羊肉凍融過程中蛋白質(zhì)變性的DSC熱學分析

肖 宇， 古明輝， 張昊陽， 劉永峰

（陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，陜西 西安 710062）

冷凍肉在現(xiàn)代肉及肉制品加工工業(yè)中占據(jù)重要地位。隨著我國近幾年羊肉產(chǎn)值穩(wěn)步增長，羊肉市場需求量較大，為保證肉品質(zhì)，大部分的羊肉都是以冷凍的方式在市場流通[1-2]。雖然肉的凍藏能抑制絕大部分微生物的增殖、降低生物酶活性、延長貯藏期、保障肉品質(zhì)，以推進全球肉類商業(yè)化的進程，但在羊肉凍結過程中，冰晶體積增大時破壞細胞膜，引起解凍后汁液流失，蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分及眾多風味物質(zhì)損失，導致肉及肉制品的品質(zhì)降低[3-4]。更值得關注的是，由于羊肉在流通過程冷鏈不健全，凍藏運輸、包裝、零售前的修整及消費者購買后再次冷藏都會使羊肉有意或無意被多次凍融，特別在偏遠地區(qū)冷凍肉的儲運期間，凍融現(xiàn)象更嚴重[5]。此外，羊肉在凍融過程中，蛋白質(zhì)發(fā)生冷變性，主要有兩種類型：一是蛋白質(zhì)的聚集，凍結過程中冰晶的形成使水分子從親水基團上脫離，這些游離的功能基團相互作用，使蛋白質(zhì)分子聚集；二是蛋白質(zhì)多肽鏈的展開，高度水化的蛋白質(zhì)具有較高的焓值，凍結過程中冰晶形成促使多肽鏈水化程度降低，導致焓值降低[6]。并且，隨著凍融循環(huán)次數(shù)增加，蛋白質(zhì)冷變性作用隨之加劇，降低肉品質(zhì)[6-7]。因此，檢測凍融過程中蛋白變性情況對評價肉品質(zhì)具有重要意義。

差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法可用于表征食品物料的熱性能和熱反應，利用其檢測得到的熱轉變溫度和熱轉變對應的焓變，能對食品物料中的水分和蛋白質(zhì)活性狀態(tài)進行評估[8]。陳清敏探究了牛肉反復凍融后DSC曲線的變化，發(fā)現(xiàn)肌球蛋白變性程度隨著凍融次數(shù)增加而增加[9]；臺瑞瑞對比了黑鱸在緩凍和速凍后DSC曲線的變化，發(fā)現(xiàn)速凍對蛋白質(zhì)變性影響比緩凍小[10]；何向麗利用DSC法研究了不同解凍方法對豬里脊的影響，發(fā)現(xiàn)空氣解凍對蛋白質(zhì)變性的影響較小[11]。這些研究利用冰箱或冷庫對肉樣進行冷凍，凍融處理后制樣，再利用DSC法對肉樣中蛋白質(zhì)變性情況進行分析，能夠反映真實凍融過程肉中蛋白質(zhì)的冷變性情況，但由于DSC儀器處理量小和單個樣品測樣時間長等特性，使得制樣到測樣之間的時長難以控制，這期間肉質(zhì)可能發(fā)生變化，使結果不能準確地反映凍融后蛋白質(zhì)變性情況。

綜上，對冷凍后的肉樣切片，利用DSC液氮冷凍系統(tǒng)對測定樣品進行凍融處理，探索凍融過程中不同最低凍融溫度、不同凍融次數(shù)下的羊肉DSC熱焓曲線變化，并考慮制樣到測樣之間時長、樣品質(zhì)量給DSC熱焓曲線帶來的影響，以期為DSC法應用于肉類研究提供更加充分的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉：采樣自新疆華凌畜牧屠宰基地，選取健康成年新疆山羊，宰后取其左右兩側背最長肌，于4℃環(huán)境中成熟24 h后置于干冰中，運輸回陜西實驗室，后轉入-80℃冰箱貯藏，待用。

1.2 儀器與設備

DSC Q1000型差示掃描量熱儀：美國TA公司產(chǎn)品；超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技有限責任公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備從-80℃冰箱中取出羊肉樣品，沿肌纖維方向隨機切成10～30 mg厚度均勻的薄片，記錄樣品質(zhì)量；進行DSC測定，并記錄樣品從切片到進行DSC測定之間的時長。

1.3.2 DSC測定程序參照何向麗的程序進行測定[11]，略有修改。以空盤作對照（未放置樣品），將樣品分為未凍融（not freeze-thaw，NFT）組、-20℃凍融1次（-20℃freeze-thaw once，TFT1）組、-20℃凍融2次（-20℃freeze-thaw twice，TFT2）組、-80℃凍融1次（-80℃freeze-thaw once，EFT1）組，每組樣品至少重復測定3次，此外，-20℃凍融表示最低凍融循環(huán)溫度為-20℃，-80℃凍融表示最低凍融循環(huán)溫度為-80℃；由于運輸條件限制，樣品在DSC測定之前已經(jīng)過1次最低凍融溫度為-80℃的凍融過程，即文中凍融次數(shù)均是DSC儀器凍融次數(shù)。具體方案如下：

1）NFT組 肉樣在25℃平衡5 min，然后以5℃/min升溫到150℃。

2）TFT1組 肉樣在25℃平衡5 min，之后以1℃/min降溫到-20℃，然后以1℃/min升溫到25℃，平衡5 min，再以5℃/min升溫到150℃。

3）TFT2組 肉樣在25℃平衡5 min，之后以1℃/min降溫到-20℃，然后以1℃/min升溫到25℃，再以1℃/min降溫到-20℃，以1℃/min升溫到25℃，平衡5 min，然后以5℃/min升溫到150℃。

4）EFT1組 肉樣在25℃平衡5 min，之后以1℃/min降溫到-80℃。然后以1℃/min升溫到25℃，平衡5 min，再以5℃/min升溫到150℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用TA Universal Analysis軟件對升溫曲線熱相圖進行分析，得到起始溫度（Ton，℃）、峰值溫度（Tp，℃）和熱吸收峰焓值（ΔH，J/g）。采用Excel 2018軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。通過Origin 2018軟件進行雙標圖的相似性分析。

2 結果與分析

2.1 凍融次數(shù)對DSC曲線的影響

對樣品進行最低凍融溫度-20℃的2次凍融處理，25～150℃部分升溫曲線如圖1所示。3種凍融次數(shù)樣品的升溫曲線都在80℃和100℃左右出峰，此外，NFT組和TFT1組在60℃左右出峰，NFT組在85℃左右出峰。按照曲線出峰的溫度順序，4個熱轉變峰分別命名為峰1、峰2、峰3和峰4，其中峰1代表肌球蛋白引起的熱流變化[12]，峰2代表肌動蛋白引起的熱流變化[13]，峰3可能代表肌聯(lián)蛋白引起的熱流變化[14]，峰4代表水分迅速蒸騰引起的熱流變化。這些熱轉變峰對應的熱焓值，峰4最大，峰2次之，峰1最小。表1具體列舉了最低凍融溫度為-20℃的3種處理的4個峰的Ton、Tp和ΔH。

圖1 最低溫度-20℃凍融升溫曲線熱相圖Fig.1 Thermal phase diagram of freezing-thawing heating curve with the minimum temperature of-20℃

表1 最低溫度-20℃凍融升溫曲線熱相圖熱力學指標Table 1 Thermodynamic indexes of thermal phase diagram of freezing-thawing heating curve with the minimum temperature of-20℃

結合圖1和表1可知，樣品在凍融處理后出峰位置發(fā)生了偏移。3種處理中TFT2組沒有峰1，TFT1組和TFT2組沒有峰3。TFT1組的峰2較NFT組稍微向低溫偏移，其Ton2和Tp2在3種凍融處理下最低；TFT2組的峰2較NFT組向高溫偏移，其Ton2和Tp2在3種凍融處理下最高。3種凍融處理組的ΔH2隨凍融次數(shù)增加而依次降低，TFT1組的ΔH2比NFT組降低了47.0%（P＜0.05），TFT2組的ΔH2比NFT組降低了68.8%（P＜0.05）。與3個處理組的峰2變化規(guī)律相似，NFT組的Ton4和Tp4在3種凍融處理下居中；TFT1組的Ton4在3種凍融處理中最低；TFT2組的Ton4和Tp4在3種凍融處理中最高。NFT組和TFT1組的ΔH4相差不大，TFT2組ΔH4相對較小。

峰起始溫度Ton和峰值溫度Tp反映了羊肉中活性蛋白質(zhì)對加熱的敏感性，Ton和Tp越大，說明該成分熱穩(wěn)定性越強。熱焓值ΔH的大小反映了蛋白質(zhì)的變性程度，對于同一物質(zhì)的不同處理，ΔH越大，說明在升溫到變性溫度之前，蛋白質(zhì)的變性程度越小。一方面，兩個凍融處理組的ΔH2隨著凍融次數(shù)的增加顯著下降，且Ton2和Tp2與未凍融組相比發(fā)生偏移，說明凍融過程不僅會使肌動蛋白發(fā)生變性，還會影響肌動蛋白的穩(wěn)定性。另一方面，隨著凍融次數(shù)增加，TFT2組峰1消失，TFT1組和TFT2組峰3消失，說明凍融次數(shù)增加導致肌球蛋白和肌聯(lián)蛋白變性程度加劇。肉中的部分水分在凍融和升溫的過程中散失，當溫度達到100℃左右時，非游離水迅速轉化為自由水并在達到沸點后迅速蒸騰，導致峰4出現(xiàn)[15]。TFT1組的ΔH4比NFT組升高了1.3%（P＞0.05），說明進行最低凍融溫度-20℃凍融1次對樣品水分的影響較??；TFT2組的ΔH4比NFT組降低了11.9%（P＜0.05），說明進行最低凍融溫度-20℃凍融2次對水分有明顯影響。另外，所有處理組在98℃左右出現(xiàn)一個小峰，這可能是由于溫度達到DNA變性溫度，DNA發(fā)生解旋導致[16]。綜上可知，在最低溫度為-20℃的凍融處理下，凍融次數(shù)對羊肉的DSC升溫曲線具有明顯影響。

2.2 凍融溫度對DSC曲線的影響

對樣品進行了未凍融（NFT）、-20℃凍融1次（TFT1）、-80℃凍融1次（EFT1）處理，25～150℃部分升溫曲線如圖2所示。相較于NFT組和TFT1組，EFT1組峰1和峰2變小，峰4變大，表2具體列舉了最低凍融溫度為-20℃和-80℃的4個峰的Ton、Tp和ΔH。3種凍融處理組的ΔH1和ΔH2隨最低凍融溫度下降而依次降低，TFT1組和EFT1組的ΔH1比NFT組分別降低了57.0%（P＜0.05）和89.6%（P＜0.05）；TFT1組和EFT1組的ΔH2比NFT組分別降低了47.0%（P＜0.05）和59.6%（P＜0.05）。這表明更低的凍融溫度對蛋白質(zhì)變性的影響更大，且肌球蛋白比肌動蛋白更容易受到凍融的影響。TFT1組的ΔH4比NFT組升高了1.3%（P＞0.05），EFT1組的ΔH4比NFT組增大了15.6%（P＜0.05），表明更低的凍融溫度降低了羊肉凍融過程中水分的散失。

表2 不同最低凍融溫度下DSC熱力學指標Table 2 DSC thermodynamic indexes of freezing-thawing heating curve with different minimum temperatures

圖2 不同最低凍融溫度升溫曲線熱相圖Fig.2 Thermal phase diagram of freezing-thawing heating curve with different minimum temperatures

2.3 DSC曲線指標主成分分析

由于DSC程序運行較為耗時，單次只能測試1個樣品，從制樣到測樣之間存在不同的時長，使同一樣品不同測定之間的DSC曲線出現(xiàn)小部分差異?？紤]到這種不確定因素，統(tǒng)計了24次最低凍融溫度為-20℃的DSC曲線70～110℃的部分結果，其中包括了NFT、TFT1以及TFT2，結果見圖3。

以凍融次數(shù)對24次測定進行分組，按照制樣到測樣間時長的增大順序進行組內(nèi)排序，由于部分測定組的DSC曲線沒有出現(xiàn)峰1，為保證結果的可信度，圖3沒有將ΔH1納入考量。在圖3中，PC1和PC2解釋了數(shù)據(jù)中64.7%的可變性。圖中線段之間的夾角表示各指標相互之間的影響，線段之間的夾角小于90°表明正相關，兩線段之間夾角越小，正相關性越強。從圖中可知，制樣到測樣之間時長和ΔH2呈現(xiàn)明顯的負相關，說明時長增加會加劇肌動蛋白變性。雙標圖中兩點距離表示樣本差異大小，兩點距離近，說明相似性較好，兩點距離遠則表明相似性較差。根據(jù)圖3可知，NFT的點與TFT2的點相距較遠，TFT1的點則分布在兩者之間，說明凍融次數(shù)增加，肉的蛋白質(zhì)變性加劇。TFT1的點較為分散，序號較小的點更靠近NFT的點，序號較大的點更靠近TFT2的點，進一步說明時長影響蛋白質(zhì)變性情況。

圖3 最低溫度-20℃下凍融次數(shù)對DSC曲線影響的雙標圖Fig.3 Biplot of effects of different freezing-thawing cycles on DSC curves with the minimum temperature of-20℃

2.4 討論

肉在宰后運輸過程中，凍融問題常常發(fā)生，蛋白質(zhì)也因此面臨冷變性而失去活力，導致蛋白質(zhì)的凝膠化特性、與風味物質(zhì)的結合能力以及水合能力發(fā)生改變，最終引起肉持水力下降、風味發(fā)生變化、肉的色澤劣變等問題，從而降低肉品質(zhì)。其中，當?shù)鞍踪|(zhì)因凍融發(fā)生冷變性時，內(nèi)部的疏水基團暴露到外部，降低與水親和的能力，這解釋了凍融次數(shù)增加后TFT2處理組的ΔH4顯著降低的現(xiàn)象[17]；黃鴻兵研究了凍融循環(huán)對豬肉持水力的影響，發(fā)現(xiàn)隨著凍融次數(shù)的增加，豬肉滴水損失增大[18]，與該實驗結果一致。冷變性作用和冰晶的形成有關，速凍形成的冰晶相較緩凍小，對蛋白質(zhì)的破壞作用也較小，大量的研究證實了這一點[6-7，19-20]。有研究表明，更快的降溫速率和更低的凍藏溫度有利于肉品質(zhì)的保持，因此，在控制相同DSC儀器降溫速率條件下，作者比較了EFT1組與TFT1組的DSC曲線，結果表明，相同的降溫速率下，更低的凍融溫度會加劇蛋白質(zhì)變性，但也能減少凍融和升溫過程羊肉的水分散失。這可能是由于溫度在下降到-20℃之后，溫度繼續(xù)下降，冰晶的生長仍在進行，肉中部分自由水會向半結合態(tài)水轉變，使得水分在程序升溫過程中蒸發(fā)變少，從而引起EFT1組的ΔH4較TFT1組顯著增大。

肉在加熱過程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性，其變性過程反映為DSC曲線的吸熱峰，這些峰的出現(xiàn)是特定溫度范圍下蛋白質(zhì)二級結構由螺旋轉變?yōu)闊o規(guī)則卷曲的結果[21]。一般而言，肌球蛋白熱轉變溫度為43～67℃[12]，肌漿蛋白熱轉變溫度為67～69℃，肌動蛋白熱轉變溫度為71～83℃[13]，這3種蛋白質(zhì)受熱發(fā)生變化引起各自溫度范圍中熱吸收峰的出現(xiàn)[22-23]。而在該實驗中，沒有出現(xiàn)肌漿蛋白熱轉變峰，這可能是由于肌漿蛋白更易受到凍融影響，在運輸和制樣過程中已經(jīng)發(fā)生變性所致。DSC曲線在85℃左右出峰，可能是肌聯(lián)蛋白變性所致[14，24]，只有NFT組出現(xiàn)峰3，可能是肌聯(lián)蛋白在第一次凍融中就已經(jīng)完全變性。此外，肌肉纖維組成的差異和肌肉極限pH可能也會影響出峰情況，Rozita等利用DSC法研究不同纖維類型牛肉，發(fā)現(xiàn)II型肌肉纖維中肌球蛋白比I型纖維中更容易發(fā)生變性[14]；Rios-mera等利用DSC法研究不同極限pH的牛背最長肌的蛋白質(zhì)變性溫度，發(fā)現(xiàn)中間范圍的極限pH（極限pH 5.81～6.19）下蛋白質(zhì)變性程度最輕[25]；這兩種影響因素解釋了不同研究中肉在相同溫度區(qū)間里Ton和Tp的偏移。除此之外，影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素還有肉的品質(zhì)、加工方式和儲藏條件[26-27]。作者對同一肉樣切片，控制了以上因素的影響。然而，不同的凍融處理使得Ton和Tp偏移，說明凍融處理會影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性，且對不同蛋白質(zhì)的影響程度不同。

肉在解凍過程中容易受到微生物、氧化作用、酶等因素的影響[28-30]，使肉質(zhì)在制樣到測樣之間的時間差內(nèi)發(fā)生變化，該實驗中制樣到測樣之間時長與ΔH2呈負相關，即與肌動蛋白變性程度呈正相關，表明實際操作中應當注意制樣到測樣之間時長對測定結果帶來的影響。陳詠萱等論述了DSC的原理和應用，認為有機樣品質(zhì)量在5～10 mg為宜，并且樣品的質(zhì)量越小越好[28]。該實驗中樣品質(zhì)量與各熱焓值相關性并不明顯，意味著在實際操作中控制樣品質(zhì)量在適宜范圍內(nèi)后，樣品質(zhì)量對DSC曲線的影響小。

3 結語

DSC凍融過程使羊肉的肌球蛋白和肌動蛋白發(fā)生變性，其中肌球蛋白比肌動蛋白更易受到凍融處理的影響，且兩者的變性程度都隨著凍融次數(shù)增加而增加；相同降溫速率情況下，-80℃的凍融處理比-20℃的凍融處理增加了肌球蛋白和肌動蛋白的變性程度，但前者的水分蒸發(fā)情況較后者更輕；從制樣到測樣之間的時長與肌動蛋白變性程度呈現(xiàn)正相關，時長越長，變性程度越大?？傊瑑鋈谔幚韺Σ煌鞍踪|(zhì)的影響具有差異，利用DSC法可以較為直觀地將這種差異展現(xiàn)出來，但產(chǎn)生這種差異的原因仍不清楚，利用DSC結合其他技術，如傅里葉變換紅外光譜可能是一種有效途徑。