補(bǔ)腎活血方干預(yù)絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎血清學(xué)炎癥指標(biāo)與MRI半定量評(píng)分相關(guān)性研究*

陶 帥 姜 宏 戴 瑜 王 鎧 印紅兵 龔華惠

1南京中醫(yī)藥大學(xué)泰州附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇泰州 225300 2南京中醫(yī)藥大學(xué)蘇州附屬醫(yī)院骨傷科，江蘇蘇州 215009

絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展往往伴隨著血清學(xué)炎癥指標(biāo)的變化，若能找到這些變化指標(biāo)與磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)影像特征的相關(guān)性并將其用于臨床，對(duì)提高臨床試驗(yàn)效率、降低臨床研究成本有積極意義。本課題組既往研究認(rèn)為絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎臨床辨證可從“天癸理論”入手，其以肝腎虧虛為本，瘀血內(nèi)阻為標(biāo)，治以補(bǔ)益肝腎佐以活血化瘀、祛風(fēng)濕之品?；诖艘?，課題組由《備急千金要方》中的經(jīng)典古方“獨(dú)活寄生湯”化裁得到補(bǔ)腎活血方，并將其用于絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎的治療，臨床獲益頗佳[1]。本研究將進(jìn)一步觀察補(bǔ)腎活血方干預(yù)下的絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清學(xué)炎癥指標(biāo)變化和全器官磁共振成像評(píng)分[2]系統(tǒng)中關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨髓水腫、關(guān)節(jié)面下囊腫、半月板變性及損傷及關(guān)節(jié)腔積液共5個(gè)項(xiàng)目的評(píng)分變化，探討血清學(xué)炎癥指標(biāo)與MRI影像特征是否存在關(guān)聯(lián)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年11月—2020年11月于南京中醫(yī)藥大學(xué)泰州附屬醫(yī)院骨傷科門診就診的絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎患者70例進(jìn)行前瞻性研究，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將其分為治療組和對(duì)照組，每組35例，最終有67例完成臨床試驗(yàn)，治療組33例，對(duì)照組34例。脫落患者中治療組脫落2例：1例因失訪而脫落，另1例因治療1周后疼痛癥狀改善不明顯主動(dòng)退出(改為手術(shù)治療)；對(duì)照組脫落1例：因首次服藥后便感覺(jué)胃部不適，主動(dòng)要求退出試驗(yàn)。本研究已通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：2019-032-01)。

治療組年齡50～77歲，平均年齡(59.24±7.25)歲；絕經(jīng)年限1～25年，平均絕經(jīng)年限(9.23±6.90)年；單膝膝骨關(guān)節(jié)炎26例，雙膝膝骨關(guān)節(jié)炎7例(雙膝患者僅納入癥狀較重側(cè))；身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)20.4～27.9 kg/m2，平均BMI(24.74±2.20)kg/m2；K-L分級(jí)：Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)3例。對(duì)照組年齡50～73歲，平均年齡(60.59±7.81)歲；絕經(jīng)年限1～23年，平均絕經(jīng)年限(10.06±7.07)年；單膝膝骨關(guān)節(jié)炎26例，雙膝膝骨關(guān)節(jié)炎8例；BMI 20.8～27.5 kg/m2，平均BMI(24.50±1.73)kg/m2；K-L分級(jí)：Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)18例，Ⅲ級(jí)2例。2組患者年齡、絕經(jīng)年限、BMI、K-L分級(jí)等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

①中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《膝骨關(guān)節(jié)炎中醫(yī)診療指南(2020年版)》[3]中辨證屬肝腎虧虛者。②西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)制定的《骨關(guān)節(jié)炎診療指南(2018年版)》[4]膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎部分。③放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照骨性關(guān)節(jié)炎放射學(xué)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)K-L(Kellgren-Lawrence)X線分級(jí)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合中醫(yī)及西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且視覺(jué)模擬評(píng)分(visual analogue scale，VAS)2～7分；②影像學(xué)X線分級(jí)屬Ⅰ～Ⅲ級(jí)，MRI存在相關(guān)影像學(xué)表現(xiàn)(如半月板損傷變性、軟骨厚度變薄甚至缺損、局部骨髓水腫、關(guān)節(jié)積液及腘窩囊腫等其一或以上)，若為雙膝患者僅納入癥狀較重側(cè)；③停經(jīng)≥1年，BMI 18.5～28.0 kg/m2；④患者同意治療方案，并能配合檢查，堅(jiān)持完成隨訪。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①膝關(guān)節(jié)存在嚴(yán)重機(jī)械變形(內(nèi)/外翻>15°)；②膝關(guān)節(jié)存在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、膝關(guān)節(jié)結(jié)核、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎等其它炎性疾?。虎劢?個(gè)月內(nèi)接受過(guò)膝骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的治療，包括口服藥物(如非甾體類抗炎藥、雌激素、中成藥、中藥湯劑等)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射藥物(如中藥提取物、透明質(zhì)酸、糖皮質(zhì)激素等)，非藥物治療(物理治療、針刺、艾灸、中藥熏洗等)和關(guān)節(jié)鏡手術(shù)治療等；④合并精神疾病以及嚴(yán)重肝腎、心腦血管、腫瘤、血液等內(nèi)科系統(tǒng)疾病者；⑤對(duì)本研究涉及的中藥湯劑及非甾體類藥物過(guò)敏者；⑥長(zhǎng)期使用其它影響療效和安全性判定的藥物者；⑦存在MRI檢查禁忌(如裝有起搏器、植入式除顫器、外科手術(shù)夾、人工耳蝸、胰島素泵及不到3周的支架等)或不能耐受、配合完成MRI檢查者(如帕金森病、震顫、恐懼癥等)。

1.5 治療方法

2組均給予基礎(chǔ)治療，基礎(chǔ)治療包含健康教育、運(yùn)動(dòng)療法及行動(dòng)輔助工具等。在此基礎(chǔ)上，對(duì)照組給予塞來(lái)昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20140072)口服，1次/d，1粒/次。治療組給予補(bǔ)腎活血方口服，補(bǔ)腎活血方主要以懷牛膝20 g，熟地黃15 g，川續(xù)斷15 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，獨(dú)活10 g，白芍15 g，甘草6 g等中藥為底方組成，治療時(shí)根據(jù)臨床癥狀適當(dāng)加減：兼有氣短乏力、精神疲倦等氣虛表現(xiàn)者，加黃芪、黨參、白術(shù)等；兼有手足不溫、小便頻數(shù)等陽(yáng)虛表現(xiàn)者，加制附子、肉桂等；兼有關(guān)節(jié)酸痛重著、遇寒痛甚、得溫則舒等寒濕表現(xiàn)者，加薏苡仁、桂枝、干姜等；兼有關(guān)節(jié)腫脹熱痛、觸之灼熱等濕熱表現(xiàn)者，加黃柏、知母、金銀花等。1劑/d，早晚溫服。2組療程均為4周。

分別于治療前及治療4周后對(duì)2組患者的患側(cè)膝關(guān)節(jié)進(jìn)行MRI掃描檢查，由于MRI預(yù)約的不確定性，治療4周后的MRI復(fù)查可放寬至第5周開始的3天內(nèi)完成。

1.6 觀察指標(biāo)與療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

臨床血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：采集2組患者治療前后晨起空腹外周靜脈血，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法分別檢測(cè)血清中基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)、Ⅱ型膠原C端肽(C-telopeptide of type Ⅱ collagen，CTX-Ⅱ)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)等因子含量，操作方法按照相應(yīng)試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行。

膝關(guān)節(jié)MRI半定量評(píng)分：本研究應(yīng)用德國(guó)SIEMENS MAGNETOM Skyra 3.0 T超導(dǎo)磁共振成像系統(tǒng)，患者取仰臥、膝自然伸直、足先進(jìn)正常解剖體位，以膝關(guān)節(jié)專用線圈中心線對(duì)準(zhǔn)患者髕骨下緣進(jìn)行MRI掃描，主要包含4個(gè)掃描序列：矢狀位T1自旋回波序列、矢狀位PD快速自旋回波壓脂序列、冠狀位PD快速自旋回波壓脂序列及軸位T2刀鋒壓脂序列。采用全器官磁共振成像評(píng)分系統(tǒng)作為膝關(guān)節(jié)MRI半定量評(píng)分工具，具體參照2004年國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究會(huì)發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)[2]，共涉及15個(gè)評(píng)分亞區(qū)及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨髓水腫、關(guān)節(jié)面下囊腫、骨磨損、骨贅、半月板、韌帶、關(guān)節(jié)腔積液等8個(gè)評(píng)分項(xiàng)目，總分共計(jì)332分，評(píng)分時(shí)根據(jù)各項(xiàng)目的嚴(yán)重程度進(jìn)行計(jì)分。

其中膝關(guān)節(jié)表面按區(qū)域劃分的15個(gè)評(píng)分亞區(qū)為：髕股關(guān)節(jié)(patello femoral joint，PFJ)包括MP、LP、MFa和LFa亞區(qū)；外側(cè)脛股關(guān)節(jié)(lateral tibiofemoral joint，LFTJ)由LFc、LFp、LTa、LTc和LTp等亞區(qū)組成。內(nèi)側(cè)脛股關(guān)節(jié)(medial tibiofemoral joint，MFTJ)由MFc、MFp、MTa、MTc和MTp等亞區(qū)組成；剩余一亞區(qū)為S區(qū)域。詳見圖1。

圖1 膝關(guān)節(jié)的區(qū)域劃分方法(以右膝為例)

評(píng)分項(xiàng)目細(xì)則：本研究選取其中的5個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行觀察，分別是關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨髓水腫、關(guān)節(jié)面下囊腫、半月板變性及損傷及關(guān)節(jié)腔積液，其中關(guān)節(jié)軟骨占總分的比重最大，達(dá)84分，關(guān)節(jié)腔積液最高僅有3分，占比最??；具體細(xì)則如下。

①關(guān)節(jié)軟骨：對(duì)14個(gè)關(guān)節(jié)軟骨覆蓋區(qū)域(不包括S區(qū)域)的軟骨信號(hào)和形態(tài)學(xué)進(jìn)行評(píng)分，分為0～6分8個(gè)等級(jí)：0分=正常；1分=T2壓脂圖像正常厚度但信號(hào)增高；2分=關(guān)節(jié)軟骨非全層缺損但最大寬度<1 cm；2.5分=關(guān)節(jié)軟骨全層缺損但最大寬度<1 cm；3分=關(guān)節(jié)軟骨多發(fā)(2.0級(jí))缺損與正常厚度區(qū)域混雜，或軟骨缺損寬度>1 cm但<75%區(qū)域；4分=彌漫性軟骨非全層缺損但≥75%的區(qū)域；5分=多發(fā)(2.5級(jí))缺損，或軟骨缺損寬度>1 cm但<75%區(qū)域；6分=彌漫性軟骨全層缺損但≥75%區(qū)域。詳見圖2。

圖2 關(guān)節(jié)軟骨8個(gè)等級(jí)評(píng)分方法

②軟骨下骨髓水腫：軟骨下骨髓水腫為正常骨髓信號(hào)中強(qiáng)度增加的游離水信號(hào)呈邊界不清的區(qū)域，通常在15個(gè)關(guān)節(jié)亞區(qū)域均會(huì)發(fā)生，磁共振PDWI或T2WI顯示為高信號(hào)，T1WI顯示為低信號(hào)，根據(jù)區(qū)域受累程度分為0～3分(4級(jí))：0分=無(wú)；1分=<25%；2分= 25%～50%；3分=>50%。詳見圖3。

圖3 軟骨下骨髓水腫4個(gè)等級(jí)評(píng)分方法

③關(guān)節(jié)面下囊腫：關(guān)節(jié)面下囊腫通常被識(shí)別為關(guān)節(jié)下骨信號(hào)明顯增加的呈類圓形、邊界清晰且沒(méi)有骨髓組織或骨小梁跡象的病灶。在15個(gè)關(guān)節(jié)亞區(qū)域均會(huì)發(fā)生，根據(jù)區(qū)域受累程度分為0～3分(4級(jí))：0分=無(wú)；1分=<25%；2分= 25%～50%；3分=>50%。詳見圖4。

圖4 關(guān)節(jié)面下囊腫4個(gè)等級(jí)評(píng)分方法

④半月板變性及損傷：根據(jù)矢狀面和冠狀面圖像，對(duì)半月板內(nèi)外側(cè)的前角、體部和后角分別進(jìn)行0～4級(jí)分級(jí)：0級(jí)=完好；1=輕微放射狀撕裂或鸚鵡嘴狀撕裂；2級(jí)=無(wú)移位性撕裂或既往手術(shù)修復(fù)；3級(jí)=移位性撕裂或部分切除；4級(jí)=完全浸漬/破壞或完全切除。0分=所有0級(jí)；1分=≥1個(gè)區(qū)域1級(jí)；2分=僅有1個(gè)區(qū)域2級(jí)；3分=≥2個(gè)區(qū)域2級(jí)；4分=≥1個(gè)區(qū)域3級(jí)；5分=僅有1個(gè)區(qū)域4級(jí)；6分=≥2個(gè)區(qū)域4級(jí)。

⑤關(guān)節(jié)腔積液：按滑膜腔最大可膨脹程度評(píng)分，分為0～3分(4級(jí))：0分=正常；1分=輕度(<33%)；2分=中度(33%～66%)；3分=重度(>66%)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組血清學(xué)MMP-13、CTX-Ⅱ、IL-1β指標(biāo)變化

治療后，2組MMP-13、CTX-Ⅱ、IL-1β均較治療前明顯降低(P<0.01)，但治療組上述指標(biāo)均明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

表1 2組治療前后MMP-13、CTX-Ⅱ、IL-1β比較

2.2 2組膝關(guān)節(jié)MRI半定量評(píng)分比較

治療后，2組軟骨下骨髓水腫評(píng)分、關(guān)節(jié)腔積液評(píng)分均較治療前降低(P<0.01)，且2組治療后上述評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，2組在關(guān)節(jié)軟骨損傷、關(guān)節(jié)面下囊腫、半月板變性及損傷等評(píng)分方面治療前后比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組治療前后膝關(guān)節(jié)各觀察項(xiàng)目MRI半定量評(píng)分比較

2.3 血清學(xué)炎癥指標(biāo)與軟骨損傷評(píng)分的相關(guān)性分析

治療前MMP-13、CTX-Ⅱ、IL-1β分別與軟骨損傷評(píng)分進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析顯示，MMP-13、CTX-Ⅱ、IL-1β與軟骨損傷評(píng)分均呈良好正相關(guān)(r=0.569，P<0.01；r=0.579，P<0.01；r=0.416，P<0.01)。見表3。

表3 血清學(xué)炎癥指標(biāo)與軟骨損傷評(píng)分相關(guān)性的相關(guān)系數(shù)r和P值

2.4 2組治療前后血清學(xué)炎癥指標(biāo)變化與MRI半定量評(píng)分變化的相關(guān)性分析

對(duì)2組患者治療前后血清MMP-13、CTX-Ⅱ及IL-1β的變化值分別與軟骨下骨髓水腫、關(guān)節(jié)腔積液的MRI半定量評(píng)分變化值進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示治療組治療前后僅有MMP-13變化與關(guān)節(jié)腔積液評(píng)分變化呈弱正相關(guān)(r=0.391，P<0.05)，對(duì)照組治療前后僅有MMP-13變化與軟骨下骨髓水腫評(píng)分變化呈弱正相關(guān)(r=0.347，P<0.05)，其余均無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表4 2組治療前后血清學(xué)炎癥指標(biāo)變化與MRI半定量評(píng)分變化的相關(guān)系數(shù)r和P值

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵病理特征是軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變。研究[5]發(fā)現(xiàn)，中草藥(如威靈仙提取物)可以防止蛋白多糖和膠原蛋白的流失，并加速軟骨細(xì)胞的增殖；同時(shí)有研究[6]證實(shí)中藥治療膝骨關(guān)節(jié)炎能顯著影響多種炎癥相關(guān)因子水平。絕經(jīng)后女性卵巢功能處于衰竭狀態(tài)，雌激素長(zhǎng)期處于低值缺乏水平，因此絕經(jīng)后女性膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率及嚴(yán)重性均顯著提高；反之外源性雌激素的介入可抑制骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，對(duì)軟骨具有保護(hù)作用[7-8]。有研究[9]報(bào)道從某些中藥及食物中提取的植物雌激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理學(xué)活性類似于雌激素；且目前研究[10]認(rèn)為具有雌激素樣活性的中藥多集中在補(bǔ)益藥和活血化瘀藥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，臨床上常用于治療關(guān)節(jié)痹痛的中藥如牛膝、當(dāng)歸、白芍等均含有不同種類的植物雌激素成分[11]。Zou Y等[12]研究證實(shí)植物雌激素金雀異黃素增加了關(guān)節(jié)軟骨中膠原蛋白Ⅱ和聚集蛋白聚糖的表達(dá)水平，并降低了TNF-α和IL-1β的水平，從而減輕了軟骨退化。前期研究[1]已得出補(bǔ)腎活血方可適當(dāng)提高絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎患者血清中E2的表達(dá)，且E2水平處于絕經(jīng)后女性的正常范圍，因此結(jié)合本研究結(jié)果可以推測(cè)補(bǔ)腎活血方治療絕經(jīng)后膝骨關(guān)節(jié)炎一方面可能直接通過(guò)相關(guān)機(jī)制抑制炎癥反應(yīng)來(lái)保護(hù)軟骨，另一方面可能通過(guò)發(fā)揮類雌激素樣作用來(lái)下調(diào)TNF-α、IL-1β、MMP-13等促炎細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)軟骨的作用。

在臨床研究中，更好地理解膝骨關(guān)節(jié)炎MRI影像特征與生化標(biāo)記物之間的關(guān)系是有利的。原因在于：首先，核磁共振檢查費(fèi)用昂貴且資源短缺，若能找出與MRI影像特征相對(duì)應(yīng)或有極高相關(guān)性的血液或尿液生化標(biāo)記物，對(duì)簡(jiǎn)化臨床研究流程、降低研究成本大有益處。其次，如果有某種生物化學(xué)標(biāo)記物可以預(yù)測(cè)膝關(guān)節(jié)MRI特征的變化，并最終成為干預(yù)的目標(biāo)，這將有助于臨床試驗(yàn)中患者表型的篩選和潛在分層。

目前研究[13]已證明一些生化標(biāo)志物與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)，且有研究[14]支持了活化的巨噬細(xì)胞生物標(biāo)志物與膝骨關(guān)節(jié)炎早期滑膜炎癥的MRI成像之間存在聯(lián)系，并認(rèn)為該聯(lián)系與先天免疫的激活有關(guān)。Deveza LA等[15]發(fā)現(xiàn)盡管骨轉(zhuǎn)換生化標(biāo)志物與MRI影像學(xué)特征存在一些統(tǒng)計(jì)學(xué)上的關(guān)聯(lián)，但大多數(shù)關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度較弱，這些系統(tǒng)性生化標(biāo)記物本身并不能預(yù)測(cè)MRI中骨髓水腫、骨贅等病理變化。

本研究中治療前MMP-13、CTX-Ⅱ和IL-1β與關(guān)節(jié)軟骨損傷評(píng)分呈良好正相關(guān)，可以看出絕經(jīng)后雌激素缺乏時(shí)，其抑制IL-1、TNF-α等炎癥因子表達(dá)的作用明顯減退，在多種炎癥及免疫調(diào)節(jié)因子作用下，細(xì)胞外基質(zhì)降解和軟骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而關(guān)節(jié)軟骨遭到破壞[16]?？梢钥闯?，關(guān)節(jié)軟骨損傷評(píng)分可以較為準(zhǔn)確地評(píng)估膝骨關(guān)節(jié)炎病情嚴(yán)重程度，從而監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)治療組除MMP-13變化值與關(guān)節(jié)腔積液評(píng)分變化值呈弱正相關(guān)外，其余均未發(fā)現(xiàn)明顯關(guān)聯(lián)性，可以推測(cè)MMP-13、CTX-Ⅱ及IL-1β等血清學(xué)指標(biāo)的降低程度或許不能預(yù)測(cè)MRI影像中軟骨下骨髓水腫和關(guān)節(jié)腔積液的改善情況。

然而，本研究結(jié)果可能受到以下因素干擾：①本研究為單中心研究，研究病例較少且隨訪時(shí)間短，可能存在選擇偏倚，從而對(duì)結(jié)果造成影響；②患者采取的健康教育、運(yùn)動(dòng)療法及行動(dòng)輔助等基礎(chǔ)治療措施也可能對(duì)本研究結(jié)果存在一定的影響；③本研究中使用的全器官磁共振成像評(píng)分系統(tǒng)通常只是對(duì)MRI病變的某個(gè)范圍給出相應(yīng)的評(píng)分，缺乏量化的精準(zhǔn)性；④本研究對(duì)象均為絕經(jīng)后女性，而血液標(biāo)本通常反映全身狀況，其可能受到絕經(jīng)這種正常衰老狀態(tài)的影響。因此，今后仍需要設(shè)計(jì)更加完善的試驗(yàn)對(duì)本研究的結(jié)果加以驗(yàn)證。