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    土茯苓總黃酮治療自身免疫性前列腺炎模型大鼠作用機制研究

    2022-10-25 02:01:32馬天紅嚴禮劍王曉庭赫艷梅
    浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志 2022年10期
    關鍵詞:土茯苓前列腺炎免疫性

    盛 濤 馬天紅 嚴禮劍 邵 歡 王曉庭 赫艷梅

    慢性前列腺炎是常見的男性泌尿系統(tǒng)疾病,影響患者生活質(zhì)量。土茯苓味甘、淡,性平,有解毒、除濕、通利關節(jié)之功效,主要用于筋骨疼痛、濕熱淋濁、帶下、癰腫、瘰疬、疥癬[1]。研究表明,土茯苓具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)等作用[2]。慢性前列腺炎在中醫(yī)屬“精濁”范疇,其病機主要為濕熱、腎虛、瘀血[3]。臨床觀察表明,濕熱瘀阻型慢性前列腺炎最為多見[4]。本實驗檢測SD 大鼠前列腺組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度,結(jié)合前列腺組織的病理學,探討土茯苓總黃酮對自身免疫性前列腺炎模型大鼠的干預作用及機制。

    1 實驗材料

    1.1 動 物 8 周齡雄性SD 大鼠60 只,SPF 級,體質(zhì)量200~220 g[上海斯萊克,SCXK(滬)2013-0016];飼養(yǎng)環(huán)境:浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心[SYXK(浙)2018-0012];溫度(22±2)℃,濕度50%~60%,采用12 h 晝夜節(jié)律,自由飲水與進食下飼養(yǎng)。實驗開始前大鼠進行適應性喂養(yǎng)1 周,實驗完全遵照動物實驗的倫理要求進行。

    1.2 藥 物 土茯苓(浙江國藥有限公司,批號20190049);土茯苓總黃酮對照品(武漢中標科技有限公司,批號CFN98643);阿司匹林片(丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限公司,批號20190501);百白破疫苗(成都生物制品研究所,批號S10970019)。

    1.3 試 劑 Mouse IL-1beta Platinum Elisa(美國eBioscience 公司,批號147435043),Mouse IL-6 Platinum Elisa(美國eBioscience 公司,批號145466066),Mouse TNF-alpha Platinum Elisa(美國eBioscience公司,批號147819025)。10%甲醛(蘇州市三杰化學品科技有限公司,批號20160418);曙紅Y 生物染色劑(國藥集團化學試劑有限公司,批號20140909);無水蘇木色精(國藥集團化學試劑有限公司,批號20171A);水為超純水,乙腈、甲醇為色譜純,其余試劑為分析純。

    1.4 主要儀器 MR-4100 酶標儀(美國Dynatech 公司);D-37520 高速低溫離心機(賽默飛世爾科技公司);ASP300S 全自動組織脫水機(Leica 公司);RM2235 石蠟切片機(Leica 公司);DM3000 LED 顯微鏡(Leica 公司);BT125d 電子天平(Sartorius 公司)。

    2 實驗方法

    2.1 供試藥物制備 土茯苓總黃酮由本實驗室提取[5]。取土茯苓飲片粉碎后過篩,75%乙醇溶劑浸泡30 min,采用300 W/55 kHz 超聲波輔助提取20 min,提取液旋蒸后冷凍干燥,得到土茯苓提物。采用高效液相色譜(HPLC)測定土茯苓提物中總黃酮(TFSG)成分含量[1]。

    2.2 造模與分組 采用純化前列腺蛋白刺激法制備大鼠自身免疫性前列腺炎模型[6],SD 大鼠60 只,經(jīng)過7 d 適應性喂養(yǎng)后按照隨機數(shù)字表法分成空白組、模型組、阿司匹林組、土茯苓總黃酮低、中、高劑量組,每組10 只。將大鼠麻醉后,腹腔注射百白破疫苗0.5 mL,皮下多點注射前列腺蛋白提純稀釋液與完全弗氏佐劑(FCA)混合乳劑(1∶1 體積)1 mL。30 d 后,重復1 次,即可誘導產(chǎn)生大鼠自身免疫性前列腺炎癥,對照組注射等體積生理鹽水。造模成功后按劑量低中高組分別灌胃100、300 及500 mg/kg 的土茯苓總黃酮,空白組、模型組給予相同體積生理鹽水,阿司匹林組給予100 mg/kg 阿司匹林混懸液[7],每天1次,連續(xù)給藥15 d。實驗結(jié)束后于末次灌胃2 h 后脫頸處死大鼠,解剖分離大鼠前列腺組織為測定樣本。

    2.3 ELISA 法測定前列腺組織勻漿IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平 取樣本前列腺組織,加入0.5 mL 預冷的生理鹽水,組織均漿儀均漿,置于1.5 mL EP 離心管中,2000 r/min 低溫離心15 min 后移液槍收集上清液。分別按試劑盒說明書測定其IL-1β、IL-6、TNF-α 的ELISA 濃度,以計算大鼠前列腺炎性因子生成抑制率。炎性因子生成抑制率=(模型組炎性細胞因子表達-阿司匹林組炎性細胞因子表達)/模型組炎性細胞因子表達×100%。

    2.4 HE 染色檢測大鼠前列腺組織病理學 大鼠前列腺組織10%甲醛溶液固定72 h 后石蠟包埋,切片(厚度4 μm),HE 染色后觀察病理變化,以評估前列腺炎癥情況。

    2.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù);數(shù)據(jù)分析采用回歸/擬合計算軟件處理,符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差()表示;多組間比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行檢驗,兩兩比較采用SNK 檢驗方法,P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

    3 實驗結(jié)果

    3.1 土茯苓總黃酮對前列腺組織勻漿IL-1β、IL-6和TNF-α 水平的影響 與空白組比較,各實驗組大鼠前列腺組織IL-1β 水平明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P 均<0.05);土茯苓總黃酮低劑量組和模型組IL-6 水平明顯高于空白組(P<0.05);土茯苓總黃酮低劑量組及模型組間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);阿司匹林組與空白組TNF-α 水平相近(P>0.05),其余四組TNF-α 水平均高于空白組(P 均<0.05);與模型組比較,除土茯苓總黃酮低劑量組外,其余各實驗組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P 均<0.05);土茯苓總黃酮高劑量組IL-6 水平與阿司匹林組相近(P>0.05)。土茯苓總黃酮低、中、高劑量組間IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠前列腺組織勻漿IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較(ng/L,)

    表1 各組大鼠前列腺組織勻漿IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較(ng/L,)

    注:空白組和模型組予生理鹽水灌胃;土茯苓總黃酮低、中、高劑量組分別予100、300 及500 mg/kg 的土茯苓總黃酮溶液灌胃;阿司匹林組給予100 mg/kg 阿司匹林溶液灌胃;IL-1β 為白細胞介素1β;IL-6 為白細胞介素6;TNF-α 為腫瘤壞死因子α;與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與總黃酮中劑量組比較,cP<0.05;與總黃酮高劑量組比較,dP<0.05

    3.2 土茯苓總黃酮對模型大鼠前列腺形態(tài)組織學影響 空白組大鼠前列腺其腺腔結(jié)構(gòu)完整,腺泡上皮細胞一般為單層柱狀或立方狀上皮,腺腔形態(tài)不一,無或少量炎性細胞浸潤及水腫。模型組大鼠前列腺存在部分腺腔萎縮,基底膜破壞嚴重,腺上皮多為扁平狀,腺腔內(nèi)分泌物顯著減少,大量炎性細胞浸潤及水腫,可見大量成纖維細胞。阿司匹林及土茯苓高劑量組鏡下表現(xiàn)相近,其前列腺組織趨于正常,前列腺腺腔結(jié)構(gòu)完整,腺泡上皮可見少量增生,存在少量炎性細胞浸潤,偶見成纖維細胞。土茯苓中劑量組大鼠前列腺腺體組織少部分腺腔萎縮,少部分基底膜被破壞,少量炎性細胞浸潤,可見少量成纖維細胞。土茯苓低劑量組大鼠前列腺組織部分腺腔萎縮,基底膜部分破壞,較多的炎性細胞浸潤及纖維組織增生。見圖1。

    4 討論

    研究表明,炎癥因子在自身免疫性前列腺炎的病理機制中起到非常關鍵的作用[8];其中,IL-1β 和TNF-α 是自身免疫性前列腺炎的病理發(fā)展過程中的重要促炎因子,而IL-6 則能夠調(diào)節(jié)IL-2 及IL-1β和TNF-α 的合成[9]。

    一般認為,IL-1β 作為最經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)劑,是炎癥調(diào)節(jié)的始動因素[10]。本實驗模型組大鼠前列腺組織IL-1β 表達明顯上調(diào),土茯苓總黃酮各組及阿司匹林組前列腺組織IL-1β 表達存在不同程度的下降。這進一步證明了自身免疫性前列腺炎造模行為激活了炎性反應的發(fā)生,使IL-1β 表達上調(diào),從而促使前列腺組織炎癥進展。IL-6 在自身免疫性前列腺炎的炎癥進展過程中發(fā)揮著重要的作用,慢性前列腺炎前列腺腺體組織IL-6 表達明顯升高[9]。本實驗中,模型組前列腺組織IL-6 的明顯升高,表明土茯苓總黃酮高劑量組及中劑量組對前列腺組織IL-6有不同程度的抑制作用,其中,土茯苓總黃酮高劑量組與阿司匹林組的抑制水平接近。

    研究證明,TNF-α 等炎癥因子在身免疫性前列腺炎患者體內(nèi)呈現(xiàn)過高的表達[11]。本實驗發(fā)現(xiàn),模型組大鼠前列腺組織TNF-α 明顯上升,土茯苓總黃酮低、中、高劑量組及阿司匹林組TNF-α 表達均明顯下降(P 均<0.05),表現(xiàn)為相對較低的TNF-α 水平。表明土茯苓總黃酮能明顯降低TNF-α 表達。

    綜上所述,本實驗結(jié)果顯示,土茯苓總黃酮能降低自身免疫性前列腺炎模型大鼠前列腺組織IL-1β、IL-6 及TNF-α 表達水平,改善前列腺病理形態(tài),從而減輕前列腺組織的炎癥反應。

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