基于SRAP 標(biāo)記研究石竹屬植物遺傳多樣性

王 晶，李 建，史根生，郝華正，冀中銳，邢國明

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所，汾陽 032200；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801)

石 竹 屬（DianthusL. ） 為 石 竹 科（Caryophyllaceae）一、二年生或多年生草本。石竹屬植物遺傳多樣性豐富，全球共約600 余種，中國有近20 種石竹屬植物，多分布于北方草原和山區(qū)草地[1-2]。石竹屬花卉植物花色艷麗、花期長，具有較高的觀賞價(jià)值，同時(shí)具有較強(qiáng)的耐旱、耐寒和耐熱性，是極為寶貴的基因資源[3]。香石竹（Dianthus caryophyllusL.）是世界四大切花之一，在花卉市場中占有重要地位[4-6]；常夏石竹（Dianthus plumariusL.）繁殖能力強(qiáng)，生長迅速，可有效防止土壤沖刷和水土流失，是重要的綠化環(huán)保植物；石竹（Dianthus chinensisL.）花色繁多，且根和全草入藥清熱利尿、散淤消腫，具有寶貴的藥用價(jià)值和觀賞價(jià)值；瞿麥（Dianthus superbusL.）也可全草入藥，有清熱利尿、破血通經(jīng)功效，同時(shí)也可做農(nóng)藥，能殺蟲[7-10]；須苞石竹（Dianthus barbatusL.）色彩艷麗、芬芳馥郁，是切花的重要來源，同時(shí)也可吸收二氧化硫和氯氣等有害氣體，凈化空氣，是重要的綠化植物[11]。

通過種間雜交聚合各物種的優(yōu)異性狀是石竹屬花卉常用的育種策略，石竹屬種間親緣關(guān)系直接影響種間雜交效果[12-13]。分子標(biāo)記作為強(qiáng)有力的生物學(xué)研究工具，被廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定與保護(hù)、品種選育、分子機(jī)理研究等方面[14-17]，它可有效地鑒定出植物的親緣關(guān)系，從而使育種工作者更好地制定出雜交育種計(jì)劃[18-20]。常用的分子標(biāo)記有3 代，一代的RFLP、AFLP、SRAP 等標(biāo)記，二代的SSR和InDel 標(biāo)記，三代的SNP 標(biāo)記。SNP 標(biāo)記作為最新的標(biāo)記，基因組分布密度高，易于高通量分型檢測，備受基因定位等研究工作者青睞，但其單標(biāo)記多態(tài)信息較低，用于遺傳背景分析上略有不足；SSR標(biāo)記多態(tài)信息較高，但等位基因型間的差異較小，給分析帶來不便；InDel 標(biāo)記雖然在等位基因型間差異大，但基因組密度較低，也不利于做遺傳背景分析。SRAP 標(biāo)記既有較高多態(tài)信息，又易于區(qū)分差異，同時(shí)基因組密度適中，適合用于遺傳背景分析。

目前，有關(guān)石竹屬植物的親緣關(guān)系分子研究較少，已有報(bào)道僅在新疆等部分地區(qū)和部分栽培品種上，有關(guān)山西地區(qū)及野生材料的背景研究更為罕見。本研究利用SRAP標(biāo)記對(duì)采自中國山西省14個(gè)地區(qū)的13 份野生石竹種質(zhì)和7 份野生瞿麥種質(zhì)以及24份常見的香石竹、常夏石竹和須苞石竹品種進(jìn)行了種間和種內(nèi)的遺傳多樣性分析，以期為石竹屬花卉品種保護(hù)與鑒定、雜交育種及分子機(jī)理研究提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 種植資源收集

石竹屬供試材料共44 份，包含13 份野生石竹種質(zhì)和7 份野生瞿麥種質(zhì)以及24 份常見的香石竹、常夏石竹和須苞石竹品種。在山西省從南到北選擇15 個(gè)采樣點(diǎn)，詳見表1 和表2，從市場收集了24個(gè)常見的香石竹、常夏石竹和須苞石竹品種（表2）。

表1 野生石竹和野生瞿麥采集點(diǎn)地理信息Table 1 The geographic information about the collected D. chinensis and D. superbus

表2 參試樣本信息Table 2 Information of samples

1.2 試驗(yàn)方法

用CTAB 法提取石竹基因組DNA，通過濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA 純度及完整性檢測。提取后的DNA 溶于1×TE buffer，并保存在-20 ℃冰箱中備用。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，其中各成分濃度及體積分別為2×PCR Mix 為10 μL，引物（25 μmol·L-1）為2 μL，DNA（20 ng·μL-1）為2 μL，ddH2O為6 μL。PCR 反應(yīng)程序包含5 個(gè)步驟：①預(yù)變性步驟：94 ℃變性5 min（1 個(gè)循環(huán)）；②預(yù)擴(kuò)增步驟：94 ℃變性1 min，35 ℃退火1 min，72℃延伸80 s（共5 個(gè)循環(huán)）；③延伸步驟：72 ℃延伸10 min；④再次擴(kuò)增步驟：94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸80 s（共37 個(gè)循環(huán)）；⑤再次延伸步驟：72 ℃延伸12 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，利用6%的PAGE 凝膠電泳對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行帶型檢測，并通過銀染拍照保存。PCR Mix 反應(yīng)試劑采購于康為世紀(jì)生物科技有限公司，引物由本實(shí)驗(yàn)室自主開發(fā)[21]，序列見表3, 引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

表3 SRAP 引物序列[21]Table 3 Sequences of SRAP primers

通過對(duì)銀染后的照片進(jìn)行產(chǎn)物的帶型統(tǒng)計(jì)，SRAP 標(biāo)記為顯性標(biāo)記。為方便記錄和分析，將各標(biāo)記的基因型的有無記錄為A 和B，生成44 份樣本的指紋圖譜，遺傳距離使用軟件NTSYSpc-2.0 進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取與PCR 產(chǎn)物檢測

經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用CTAB 法提取的石竹材料DNA 帶型清晰、無拖尾，同時(shí)亮度非常高，表明本試驗(yàn)所用DNA 濃度高、完整性好，滿足后續(xù)PCR 實(shí)驗(yàn)要求（圖1a）。使用上述DNA對(duì)88 對(duì)SRAP 引物進(jìn)行擴(kuò)增效果鑒定，最終篩選出20 對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、特異性高，可用于后續(xù)指紋圖譜分析（表4 和圖1b）。

表4 20 對(duì)SRAP 引物擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性信息統(tǒng)計(jì)Table 4 Polymorphism information statistics of 20 pairs of SRAP primers’ amplification products

2.2 指紋圖譜分析

經(jīng)統(tǒng)計(jì)，上述20 對(duì)特異性引物擴(kuò)增出了518 個(gè)條帶，平均條帶數(shù)為每對(duì)25.9 條，平均多態(tài)性條帶為每對(duì)20.7 條，多態(tài)性比率均值為78.9%，分辨力為35.6%～100%。其中，引物組合Me-8/EM-3 的多態(tài)性最高，可區(qū)分全部44 份石竹樣品（表4）。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，將引物組Me-8/EM-3 基因型的有無轉(zhuǎn)化為字母A 和B，形成每個(gè)樣本的指紋圖譜（表5）。

表5 ME-8/EM-3 建立的44 個(gè)樣品的指紋圖譜Table 5 Fingerprints of 44 salvia varieties established by the primer group of ME-8/EM-3

2.3 遺傳多樣性分析

根據(jù)SRAP 引物擴(kuò)增的414 條多態(tài)性條帶，對(duì)44 個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析。 Jaccardp’s 相似系數(shù)在0.73 ～ 0.98 之間。在相似系數(shù)0.79 的水平上，可以將材料分為5 個(gè)類群：第1 個(gè)類群為五彩石竹的7 個(gè)品系和須苞石竹的2 個(gè)樣品；第2 類群為野生石竹的13 個(gè)樣品；第3 類群為野生瞿麥的7 個(gè)樣品；第4 類群為香石竹的7 個(gè)樣品；第5 類群為常夏石竹的8 個(gè)樣品（圖2）。由聚類結(jié)果可知，物種差異是石竹屬植物類群劃分的主要因素。五大類群中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的親緣關(guān)系比較近，與Ⅴ的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。從形態(tài)特征觀察，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ的莖均為疏叢生，而Ⅴ的莖為密叢生；Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ之間的親緣關(guān)系又較Ⅳ為近，從株型特征觀察，Ⅳ的植株較高，而Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的植株較矮；Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中，Ⅱ、Ⅲ之間的親緣又較Ⅰ為近，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在形態(tài)學(xué)上相似，但Ⅱ、Ⅲ為野生石竹和野生瞿麥，而Ⅰ為園藝開發(fā)程度較高的栽培品種（圖2）。

Ⅰ類群均為五彩石竹和須苞石竹。根據(jù)聚類結(jié)果分析，這一類群的聚類是根據(jù)種類和花色來劃分的。其中，五彩石竹為第一類群，須苞石竹為第二類群。第一類群中白粉雙色、淡粉色、粉色白邊和玫粉色等4 個(gè)五彩石竹為一小類群；白色、紅色和紅色粉邊等3 個(gè)五彩石竹為一小類群。初步分析認(rèn)為：白色和紅色均為純色而粉色是調(diào)和色，所以白色和紅色聚為一類，粉色聚為一類。在粉色類型中，花色較淡的白粉雙色和淡粉色五彩石竹的親緣關(guān)系比較近，花色較深的粉色白邊和玫粉色五彩石竹的親緣關(guān)系比較近。

Ⅱ類群為野生石竹。根據(jù)聚類結(jié)果分析，這一類群的聚類是根據(jù)地域分布來劃分的（圖3）。其中霍州市七里峪、太谷縣窯子頭和沁水縣歷山的野生石竹聚為第一小類群，原平市云中山、平魯區(qū)打草坪、大同市紅石崖、渾源縣恒山和天鎮(zhèn)縣黑龍寺的野生石竹聚為第二小類群，嵐縣黑茶山、交城縣龐泉溝、方山縣北武當(dāng)山、寧武縣大石洞和五臺(tái)縣五臺(tái)山的野生石竹聚為第三小類群。第一小類群分布于山西省中南部，緯度較低；第二小類群分布于山西省北部，緯度較高；第三小類群分布于山西省中部。第一、二小類群之間的親緣關(guān)系比較近，與第三小類群的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。初步分析認(rèn)為：是由于一、二小類群分布在太行山區(qū)，而第三小類群分布在呂梁山區(qū)。

同樣，Ⅲ類群為野生瞿麥。根據(jù)聚類結(jié)果分析，這一類群的聚類是根據(jù)地域分布來劃分的（圖3）。其中分布于山西南部的沁水縣歷山、芮城縣百梯山、陵川縣王莽嶺的野生瞿麥為第一小類群，分布于山西中北部的龐泉溝、大石洞、云中山和五臺(tái)山的野生瞿麥為第二小類群。

Ⅳ類群均為香石竹園藝品系。根據(jù)聚類結(jié)果分析，這一類群的聚類是根據(jù)品種類型劃分的。其中紫色白邊矮生康乃馨為第一類群，粉色康乃馨、桔黃色康乃馨、桔紅色康乃馨、紫色康乃馨、紅色康乃馨和白色紫邊康乃馨等為第二類群。初步分析認(rèn)為：紫色矮生康乃馨是山西長期栽培的矮生盆栽品種，而其他6 個(gè)均為云南生產(chǎn)的鮮切花品種。

Ⅴ類群均為常夏石竹。根據(jù)聚類結(jié)果分析，4-10-1、大唐貴妃、塞外昭君、常夏石竹、雪域西施、雪原1 號(hào)和月中嫦娥等7 個(gè)品種和品系為第一小類群，翡翠為第二小類群。初步分析認(rèn)為：Ⅴ類群均為山西省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所從同一親本選育的品種和品系，而翡翠石竹為該類型中的少花突變株系。

3 討論與結(jié)論

PCR技術(shù)的出現(xiàn)，打開了人們研究基因的天梯。分子標(biāo)記具有不受環(huán)境和生長階段影響、檢測效率高、檢測準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)，廣受植物品種保護(hù)、品種選育以及分子機(jī)制研究人員的青睞。本研究從88對(duì)SRAP 引物篩選得到20 對(duì)高鑒別力的引物，并以此對(duì)44 份石竹樣本進(jìn)行基因型檢測。根據(jù)遺傳距離分析結(jié)果，該20 對(duì)引物組合可有效地區(qū)分44 份石竹屬樣本。因此，該20 對(duì)高鑒別力引物組合可以為石竹屬植物品種保護(hù)與鑒定、育種應(yīng)用提供可靠的標(biāo)記基礎(chǔ)。物種差異是石竹屬植物劃分的主要因素。生境條件是野生石竹和野生瞿麥種內(nèi)類群劃分的主要因素，育成品種的種內(nèi)劃分則主要依據(jù)花色與株型差異。石竹屬植物遺傳變異較高，同時(shí)具有高抗病性和高逆境適應(yīng)性，是我國植物育種和品種改良的重要資源。

傅小鵬利用ISSR 和SRAP 標(biāo)記分析了24 個(gè)石竹自交系的遺傳多樣性，系統(tǒng)分析了栽培的雜種優(yōu)勢和遺傳背景關(guān)系[22]；董連新則對(duì)新疆地區(qū)的野生和育成材料進(jìn)行了遺傳背景分析[2]。本研究開發(fā)了一套高鑒別力的SRAP 分子標(biāo)記體系，并利用該套分子標(biāo)記構(gòu)建了44 份石竹屬花卉種質(zhì)的指紋圖譜，對(duì)山西地區(qū)石竹屬的主流育成品種和多點(diǎn)采集的野生材料進(jìn)行了系統(tǒng)性的遺傳背景分析。經(jīng)遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，物種和生境差異是石竹屬植物類群劃分的主要因素，為石竹屬植物種質(zhì)資源鑒別與保護(hù)、品種選育以及分子機(jī)理研究提供了技術(shù)支撐和理論基礎(chǔ)。