高產(chǎn)葡聚糖酶微生物的分離篩選

呂小虎，曹貴東

（1.山西省檢驗檢測中心山西省標準計量技術研究院，山西太原 030027；2.山西瑞象生物藥業(yè)有限公司，山西太原 030012）

β-葡聚糖是形成細菌、真菌、酵母和谷物（如細胞壁）的天然成分，屬于非淀粉型多糖。不同類型的β-葡聚糖其分子骨架、分支水平和分子量有所不同，這些因素影響β-葡聚糖的溶解度，另外其水溶性與β-1，3-糖苷鍵的含量有關。β-葡聚糖可以刺激人體的免疫系統(tǒng)，能夠極大程度地提高人體的自然免疫力，具有抗腫瘤性質(zhì)，可以幫助機體消除自由基。在很多國家，葡聚糖已經(jīng)被廣泛應用于食品保健、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)。

為了更好地在工業(yè)中利用β-葡聚糖，需要篩選高效的β-葡聚糖酶。目前，釀酒業(yè)和飼料生產(chǎn)中均有這樣的應用實例。在啤酒生產(chǎn)中大麥是主要原料，大麥的胚乳和糊粉層細胞壁的主要成分是β-葡聚糖，它在釀酒過程中無法被完全分解，從而導致麥汁粘度大、過濾困難，引起啤酒的渾濁和非生物沉淀增加。采用β-葡聚糖酶可以使麥汁的過濾速度和得率大幅提升，從而優(yōu)化啤酒品質(zhì)、減少原料浪費。在飼料工藝中谷物是主要原料，由表1可知，谷物中β-葡聚糖含量較高，它通過其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合吸收自身質(zhì)量數(shù)倍的水，阻礙腸道蠕動。單胃動物在食用這些飼料后，β-葡聚糖無法完全分解，在胃中形成粘稠狀的食糜，加重了胃的負擔，從而影響營養(yǎng)成分的消化和吸收。因此，目前在飼料中添加高產(chǎn)β-葡聚糖酶微生物是國內(nèi)外研究的熱點。王麗麗篩選出耐熱性高達70℃，酶活力為82.64 U·mL的β-葡聚糖酶菌株；裘紀瑩等、王偉等和郭成栓也集中研究了產(chǎn)生β-葡聚糖酶微生物的分離、篩選及選育。本研究從自然界篩選β-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株，利用DNS法對其酶活進行測定，并從分子水平對其進行鑒定，為高產(chǎn)β-葡聚糖酶微生物提供豐富的種質(zhì)資源，為進一步工業(yè)化利用提供基礎。

表1 常見谷物中β-葡聚糖含量

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣品 太原汾河公園丁香樹土樣。

1.1.2 初篩培養(yǎng)基 β-葡聚糖1 g，剛果紅0.4 g，蛋白胨10 g，KHPO1 g，MgSO0.1 g，CaCl0.4 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基 β-葡聚糖1 g，蛋白胨10 g，KHPO1 g，MgSO0.1 g，CaCl0.1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.4 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.5 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 蛋白胨10 g，牛肉膏粉3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0，121℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 土樣處理 取太原市汾河公園丁香樹下土壤1.0 g，置于250 mL三角瓶中，加入100 mL無菌生理鹽水，用玻璃棒攪拌至土壤無結(jié)塊，放在37℃恒溫搖床上150 r·min震蕩培養(yǎng)2 h，制備濃度為10g·mL的土壤懸浮液。

1.2.2 產(chǎn)β-葡聚糖酶菌株的分離與篩選 取土壤懸浮液，用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋，至濃度為10g·mL。分別吸取10、10、10的稀釋梯度懸浮液各200 μL，涂布到初篩培養(yǎng)基上，放置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～5 d。

1.2.3 β-葡聚糖酶菌株的純化保存 在超凈臺內(nèi)觀察、挑選在初篩培養(yǎng)基上形成明顯透明圈的菌落，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線，放置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。然后，將其點接在初篩培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h。選取透明圈明顯的菌落，用甘油保存菌種。

1.2.4 酶活力測定（DNS法） β-葡聚糖酶能將β-葡聚糖降解為寡糖和單糖，具有還原性末端的寡糖和帶有還原性基團的單糖能在沸水浴中產(chǎn)生顯色反應，反應后的顏色變化愈明顯則表明酶解產(chǎn)生的還原糖越多，而還原糖的生成量又與反應液中β-葡聚糖酶的活力成正比。在540 nm波長下3，5-二硝基水楊酸與還原糖生成的氨基化合物具有最大吸收波，所以可以利用DNS法來測定β-葡聚糖酶的酶活。通過分光比色測定反應液顏色的強度，計算出反應液中β-葡聚糖酶的活力。測定方法如下：

（1）標準葡萄糖溶液配制。準確稱取無水葡萄糖100 mg，加80 mL蒸餾水溶解，定容至100 mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）標準曲線繪制。取7支帶有刻度的15 mL試管，按表2配制標準溶液，經(jīng)沸水浴10 min，立即冷卻后定容至15 mL。測定各管標準溶液的OD值（540 nm），以葡萄糖質(zhì)量（mg）為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制葡萄糖擬合曲線，求得=a+b一元線性方程中的a和b值。

表2 葡萄糖標準曲線繪制

（3）酶活力測定。取初篩培養(yǎng)基上有明顯透明圈的菌落，經(jīng)純化后接入到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在37℃條件下150 r·min震蕩培養(yǎng)48 h。取菌液5 mL于離心管中，于4℃經(jīng)10 000 r·min離心5 min，取上清液1 mL，用pH值5.0的醋酸緩沖液溶解并稀釋10倍。按照表3方法進行酶樣品OD值的測定。同時設空白對照。每種酶樣品做3組平行。按照以下公式計算酶活力，并在（＜0.05）水平上進行差異顯著性分析。

表3 酶活力測定的反應步驟及試劑用量

β-葡聚糖酶酶活定義：在50℃，pH值5.0，每分鐘水解β-葡聚糖產(chǎn)生1 μg還原糖所需酶量定義為1個酶活力單位（U）。計算酶的活力依據(jù)以下公式：

葡聚糖酶的活力=（S×D×1 000）/（1×10）式中，S為光吸收在標準曲線上對應的葡萄糖含量；D是用醋酸緩沖液稀釋酶樣的倍數(shù)；1 000為mg與ug之間換算系數(shù)；10為酶促反應時間。

1.2.5 生長曲線繪制 將篩選到活性最高的菌株，接入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在37℃條件下150 r·min震蕩培養(yǎng)，分別取0、4、8、12、24、36、48、72 h的菌液于600 nm測吸光度值。

1.2.6 菌株總DNA的提取 采用TIANamp細菌基因組DNA試劑盒提取酶活最高菌株D-1的總DNA，通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA含量。

1.2.7 16S rRNA擴增（1）通用引物：SF：5'-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3'；SR：5'-AAGGAGGTGATCC AGCCGCA-3'。

（2）PCR反應體系：模版2 μL，引物4 μL，2XTaq PCR Master Mix 25 μL，加ddHO至50 μL。

（3）PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃退火2 min，35個循環(huán)，72℃延伸1 min。

（4）取PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.2.8 序列測定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 經(jīng)由PCR擴增純化后得到的16S rDNA，送上海生工生物工程有限公司公司進行測序。將所得序列提交GeneBank數(shù)據(jù)庫比對，并在GeneBank中下載8條相似性較高的細菌16S rDNA序列進行聚類分析，所用軟件為Clustal X(windows-xp-2.0)，采用Neighbor-joining方法，通過MEGA6進行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差的形式表示，運用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香樹土樣中產(chǎn)β-葡聚糖酶菌株的篩選

用β-葡聚糖酶初篩培養(yǎng)基對汾河公園丁香樹下采集的土壤進行細菌分離培養(yǎng)，結(jié)果如圖1所示，有3個菌落明顯不同，在菌落周圍能夠產(chǎn)生透明圈。將3個菌株進行純化并保存，命名為D-1、D-2和D-3。

圖1 初篩培養(yǎng)基菌落生長情況

2.2 酶活力測定

2.2.1 葡萄糖標準曲線繪制 由圖2可知，葡萄糖溶液濃度與540 nm吸光度值線性關系良好，相關系數(shù)大于0.99。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.2.2 酶活力測定 將3株明顯可以看到透明圈的菌株純化后，采用DNS方法進行酶活測定。通過與葡萄糖標準曲線比較，筆者發(fā)現(xiàn)D-1菌株酶活力高達103.67 U·mL（表4）。差異顯著性分析結(jié)果顯示，D-1的酶活力顯著高于D-2和D-3菌株產(chǎn)生的酶活力（＜0.05）。

表4 3株分離菌的酶活力比較

2.3 D-1生長曲線測定

通過酶活測定，筆者篩選到1株具有較高酶活力的菌株D-1，采用測定600 nm菌懸液OD值的方法來研究其生長規(guī)律，結(jié)果如圖3所示，D-1的生長明顯符合細菌的一般生長規(guī)律。0～8 h，此段曲線較為平緩，處于遲緩期，菌體接入到新環(huán)境中有一個短暫的適應過程。此期間細菌的體積在增加，生長代謝非?；钴S，為后期的生長繁殖做物質(zhì)儲備。8～24 h，此段曲線斜率大，細菌以穩(wěn)定的幾何級數(shù)快速生長。24～36 h，細菌達到了穩(wěn)定生長期，曲線接近平直，此時培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)消耗、毒性產(chǎn)物積累，細菌生長速率下降。36 h后，細菌繁殖越來越慢，死亡菌數(shù)明顯增多，生長曲線呈下降趨勢，生理代謝活動趨于停滯。

圖3 D-1菌株生長曲線

2.4 D-1總DNA提取

由圖4可見，膠板上熒光條帶清晰，說明成功提取出了D-1菌株的總DNA，并且濃度較高。

圖4 D-1菌株的總DNA電泳圖

2.5 D-1總基因組中16S rRNA擴增

對菌株D-1進行16S rDNA擴增后，經(jīng)電泳檢測，可以看到泳道上有清晰的條帶（圖5），通過與Marker比較，PCR產(chǎn)物目的條帶為1 500 bp左右，與16S rRNA目標產(chǎn)物大小一致。

圖5 D-1菌株PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳

2.6 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

2.6.1 序列分析 將擴增后產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進行雙向測序，通過DNAMAN拼接可得到如下序列：AACCTGCCCATAAGACTGGGATAA CTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAATATTT TGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCG GCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGC TAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGA TGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAG TCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGC TTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAAC AAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTA CCTAACCAGAAARSCACGGCTAACTACGTGCCAG CAGCCGCCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATC CGGAAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGGTG GTTTCTTAAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCA ACCCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTG AGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAG CGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAG TGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACT GAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTA GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT GCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGYCTCTTTAGTGCT GAAGTTAACGCATTAAGCACTCYGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACG GGGGYCCGCACAAGCGGTGGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAAYGCGAAGAAYCTTTACCAGGTC TTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTT CTYCTTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATG GTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTG CCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCG GTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAA ATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT GCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCG CGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAG TTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGC TGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGC GGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCC GTCACACCACGAGAGTT

2.6.2系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將拼接好的序列登錄NCBI進行序列比對，結(jié)果顯示與芽孢桿菌屬（sp.）序列相似性高達99%以上。選擇了7株不同種的芽孢桿菌和1株大腸桿菌構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），發(fā)現(xiàn)D-1菌株與蠟樣芽孢桿菌（）聚為一個類群，初步確定D-1菌株屬于蠟樣芽孢桿菌。

圖6 D-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

本研究從丁香樹下土壤中分離篩選得到3株高產(chǎn)β-葡聚糖酶的菌株，通過DNS法對其酶活進行測定，其中D-1菌株酶活達到103.67 U·mL，該菌株在8～24 h達到生長對數(shù)期。通過分子生物學鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，D-1與屬于同一分支，同源性高達99%以上，初步確定為蠟樣芽孢桿菌。

國內(nèi)對高產(chǎn)β-葡聚糖酶的微生物菌株研究大多集中于黑曲霉（）和里氏木霉，芽孢桿菌也可以分泌此酶，如枯草芽孢桿菌。但高產(chǎn)β-葡聚糖酶的蠟樣芽孢桿菌是本實驗室首次從土壤中分離得到的菌株。芽孢桿菌抗逆性很強，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有明顯的優(yōu)勢。因此，本研究將繼續(xù)從培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件優(yōu)化入手，使菌株的生長發(fā)酵條件達到最優(yōu)，從而提高其產(chǎn)酶能力，為進一步研究其產(chǎn)酶機理并進行工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。