基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的長春新堿治療乳腺癌分子機制研究

蔣正立 陳 靜 夏愛曉 戴丹平

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤。根據(jù)腫瘤的分期和患者身體狀況，可采用手術(shù)、化療、內(nèi)分泌治療、靶向治療及中醫(yī)藥輔助治療等多種手段，而化療方案中常用藥物有蒽環(huán)類、紫杉醇類以及長春新堿等。長春新堿（vincristine，VCR）治療乳腺癌具有較好的臨床療效[1-3]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法，通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫篩選VCR 治療乳腺癌的靶點，分析其生物學(xué)功能和作用信號通路，從而探討VCR 治療乳腺癌的分子作用機制。

1 資料與方法

1.1 長春新堿相關(guān)靶點預(yù)測 VCR 是夾竹桃科植物長春花中提取出的生物堿，以“Vincristine”及其結(jié)構(gòu)為關(guān)鍵詞，分別從Drugbank、Swiss Target Prediction、Stitch 數(shù)據(jù)庫預(yù)測篩選VCR 相關(guān)靶點。

1.2 GEO 基因芯片數(shù)據(jù)分析乳腺癌相關(guān)靶點 從GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數(shù)據(jù)庫下載編號GSE29044 的基因芯片數(shù)據(jù)原始文件，采用Geo2r在線工具進行差異基因分析，以|logFC|≥2 和P<0.05為篩選條件進行篩選，繪制前50 個差異基因熱圖。

1.3 乳腺癌相關(guān)靶點獲取 以“Breast cancer”為關(guān)鍵詞，分別通過CTD（http://ctdbase.org/）和OMIM（http://www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫查找乳腺癌相關(guān)靶標(biāo)。并與GEO 基因芯片數(shù)據(jù)分析得到乳腺癌相關(guān)靶點合并刪除重復(fù)，即為乳腺癌疾病靶點。

1.4 VCR 治療乳腺癌相關(guān)靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)建立及核心靶點獲取 將預(yù)測得到VCR 靶點與乳腺癌靶點導(dǎo)入Venny 在線工具取交集，即為VCR 治療乳腺癌相關(guān)靶點，導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，建立VCR 治療乳腺癌相關(guān)靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件，對網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選核心靶點。

1.5 GO 功能和KEGG 通路富集 為進一步闡明VCR 治療乳腺癌相關(guān)機制，將VCR 治療乳腺癌潛在靶點通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進行GO 功能和KEGG 通路富集分析，并用Prism 軟件和在線繪圖站Ehbio 將結(jié)果繪制成柱狀圖與氣泡圖。

1.6 分子對接 采用分子對接方法研究受體蛋白EGFR、TP53、AKT1 與ACR 配體小分子之間的結(jié)合模式，以結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol 為標(biāo)準(zhǔn)，評價VCR 與相關(guān)靶點結(jié)合作用。

2 結(jié)果

2.1 長春新堿作用靶點 從Drugbank（https://go.drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫中得到15個靶點，Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫中獲得10 個靶點，Stitch 數(shù)據(jù)庫中獲得100 個靶點，刪去重復(fù)靶點，共得到124個VCR 作用靶點。

2.2 乳腺癌相關(guān)基因分析與檢索 篩選出319 個明顯影響和改變的差異表達基因，通過CTD 和OMIM數(shù)據(jù)庫共篩選得到718 個疾病靶點。兩者合并，刪除重復(fù)，共得到1003 個乳腺癌靶點。

2.3 長春新堿治療乳腺癌靶標(biāo)分析共得到26 個（映射率為2.4%）VCR 治療乳腺癌潛在靶標(biāo)（圖2），包括表皮生長因子受體（EGFR）、腫瘤抑制蛋白p53（TP53）、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶（AKT1）、周期蛋白A2（CCNA2）、90kDa 熱休克蛋白αA1（HSP90AA1）、雌激素受體基因（ESR1）、雷帕霉素靶蛋白（MTOR）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（BCL2）、非受體酪氨酸激酶（SRC）、多藥耐藥性蛋白（ABCB1）等。

2.4 VCR 治療乳腺癌相關(guān)靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)建立 通過String 數(shù)據(jù)庫建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，包含26 個節(jié)點和133 條相互作用關(guān)系（見圖2），進一步拓?fù)鋵W(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中點度中心性（DC）、接近中心性（CC）和中介中心性（BC）大于均值（點度中心性=10.23，中介中心性=15.85，接近中心性=0.025）的關(guān)鍵節(jié)點有10 個，占總節(jié)點數(shù)的38.5%，其中度值前三為：表皮生長因子受體（EGFR）、腫瘤抑制蛋白p53（TP53）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶（AKT1），提示它們在整個網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮較為重要的作用。

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對VCR 治療乳腺癌潛在靶點進行GO 富集分析，共得到140 個顯著條目（P<0.05），如圖3 所示，包括生物過程95 個，主要涉及蛋白質(zhì)自磷酸化、磷脂酰肌醇介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)等；細(xì)胞組成11 個，主要涉及質(zhì)膜、磷脂酰肌醇3-激酶復(fù)合物、核等；分子功能34 個，主要涉及ATP 結(jié)合、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性、激酶活性等。KEGG 富集結(jié)果共得到65 條顯著通路（P<0.05），排名前20 條通路如圖4 所示，主要涉及磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）、表皮生長因子受體（ErbB）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）等信號通路。

2.6 分子對接 采用分子對接的方法研究受體蛋白EGFR、TP53、AKT1 與ACR 配體小分子之間的結(jié)合模式。EGFR 與與VCR 配體小分子結(jié)合能為-7.66 kJ/mol，TP53 與VCR 配體小分子結(jié)合能為-7.89 kJ/mol，AKT1 與與VCR 配體小分子結(jié)合能為-5.07 kJ/mol，由此可見VCR 與三個靶蛋白結(jié)合能均小于-5 kJ/mol，表明具有較好的結(jié)合能力。見表1。

表1 長春新堿與核心靶點分子對接結(jié)果

3 討論

近年來，從基礎(chǔ)研究到臨床觀察多項證據(jù)顯示，VCR 對于治療乳腺癌顯示了一定效果，不良反應(yīng)未見升高，可改善患者的生存質(zhì)量[4-5]，特別是VCR新型給藥系統(tǒng)的研究開發(fā)，如靶向制劑的研制，可降低VCR 毒副作用，提高治療效果[6-8]。

本 文 從Drugbank、Swiss Target Prediction 及Stitch 數(shù)據(jù)庫共得到124 個成分靶點，通過GEO 基因芯片數(shù)據(jù)、CTD 和OMIM 數(shù)據(jù)庫共得到1003 個乳腺癌靶點，因此得到26 個VCR 治療乳腺癌潛在靶標(biāo)，建立PPI 網(wǎng)絡(luò)進行拓?fù)鋵W(xué)分析，獲得關(guān)鍵節(jié)點10個，分別是EGFR、TP53、AKT1 等。同時，對前三個核心治療靶點與VCR 進行分子對接，提示VCR 可能通過這些靶點起到治療乳腺癌的作用。EGFR 靶點對腫瘤生長、發(fā)展以及腫瘤干細(xì)胞的維持有著非常重要作用，EGFR 表達與乳腺癌患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分型相關(guān)[9-10]，在三陰型乳腺癌中的陽性表達率最高[11]，高表達也提示乳腺癌組織的惡性程度更高、侵襲性更強。TP53 能調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和避免細(xì)胞癌變發(fā)生，VCR 作用于乳腺癌p53 靶點，mRNA 和蛋白水平升高[12]，p53 參與乳腺癌的生物進程與信號通路，使其作為治療乳腺癌的生物標(biāo)志物和治療靶點成為可能[13-14]。AKT1 參與多種生物學(xué)過程，在乳腺癌浸潤進展過程中發(fā)揮重要作用[15]，雖未見文獻報道VCR 與此關(guān)鍵基因相關(guān)性，基于分子對接結(jié)果，很可能參與VCR 的體內(nèi)作用效應(yīng)機制。采用DAVID 數(shù)據(jù)庫對VCR 治療乳腺癌潛在靶標(biāo)進行GO 功能和KEGG 富集分析，得到140 個顯著條目和65 條顯著通路，主要涉及PI3K-Akt、ErbB、HIF-1 等信號通路。PI3K-Akt 信號通路涉及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種功能的調(diào)節(jié)，過度激活的PI3K-Akt 信號通路在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為治療的新興靶點。多個研究提示，PI3K-Akt 通路為治療乳腺癌的潛在靶標(biāo)[16-17]。以上的關(guān)鍵靶點如EGFR、AKT1 等可通過PI3K-Akt 通路，抑制細(xì)胞凋亡，VCR 可通過抑制PI3K-Akt 通路，可提高實體腫瘤對VCR 的敏感性[18-19]。ErbB 也是乳腺癌的一個重要分子標(biāo)志物和治療靶點，其異常激活可引起細(xì)胞生長增殖失控、惡性轉(zhuǎn)化及腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移[20]，乳腺癌c-ErbB-2 陽性表達率較高，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤標(biāo)志物水平相關(guān)[21]。HIF-1 也參與腫瘤細(xì)胞的增殖、對抗凋亡和耐藥等重要過程[22]，是VCR 治療乳腺癌潛在靶點的信號通路，尚需實驗驗證。

綜上所述，本研究篩選了VCR 作用靶點和乳腺癌靶點，得到VCR 治療乳腺癌的靶點，分析了VCR治療乳腺癌的生物學(xué)功能和作用信號通路，為進一步探討VCR 抗乳腺癌作用分子機制及靶點提供思路。