡萄球菌基因組DNA。將1 mg·mL茶葉抗菌肽粗提物(5 μL)與細(xì)菌基因組DNA(2 500 ng)(5 μL)在室溫下孵育30 min。抗菌肽(RLLLRIGRR-NH)作為陽性對照。加入2 μL上樣緩沖液后，利用0.8%瓊脂糖凝膠(含EB，終濃度5 μg·L)在120 V電壓下進(jìn)行電泳，電泳后使用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察DNA的遷移速率。

1.10 透射電鏡觀察

透射電鏡按照Klubthawee等的方法進(jìn)行。取1 mL對數(shù)生長期菌液(10CFU·mL)加入100 μL 100 μg·mL的茶葉抗菌肽粗提物，37 ℃溫育2 h。離心收集細(xì)胞后加入固定液，4 ℃固定2～4 h。PBS漂洗后加入體積分?jǐn)?shù)1%鋨酸室溫固定2 h。PBS洗滌后在分級乙醇系列中脫水，最后丙酮脫水。將樣品分別轉(zhuǎn)移到丙酮和環(huán)氧樹脂(體積比分別為1∶1和1∶2)混合物中，最后轉(zhuǎn)移到環(huán)氧樹脂中，37 ℃保存過夜。樣品切片用2%醋酸鈾飽和乙醇溶液、枸櫞酸鉛各染色15 min。利用透射電子顯微鏡HT-7700(日本Hitachi)觀察茶葉抗菌肽粗提物處理金黃色葡萄球菌后細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)變化。

1.11 茶葉抗菌肽對冷卻肉防腐保鮮

冷卻肉處理。在超凈工作臺內(nèi)將新鮮冷卻肉分割成100 g小塊，隨機(jī)分為3組。將分割好的冷卻肉分別浸漬在200 mL以下處理液中5 min：①對照組(CK)，無菌水；②100 μg·mL茶葉抗菌肽粗提物；③100 μg·mLNisin。在無菌環(huán)境下將各組肉瀝干，然后放于滅菌的一次性塑料碗中，置于4 ℃冷柜中保存12 d。每3 d檢測各處理組冷卻肉微生物生長情況和pH值變化。

pH值測定。在超凈工作臺內(nèi)分別將10 g處理組和對照組冷卻肉用滅菌的手術(shù)剪刀剪碎，置于含有100 mL滅菌水的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖后用滅菌紗布過濾。用pH計測定溶液pH值，每個處理重復(fù)3次。依據(jù)段靜蕓等的判定標(biāo)準(zhǔn)評價冷卻肉的新鮮度。

微生物生長檢測。將25 g冷卻肉剪碎放于盛有225 mL PBS的玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預(yù)置適量玻璃珠)，充分振搖后用滅菌紗布過濾，將濾液制成不同濃度梯度稀釋液。將1 mL稀釋液加入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入15 mL冷卻至46 ℃左右的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，混勻。PBS作為空白對照。置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)(以lg CFU·g表示)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。依據(jù)段靜蕓等的判定標(biāo)準(zhǔn)評價冷卻肉的新鮮度。

1.12 數(shù)據(jù)分析

使用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)DPS v7.05的單因素方差分析(ANOVA)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析，不同小寫字母表示處理間差異顯著(<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉抗菌肽粗提物提取與電泳檢測

提取的茶葉抗菌肽粗提物為淺黃色液體，BCA法檢測其濃度為0.52 mg·mL。抗菌肽粗提物經(jīng)12% SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖1所示，可以看出提取的茶葉抗菌肽具有一定的純度，分子量均小于25 ku，主要是分子量小于18.4 ku的蛋白質(zhì)或多肽。

1，10 ku超濾管截留蛋白；2，3 ku超濾管截留蛋白；3，提取的茶葉抗菌肽。1， Retained proteins by 10 ku ultrafiltration tube； 2， Retained proteins by 3 ku ultrafiltration tube； 3， Extracted TAE.圖1 茶葉抗菌肽粗提物SDS-PAGE電泳檢測Fig.1 SDS-PAGE of TAE

2.2 茶葉抗菌肽粗提物氨基酸含量

高速氨基酸分析儀檢測結(jié)果表明，茶葉抗菌肽粗提物中含有天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸共16種氨基酸，氨基酸總量為652.92 μg·mL。

2.3 茶葉抗菌肽粗提物的抗菌活性

茶葉抗菌肽粗提物對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果如表1所示，其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性高于大腸埃希菌。茶葉抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為13.6 mm，與Nisin(16.2 mm)相比差異不顯著。茶葉抗菌肽粗提物對大腸埃希菌的抑菌活性顯著高于Nisin，茶葉抗菌肽的抑菌圈直徑為7.9 mm，而Nisin抑菌圈直徑僅為4.7 mm。

表1 茶葉抗菌肽粗提物對細(xì)菌的抑菌活性

2.4 茶葉抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜滲透率的影響

茶葉抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性的影響結(jié)果見圖2。從圖中可以看出茶葉抗菌肽粗提物和Nisin處理金黃色葡萄球菌后，均可造成細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率增加。隨著處理時間的延長，細(xì)胞膜滲透率呈增加趨勢。茶葉抗菌肽處理金黃色葡萄球菌8 h后，細(xì)胞膜滲透率達(dá)到32.73%；Nisin處理金黃色葡萄球菌8 h后，細(xì)胞膜滲透率達(dá)到49.88%。說明茶葉抗菌肽和Nisin一樣，均可能作用于金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率增加。

圖2 茶葉抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜滲透率的影響Fig.2 Effect of TAE on cell membrane permeability of S. aureus

2.5 茶葉抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌磷離子泄露的影響

如圖3所示，金黃色葡萄球菌經(jīng)茶葉抗菌肽粗提物和Nisin處理后，均引起細(xì)菌胞內(nèi)磷離子泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞外磷離子濃度隨處理時間延長而升高。茶葉抗菌肽處理金黃色葡萄球菌8 h后，細(xì)胞外磷離子濃度增加到13.34 mmol·L。Nisin處理金黃色葡萄球菌后導(dǎo)致更多磷離子泄露，細(xì)胞外磷離子濃度增加到19.07 mmol·L。這與2.4節(jié)中茶葉抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率影響結(jié)果相符，說明茶葉抗菌肽可能作用于金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜，影響細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致磷離子泄露，從而殺死細(xì)菌。

圖3 茶葉抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌磷離子泄露的影響Fig.3 Effect of TAE on phosphate ions leakage of S. aureus

2.6 電泳遷移率變動分析

金黃色葡萄球菌基因組DNA經(jīng)茶葉抗菌肽粗提物處理后電泳遷移率變動分析結(jié)果見圖4，陽性對照抗菌肽(圖4中“1”點(diǎn)樣孔)與金黃色葡萄球菌基因組DNA發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致基因組DNA滯留在點(diǎn)樣孔；而同等濃度的茶葉抗菌肽粗提物處理金黃色葡萄球菌基因組DNA后，DNA并未發(fā)生電泳阻滯現(xiàn)象(圖4中“2”點(diǎn)樣孔)，表明茶葉抗菌肽并未與基因組DNA發(fā)生結(jié)合。但茶葉抗菌肽處理后的DNA條帶明顯變暗，且DNA條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象(箭頭所示)。推測可能是由于茶葉抗菌肽粗提物降解細(xì)菌基因組DNA，從而導(dǎo)致出現(xiàn)彌散的DNA條帶。

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；CK，陰性對照；1，陽性對照；2，茶葉抗菌肽。M， DNA marker； CK， Negative control； 1， Positive control； 2， TAE.圖4 DNA瓊脂糖凝膠阻滯分析Fig.4 Gel retardation analysis of S. aureus genomic DNA

2.7 茶葉抗菌肽粗提物對金黃色葡萄球菌形態(tài)的影響

通過透射電鏡(TEM)觀察結(jié)果表明，未經(jīng)茶葉抗菌肽處理的金黃色葡萄球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜完整、清晰可見，同時細(xì)胞內(nèi)容物充實(shí)，電子密度均勻(圖5-A)；而茶葉抗菌肽處理2 h后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜某些部分不完整，出現(xiàn)了輕微破損(圖5-B)，發(fā)生了明顯細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄露的情況(圖5-C)。這個結(jié)果與上述茶葉抗菌肽處理導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜滲透率和磷離子泄露增加結(jié)果一致。

A，CK；B和C，茶葉抗菌肽處理。標(biāo)尺=200 nm。A， CK； B and C， TAE teatment. Bar=200 nm.圖5 茶葉抗菌肽粗提物處理對金黃色葡萄球菌形態(tài)的影響Fig.5 TEM micrographs of S. aureus treated with TAE

2.8 茶葉抗菌肽粗提物處理對冷卻肉微生物生長的影響

圖6是冷卻肉經(jīng)過不同處理后菌落數(shù)的變化情況。茶葉抗菌肽粗提物處理菌落數(shù)顯著低于無菌水處理(CK)的菌落數(shù)。根據(jù)菌落數(shù)判定標(biāo)準(zhǔn)，CK在0 d的菌落數(shù)(lg CFU·g)為3.30，為新鮮肉；3 d的菌落數(shù)為5.05，為次鮮肉；而在第6天菌落數(shù)為6.19，肉已變質(zhì)。茶葉抗菌肽處理組在3 d內(nèi)菌落數(shù)低于4，為新鮮肉；在9 d內(nèi)的菌落數(shù)未超過6，為次鮮肉；但在12 d達(dá)7.37，肉已變質(zhì)。Nisin處理也有類似的效果。這說明茶葉抗菌肽粗提物可明顯抑制冷卻肉中微生物的生長，從而延緩冷卻肉變質(zhì)。與CK相比，茶葉抗菌肽粗提物可顯著延緩冷卻肉變質(zhì)，防腐保鮮時間延長3 d，與Nisin處理效果相當(dāng)。

柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. The same as below.圖6 茶葉抗菌肽處理對冷卻肉微生物生長的影響Fig.6 Effect of TAE on total bacterial count of chilled meat

2.9 茶葉抗菌肽粗提物處理對冷卻肉pH值的影響

茶葉抗菌肽處理不同時間后冷卻肉的pH值如圖7所示。按照pH值評價標(biāo)準(zhǔn)，在0 d，茶葉抗菌肽粗提物處理、Nisin處理和CK的冷卻肉的pH值均低于6.2，為一級鮮度。3～12 d，茶葉抗菌肽處理的冷卻肉pH值均顯著低于CK，第9天的pH值為6.61，未變質(zhì)，第12 天的pH值為7.20，已經(jīng)變質(zhì)。Nisin處理與茶葉抗菌肽處理有類似效果。而CK在第6天pH值大于6.7，肉已變質(zhì)。推測茶葉抗菌肽粗提物可以抑制冷卻肉表面微生物的生長，減慢蛋白質(zhì)與氨基酸降解形成氨類等堿性物質(zhì)的速度，從而延緩pH值上升。與CK相比，茶葉抗菌肽粗提物可顯著延緩冷卻肉變質(zhì)，防腐保鮮時間延長3 d，與Nisin處理效果相當(dāng)。

圖7 茶葉抗菌肽處理對冷卻肉pH值的影響Fig.7 Effect of TAE on pH value of chilled meat

3 結(jié)論與討論

為了應(yīng)對抗生素和化學(xué)防腐劑日益突出的副作用問題，研究人員不斷尋找新的抗菌資源。本文選用龍井茶葉作為原料，通過提取獲得茶葉抗菌肽粗提物。該抗菌肽粗提物主要包含分子量小于18.4 ku的多肽成分，對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有抑菌活性，通過作用于細(xì)菌細(xì)胞膜的機(jī)制抑殺細(xì)菌。茶葉抗菌肽粗提物可以抑制冷卻肉中微生物的生長，延長保鮮時間，與Nisin處理效果相當(dāng)。

抗菌肽的作用靶標(biāo)主要包括微生物的細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)(如DNA、RNA等)。研究發(fā)現(xiàn)，破壞細(xì)胞膜是大多數(shù)抗菌肽發(fā)揮抑菌作用的重要機(jī)制之一。大多數(shù)已知的植物抗菌肽是通過在細(xì)胞膜上形成穿孔，使離子和代謝物泄漏，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。劉喚明等研究發(fā)現(xiàn)，納豆菌脂肽可使金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞膜形成孔洞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Yang等通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，抗菌肽LCWAP處理金黃色葡萄球菌后，細(xì)菌細(xì)胞膜被部分破壞，細(xì)胞質(zhì)流出。本研究也對茶葉抗菌肽的細(xì)菌細(xì)胞膜作用機(jī)制進(jìn)行了研究，從細(xì)胞膜滲透率改變情況來看，茶葉抗菌肽粗提物能夠較大程度地改變金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜滲透率。磷離子泄露實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，茶葉抗菌肽處理導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)磷離子泄露。透射電鏡結(jié)果也表明抗菌肽粗提物可破壞細(xì)胞膜，引起細(xì)胞內(nèi)容物泄露，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

抗菌肽的作用機(jī)制并不局限于微生物細(xì)胞膜。抗菌肽一旦穿透細(xì)胞膜，某些抗菌肽可以靶向細(xì)胞內(nèi)過程，如DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成、酶活性、細(xì)胞壁合成和蛋白質(zhì)折疊。陳飛龍等研究表明，抗菌肽F1能夠以嵌插方式與金黃色葡萄球菌的DNA結(jié)合，干擾其正常代謝，從而達(dá)到抑菌效果。蘇冠芳等研究表明，抗菌肽buforin II的衍生物BF2-A/BF2-B能夠穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，與DNA合成相關(guān)基因以嵌入方式結(jié)合，特異性阻滯細(xì)胞周期中的DNA合成階段，導(dǎo)致細(xì)菌無法分裂，從而達(dá)到抑菌目的。Cardoso等發(fā)現(xiàn)，富含色氨酸/脯氨酸的抗菌肽indolicidin可以與DNA結(jié)合，從而抑制DNA復(fù)制。本研究中電泳遷移率變動分析顯示，茶葉抗菌肽粗提物并未與金黃色葡萄球菌基因組DNA發(fā)生結(jié)合，但茶葉抗菌肽粗提物處理后的DNA條帶明顯變暗，且DNA條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象。

在冷卻肉中添加的保鮮劑可分為化學(xué)保鮮劑和天然保鮮劑兩大類?；瘜W(xué)保鮮劑主要有乳酸及其鹽類、山梨酸及其鉀鹽類、丙酸及其鹽類、檸檬酸、抗壞血酸等，天然保鮮劑主要有殼聚糖、香辛料和中藥提取物、Nisin、溶菌酶等。研究表明，天然保鮮劑在冷卻肉貯藏保鮮研究中具有很好的效果，但香辛料和中藥提取物的加入會使冷卻肉產(chǎn)生異味。目前研究較多、效果相對優(yōu)良的天然保鮮劑有茶多酚、殼聚糖和Nisin。茶多酚對金黃色葡萄球菌、李斯特菌()、大腸埃希菌等多種食品源致病菌的生長具有顯著抑制作用。李柯欣研究發(fā)現(xiàn)，在較低濃度下茶多酚對細(xì)菌表現(xiàn)出較好的抑制作用，尤其是對金黃色葡萄球菌的抑菌作用明顯。Nisin是由乳酸鏈球菌亞屬產(chǎn)生的一種生物活性抗菌肽，它是唯一被許多國家允許用于食品保鮮的天然抗菌肽。本實(shí)驗(yàn)嘗試將茶葉抗菌肽粗提物應(yīng)用于冷卻肉的保鮮上，從微生物生長情況和pH值變化2個指標(biāo)綜合進(jìn)行評價。結(jié)果表明，茶葉抗菌肽粗提物可明顯抑制冷卻肉中微生物的生長，延緩冷卻肉pH值快速增長，從而顯著延緩冷卻肉變質(zhì)，防腐保鮮時間長達(dá)9 d，其效果與Nisin相當(dāng)。

茶葉的抑菌活性在食品和醫(yī)學(xué)上有著廣闊的前景。本文僅對茶葉抗菌肽進(jìn)行了初步的提取，對其抑菌活性和作用機(jī)制進(jìn)行了分析，并嘗試將其用于冷卻肉的防腐保鮮。接下來將對茶葉抗菌肽粗提物的抗菌肽成分開展分離、純化和鑒定研究。相信隨著對茶葉抗菌肽成分、作用機(jī)理和應(yīng)用等的不斷深入研究，將推動茶葉資源的開發(fā)與利用，為新型茶葉抗菌肽殺菌劑和保鮮劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。