基于氣相離子遷移譜技術(shù)的不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性物質(zhì)分析

甘 爽， 陳志丹， 商 虎，3， 林 琳，3， 孫威江*，3

（1．福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2．福建農(nóng)林大學(xué) 安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3．福建省茶產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

烏龍茶是我國六大茶類之一，屬半發(fā)酵茶，是我國的特色茶之一，因其特有的花香及醇厚鮮爽等風(fēng)味品質(zhì)而馳名中外。烏龍茶起源于我國福建，主產(chǎn)于我國的福建、廣東和臺灣地區(qū)，由于產(chǎn)地、茶樹品種和氣候條件等因素的不同，形成了各產(chǎn)地烏龍茶風(fēng)格特異的風(fēng)味特征[1]?，F(xiàn)階段，茶葉感官審評是評價茶葉品質(zhì)最普遍、最直觀的方式[2]，是依靠人的感官對茶葉品質(zhì)的綜合判定，而茶葉香氣占茶葉品質(zhì)感官評分的30%[3]，由此可見，茶葉香氣是茶葉感官品質(zhì)評價的一個重要指標(biāo)[4]，而揮發(fā)性化合物不僅是茶葉香氣的重要組分，也是影響茶葉感官品質(zhì)的重要因素。傳統(tǒng)的香氣評分方式，很大程度上依賴于專業(yè)評茶師的個人喜好和自身經(jīng)驗(yàn)，且容易受環(huán)境、情緒等諸多因素的影響，審評結(jié)果較為主觀，很難被廣大消費(fèi)者所接受。而茶葉揮發(fā)性物質(zhì)相關(guān)的理化指標(biāo)檢測，一般采用常規(guī)的物理化學(xué)分析法和儀器分析法[5-9]，雖然這些方法較為客觀，但步驟復(fù)雜、耗時長，無法對茶葉的揮發(fā)性化合物指標(biāo)進(jìn)行快速檢測，因此迫切需要尋找一種客觀且快速、無損的技術(shù)對茶葉揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。

離子遷移譜（ion mobility spectrometry，IMS）是基于氣相中不同的氣相離子在電場中遷移速度的差異來對化合物進(jìn)行定性分析的一項(xiàng)技術(shù)，是一種快捷的檢測分析手段[10]，與傳統(tǒng)GC-MS分析方法相比，GC-IMS技術(shù)不需要對樣品進(jìn)行前處理，具有檢測限低、簡單易用、耗時短、成本低等特點(diǎn)，離子遷移譜已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，如油類的真假鑒別[11-13]、咖啡豆鑒別及儲藏時間鑒定[14]、食品風(fēng)味分析[15-23]。林若川等通過GC-IMS技術(shù)對云霧茶、翠尖茶和龍井茶進(jìn)行產(chǎn)地判別，但該技術(shù)在我國廣東、福建、臺灣地區(qū)所產(chǎn)烏龍茶香氣區(qū)分方面的研究尚未見報道[24]。因此，采用GC-IMS技術(shù)對我國廣東、閩南地區(qū)、閩北地區(qū)、臺灣地區(qū)不同產(chǎn)地烏龍茶中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行快速檢測，并通過PCA、PLS-DA法對烏龍茶產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分，為烏龍茶揮發(fā)性物質(zhì)的快速檢測提供新的解決方式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

烏龍茶選自國際標(biāo)準(zhǔn)烏龍茶工作組（ISO/TC34/SC8/WG7）采集的烏龍茶樣品，均為2018年的春茶。如表1所示，選取我國最具代表性的4個產(chǎn)地（分別為廣東、閩南地區(qū)、閩北地區(qū)、臺灣地區(qū)）的烏龍茶樣品，其中廣東烏龍茶8個、閩南地區(qū)7個、閩北地區(qū)8個、臺灣地區(qū)6個，共對29個烏龍茶樣品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)分析。

表1 我國不同產(chǎn)地烏龍茶樣品信息Table 1 Information of oolong tea samples from different origins in China

Flavour Spec?風(fēng)味分析儀：濟(jì)南海能儀器股份有限公司產(chǎn)品；FW高速粉碎機(jī)：上海鼎廣機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FA1004電子天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 審評方法由3名具備5年以上專業(yè)描述性審評經(jīng)驗(yàn)的專家，4名具備3年以上審評經(jīng)驗(yàn)的高級評茶員，合計7名審評人員，按照GB/T 23776—2018進(jìn)行感官審評，并對香氣進(jìn)行評分。

1.2.2 香氣檢測方法被分析的茶葉樣品于室溫下密封儲存，檢測前將茶樣用高速粉碎機(jī)磨碎并過80目篩，置于-20℃保存。檢測前用電子天平將每個樣品稱取0.2000 g，分別置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中并密封，樣品瓶按順序排列待檢，每個樣品重復(fù)3次。設(shè)置好儀器參數(shù)后，儀器按程序自動工作，分析前10 min儀器將樣品瓶移至孵化區(qū)加熱并振蕩，進(jìn)樣針抽取500 μL頂空瓶內(nèi)的氣體，注入色譜柱進(jìn)行分析。

色譜柱：FS-SE-54-CB-1；漂移氣：高純氮?dú)?，純度?9.999%；漂移氣流量：150 mL/min；色譜柱溫度：60℃；進(jìn)樣口溫度：80℃；IMS探測器溫度：45℃；漂移管溫度：40℃；頂空進(jìn)樣針溫度：90℃；進(jìn)樣量：500 μL；孵化轉(zhuǎn)速：500 r/min；頂空孵化溫度：70℃；孵化時間：10 min；分析時間：30 min；高純氮?dú)猓兌取?9.999%）清洗頂空針時間：5 min；載氣流量程序：起始流量2 mL/min，保持2 min后10 min內(nèi)線性增加至10 mL/min，保持10 min后30 min內(nèi)線性增加至130 mL/min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用儀器自帶的Laboratory Analytical Viewer分析軟件中的兩款插件（Reporter插件、Gallery Plot插件）以及GC×IMS Library Search對樣品進(jìn)行定性、定量分析。采用Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計。采用SIMCA 14.1進(jìn)行PCA、PLS-DA分析。使用Python進(jìn)行LDA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性化合物氣相離子遷移譜圖分析

IMS譜圖中的每個特征峰代表一種揮發(fā)性有機(jī)成分，不同揮發(fā)性物質(zhì)在相應(yīng)位置有對應(yīng)的信號峰，我國不同產(chǎn)地的烏龍茶揮發(fā)性物質(zhì)的出峰位置、數(shù)量大致相同，但各自含量有所差異。根據(jù)差譜原則，選擇揮發(fā)性成分較少的臺灣地區(qū)烏龍茶樣品作為參照進(jìn)行差譜分析，結(jié)果見圖1。4個產(chǎn)地烏龍茶樣品的譜圖中，同一組分含量相同的部分顏色抵消為白色，紅色則表示該揮發(fā)性物質(zhì)的含量比參比樣品高，藍(lán)色則表示該揮發(fā)性物質(zhì)的含量比參比樣品低。在臺灣地區(qū)烏龍茶的樣品中，紅框部分揮發(fā)性物質(zhì)明顯低于其他3個產(chǎn)地烏龍茶，說明各揮發(fā)性物質(zhì)的含量受產(chǎn)地影響。

圖1 不同產(chǎn)地烏龍茶樣品的GC-IMS差異圖譜Fig.1 GC-IMS differential atlas of oolong tea samples from different origins

2.2 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性化合物定性分析

從GC-IMS Library Search中利用離子遷移時間以及保留指數(shù)對揮發(fā)性化合物進(jìn)行了定性，這些物質(zhì)保留時間相近，但遷移時間有所不同。樣品的揮發(fā)性化合物定性分析結(jié)果見圖2。

圖2 烏龍茶中揮發(fā)性化合物信號峰位置點(diǎn)Fig.2 Signal peaks of volatile compounds in oolong tea

表2中列出了檢測樣品中所有已鑒定的物質(zhì)，檢出的43種物質(zhì)可歸為9類，包含1種酚類、1種碳?xì)浠衔铩?種雜氧化合物、2種吡咯類、2種酯類、5種酸類、6種酮類、11種醇類和13種醛類。

表2 不同產(chǎn)地烏龍茶中揮發(fā)性物質(zhì)的定性Table 2 Volatile compounds identified by GC-IMS of oolong tea from different origins

續(xù)表2

2.3 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的指紋圖譜分析

使用Gallery Plot插件生成不同產(chǎn)地烏龍茶的指紋圖譜（見圖3），橫軸方向?yàn)闃?biāo)記的特征離子峰，從左往右依次排列，其中每一行代表一個揮發(fā)性化合物，每一列表示不同樣品之間同一種揮發(fā)性化合物的對比。特征離子峰顏色的深淺程度代表揮發(fā)性化合物含量的高低，顏色越亮，含量越高，反之，則越低。根據(jù)圖譜能對不同烏龍茶之間揮發(fā)性化合物差異進(jìn)行直觀比較。如圖3所示，我國不同產(chǎn)地烏龍茶樣品差異顯著，如廣東烏龍茶中2-乙基吡嗪、檸檬烯、2，6-二甲基吡嗪含量較高；閩南地區(qū)烏龍茶中苯甲醛、辛醛、庚醛、己醛、正丁酸、反-2-庚烯醛、3-辛酮含量較高；閩北地區(qū)烏龍茶中對乙基苯酚、癸醛、2-庚酮、反-2，4-庚二烯醛、γ-丁內(nèi)酯、5-甲基糠醛、反-2-辛烯醛、苯乙醇、2-甲基丁醇、甲基苯甲醇、順-3-壬烯醇含量較高；臺灣地區(qū)烏龍茶中2-庚酮、糠醛、γ-丁內(nèi)酯、2-乙?；秽⑽齑?、乙酸、正己醛、2-己酮、戊醛、丙酸含量較高。

圖3 我國烏龍茶中揮發(fā)性化合物的指紋圖譜Fig.3 Fingerprints of volatile compounds in oolong tea in China

2.4 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的主成分分析

不同揮發(fā)性物質(zhì)的特征峰對應(yīng)不同的響應(yīng)強(qiáng)度，這些特征峰強(qiáng)度能反映茶葉樣品之間的差異。根據(jù)指紋圖譜，可直接觀察特征峰的顏色亮度對不同產(chǎn)地烏龍茶進(jìn)行區(qū)分，但為了避免直接觀察過于主觀，利用Laboratory Analytical Viewer分析軟件中的插件讀取各個揮發(fā)性化合物的峰值強(qiáng)度，將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行量化，進(jìn)行PCA分析，從而對不同烏龍茶樣品進(jìn)行產(chǎn)地區(qū)分，結(jié)果見圖4。其中PC1的貢獻(xiàn)率為54.2%，PC2的貢獻(xiàn)率為19.4%，累計貢獻(xiàn)率為73.6%。4個產(chǎn)地的烏龍茶樣品基本能夠區(qū)分開，說明該技術(shù)能有效區(qū)分不同產(chǎn)地的烏龍茶。同時，因?yàn)椴煌a(chǎn)地間烏龍茶制作工藝的相似性，使得組別間有較為接近的部分，這一點(diǎn)在圖4也有體現(xiàn)；此外，組內(nèi)的樣品，雖屬同一個產(chǎn)地，但由于品種差異等因素，使得其自身品質(zhì)也有所差異，致使數(shù)據(jù)點(diǎn)也相對離散。

圖4 烏龍茶樣品GC-IMS特征變量的主成分分析Fig.4 PCA of GC-IMS characteristic variables of oolong tea samples

表3 我國不同產(chǎn)地烏龍茶的特征揮發(fā)性物質(zhì)Table 3 Characteristic volatile matter of oolong tea from different producing areas in China

2.5 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的偏最小二乘法判別分析

PLS-DA是一種聚類分析方法，通過擴(kuò)大組間差異、減少組內(nèi)差異，可以彌補(bǔ)PCA的缺點(diǎn)。其中PC1的貢獻(xiàn)率為54.2%，PC2的貢獻(xiàn)率為19.3%，累計貢獻(xiàn)率為73.5%。圖5（a）證明該研究能將不同地區(qū)烏龍茶樣品很好地區(qū)分開，圖5（b）說明該模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，穩(wěn)定性較好，具有較好的預(yù)測能力。

因子載荷圖反映了每個變量對得分圖的貢獻(xiàn)，圖5（c）中每個點(diǎn)代表一種揮發(fā)性化合物，可通過它們與原點(diǎn)之間的距離來評估這些物質(zhì)對產(chǎn)地判別的貢獻(xiàn)度。變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）是通過PLS-DA載荷圖判別所得，通過VIP＞1共篩選出16種標(biāo)志揮發(fā)性化合物，見圖5（d）。篩選出的標(biāo)志揮發(fā)性化合物在圖5（c）中以紅色標(biāo)注，這16種揮發(fā)性化合物分別是：反-2，4-庚二烯醛（8）、6-甲基-5-庚烯-2-酮（18）、糠醛（6）、丙醇（64）、反-2-己烯-1-醇（17）、2-甲基丙酸（13）、戊醇（23）、丙醇（63）、2-庚酮（3）、2-乙?；秽?5）、γ-丁內(nèi)酯（10）、正己醛（40）、5-甲基糠醛（20）、丙酸（53）、苯甲醛（22）、氧化芳樟醇（56），這些物質(zhì)對4個產(chǎn)地烏龍茶的區(qū)分有突出貢獻(xiàn)。

圖5 烏龍茶樣品GC-IMS特征變量的PLS-DA分析Fig.5 PLS-DA analysis of GC-IMS characteristic variables of oolong tea samples

2.6 不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性成分的線性判別分析

LDA是對費(fèi)舍爾的線性鑒別方法的歸納，這種方法使用統(tǒng)計學(xué)、模式識別和機(jī)器學(xué)習(xí)方法，試圖找到事件特征的一個線性組合，以能夠特征化或區(qū)分它們[10]。采用LDA算法進(jìn)一步研究烏龍茶產(chǎn)地識別的可能性，以我國4個不同產(chǎn)地的29個烏龍茶樣本建立對應(yīng)的產(chǎn)地判別模型。分別選取不同產(chǎn)地烏龍茶樣品數(shù)量的75%樣品作為訓(xùn)練集，剩余25%樣品量作為預(yù)測集，統(tǒng)計結(jié)果見表4，判別結(jié)果見圖6，準(zhǔn)確率均為100%，表明該模型穩(wěn)健、可靠。由此可知，采用LDA算法可以較好地用于對烏龍茶產(chǎn)地的判別。

圖6 我國不同產(chǎn)地烏龍茶樣品的LDA判別結(jié)果Fig.6 LDA discrimination of oolong tea samples from different areas in China

表4 LDA模型鑒別我國烏龍茶產(chǎn)地的統(tǒng)計結(jié)果Table 4 Statistical results of Chinese oolong tea identified by LDA model

3 結(jié)語

采用GC-IMS技術(shù)分析我國不同產(chǎn)地烏龍茶揮發(fā)性化合物的差異，對29個來自不同產(chǎn)地的烏龍茶樣品進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)檢測，鑒定出43種揮發(fā)性物質(zhì)，可分為9類，包含1種酚類、1種碳?xì)浠衔铩?種雜氧化合物、2種吡咯類、2種酯類、5種酸類、6種酮類、11種醇類和13種醛類。

由IMS圖譜可知，我國不同產(chǎn)地烏龍茶的揮發(fā)性物質(zhì)差異主要體現(xiàn)在含量上。由前人研究可知，輕火烘焙的烏龍茶一般帶有清香或淡花香；中火烘焙則帶有花香或花果香；足火烘焙后的烏龍茶具有明顯果香或果糖香；而高火烘焙則具有明顯焦糖香或火功香[25]。實(shí)驗(yàn)選擇的閩南地區(qū)烏龍茶以清香為主，焙火程度最輕，其次是廣東烏龍茶、臺灣地區(qū)烏龍茶，焙火溫度最高的則是閩北地區(qū)烏龍茶，產(chǎn)生這些香氣特征主要是由焙火溫度引起的，因此造成了4個產(chǎn)地烏龍茶風(fēng)格各異的香氣特征。這與該研究中檢測到的呈香揮發(fā)性物質(zhì)特征規(guī)律大體是一致的。檢測到呈柑橘香的檸檬烯在廣東烏龍茶中含量較高，與前人研究一致[26]。閩南地區(qū)烏龍茶是4個產(chǎn)地里焙火溫度最低的，具有青草香特征的庚醛、己醛、3-辛酮含量明顯高于其他產(chǎn)地的烏龍茶；臺灣地區(qū)烏龍茶中具有果香氣特征的2-己酮、丙酸、γ-丁內(nèi)酯、正己醛等含量較為突出。周雪芳研究表明，武夷巖茶隨著焙火溫度增加，茶葉中具有焙烤香的揮發(fā)性化合物增加[27]，如閩北地區(qū)烏龍茶具有烘烤香呈香特性的反-2，4-庚二烯醛、對乙基苯酚、5-甲基糠醛的信號峰較強(qiáng)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

根據(jù)特征峰的峰值強(qiáng)度數(shù)據(jù)結(jié)合PCA、PLSDA、LDA多元統(tǒng)計分析方法，不同產(chǎn)地烏龍茶能根據(jù)其揮發(fā)性化合物的含量進(jìn)行區(qū)分，說明該技術(shù)對區(qū)分產(chǎn)地有效，即檢出的各個物質(zhì)及其含量能有效代表烏龍茶產(chǎn)地信息，驗(yàn)證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性。因此，GC-IMS技術(shù)能有效且快捷地運(yùn)用于不同產(chǎn)地烏龍茶的區(qū)分。GC-IMS技術(shù)用于茶葉方面的研究較少，由于茶葉揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)據(jù)庫尚未完善，使得鑒別出的揮發(fā)性物質(zhì)不及GC-MS的多。查詢到的43種物質(zhì)僅是烏龍茶揮發(fā)性物質(zhì)的一部分，雖不能概括烏龍茶的整個揮發(fā)性物質(zhì)體系，但根據(jù)判別結(jié)果可知，具有代表性，且與GC-MS相比，該技術(shù)不用對樣品進(jìn)行前處理，檢測方法較簡單，表明GC-IMS技術(shù)在烏龍茶產(chǎn)地區(qū)分上仍有其特有的優(yōu)勢。