中藥單體抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成的研究進(jìn)展

楊若琪，趙貴萍，王川東，王 靜

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.云南中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；3.山東大學(xué) 微生物技術(shù)研究院，山東 青島 266237)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種常見的人類病原體,通?？梢詿o癥狀地定植在人類的上呼吸道、皮膚和腸黏膜中,并且在大多數(shù)情況下很少對健康的個體造成嚴(yán)重的生命威脅[1]。但當(dāng)人體因慢性皮膚病、傷口或手術(shù)干預(yù)而導(dǎo)致皮膚和黏膜屏障被破壞時,金黃色葡萄球菌可進(jìn)入下層組織或血液，并引發(fā)感染。帶有植入性醫(yī)療設(shè)備(例如外圍和中央靜脈導(dǎo)管)或免疫系統(tǒng)受損的人群特別容易受其感染[2]。金黃色葡萄球菌對抗生素產(chǎn)生的耐藥性致使其治療復(fù)雜化,是目前臨床治療的主要難題。

為了對抗金黃色葡萄球菌,人們在1959年引入了甲氧西林,然而僅2年后臨床上就首次發(fā)現(xiàn)了抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)[3]。更為嚴(yán)重的是,所有植入的醫(yī)療器械都極易被金黃色葡萄球菌定植,進(jìn)而發(fā)展形成生物被膜(biofilm)[4]。生物被膜是指包裹在自身產(chǎn)生的胞外基質(zhì)(ECM)中的微生物聚集體，有研究顯示：殺死生物被膜中細(xì)菌所需的抗生素用量比殺死浮游細(xì)菌所需的抗生素用量要高1 000倍[5]。這種抗性的增加主要?dú)w因于生物被膜基質(zhì)的有限擴(kuò)散或者排斥性,致使大多數(shù)藥物滲透效果較差,從而減少了生物被膜內(nèi)部細(xì)胞與抗菌藥物的直接接觸。此外,生物被膜內(nèi)部細(xì)胞呈現(xiàn)出生長緩慢、代謝活力低的生理異質(zhì)特性,也會限制并降低抗生素的功效,尤其是那些針對細(xì)胞活躍過程的抗生素[6]。金黃色葡萄球菌形成的生物被膜不僅對環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性,而且還能夠躲避宿主的先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的攻擊，增加了植入物感染的持續(xù)性和反復(fù)性,為臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)[7]。

頑固的生物被膜一旦形成，將很難有效地根除,因此,一旦感染相關(guān)的金黃色葡萄球菌生物被膜，通常需要手術(shù)清創(chuàng)和延長抗菌治療周期。除了常規(guī)的方案以外,新型的不同作用機(jī)制的預(yù)防或根除葡萄球菌生物被膜的策略也正被廣泛采用。例如：分子干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)、降解生物被膜基質(zhì)組分、噬菌體療法、聲電效應(yīng)與光動力療法、衍生修飾植入材料表面、將納米顆粒作為載體輸送抗生素藥物或制備具有抗菌活性的金屬納米顆粒[8-9]。在臨床實(shí)踐中,現(xiàn)有藥物對葡萄球菌生物被膜的作用效果并不理想,因此,抗金黃色葡萄球菌感染的新藥研發(fā)也從未間斷[10]。具有生物活性的天然產(chǎn)物，包括動、植物資源數(shù)千年來一直被廣泛使用,時至今日仍然是新的潛在治療制劑的最重要來源[11]。發(fā)源于中華大地的中醫(yī)藥是中華文明的珍貴寶藏,在全民健康中發(fā)揮著重要作用。一些來源于中藥的單體化合物可以靶向作用于金黃色葡萄球菌的生物被膜,抑制其形成或分散已建立的成熟生物被膜,例如黃酮類化合物槲皮素[12]、山柰酚[13],苯丙素類化合物丁香酚[14]、肉桂醛[15]以及萜類化合物圓柚酮等[16],但它們作用的具體方式和相關(guān)的分子作用機(jī)制還有待更深入的研究。

1 金黃色葡萄菌的生物被膜簡介

絕大多數(shù)微生物在自然環(huán)境中將細(xì)胞嵌入自身產(chǎn)生的ECM中,并附著在各種生物和非生物表面上進(jìn)行生長繁殖,形成一類高度組織化和結(jié)構(gòu)化的細(xì)胞群體結(jié)構(gòu),這種特殊化的結(jié)構(gòu)即被稱之為生物被膜。細(xì)菌生物被膜的ECM中富含多糖、蛋白、脂質(zhì)和核酸等生物大分子[17-18]。對于金黃色葡萄球菌而言,其ECM則由多糖、海藻酸、胞外DNA及幾種表面蛋白組成,并且各組分的含量在不同的分離菌株中呈現(xiàn)出一定的差異性[19]。雖然細(xì)菌生物被膜中的物質(zhì)成分存在種屬特異性,但是其形成過程的基本模型被廣泛認(rèn)為包括3個連續(xù)階段：附著、成熟和分散[20]。在附著階段,浮游細(xì)胞黏附在生物或非生物表面上,然后增殖成為微菌落。隨著這些微菌落的發(fā)展,菌體細(xì)胞會向胞外分泌產(chǎn)生ECM作為構(gòu)建生物被膜必不可少的空間三維支架。當(dāng)達(dá)到特定的細(xì)胞密度后,一種啟動ECM降解的機(jī)制就會被觸發(fā),釋放出嵌入生物被膜內(nèi)部的細(xì)胞,從而在遠(yuǎn)端部位進(jìn)行分散并重啟生物被膜的新一輪發(fā)育[21-22]。金黃色葡萄球菌也被認(rèn)為與其他細(xì)菌具有相似的生物被膜發(fā)育階段。最近,一種與熒光顯微鏡集成的孔板微流控系統(tǒng)(BioFluxTM1000 system)實(shí)時地評估了金黃色葡萄球菌生物被膜的發(fā)育過程,并將整個過程重新定義為5個階段,包括：附著、繁殖、外流、成熟和分散[21](圖1)。金黃色葡萄球菌生物被膜形成的機(jī)制非常復(fù)雜,涉及環(huán)境因素,群體感應(yīng),蛋白酶以及多種全局調(diào)節(jié)因子[8,23]。

圖1 金黃色葡萄球菌生物被膜形成模型[21]Fig.1 Model of Staphylococcus aureus biofilm formation[21]

2 金黃色葡萄球菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制

2.1 細(xì)胞間多糖黏附素(PIA)的依賴機(jī)制

PIA是葡萄球菌生物被膜的重要成分之一,也稱為聚合N-乙酰基葡萄糖胺(PNAG)。葡萄球菌生物被膜的積累是由PIA介導(dǎo)的,而PIA的產(chǎn)生由細(xì)胞間黏附因子(Ica)操縱子編碼的產(chǎn)物調(diào)節(jié)[24]。Ica基因座包括icaADBC4個功能基因和icaR調(diào)節(jié)基因。icaA和icaD基因分別編碼具有N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性的跨膜酶,用于合成N-乙酰氨基葡萄糖聚合物,其在胞外多糖的產(chǎn)生中起著重要作用[25]。icaC基因的產(chǎn)物將N-乙酰氨基葡萄糖聚合物轉(zhuǎn)移到細(xì)菌細(xì)胞的表面,而icaB基因的產(chǎn)物能夠使該分子去乙?；?。icaR是一個阻遏基因,對ica的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控的作用,當(dāng)icaR突變后,icaADBC的表達(dá)將上調(diào)[26]。金黃色葡萄球菌也產(chǎn)生PIA,Ica操縱子存在于幾乎所有金黃色葡萄球菌菌株中[27]。ica基因表達(dá)的下調(diào)是抑制生物被膜形成的一種作用機(jī)制,因此刪除ica基因位點(diǎn)會阻礙PIA的產(chǎn)生和生物被膜的形成,使其成為治療細(xì)菌生物被膜感染的一個潛在靶標(biāo)[28]。

2.2 細(xì)胞表面蛋白(PIA非依賴機(jī)制)

盡管Ica基因座在生物被膜的發(fā)育中非常重要,但生物被膜還存在不依賴Ica的形成途徑[29]。在初始黏附階段,金黃色葡萄球菌通過細(xì)胞壁錨定蛋白(CWA)黏附到宿主組織周圍的生物表面以及涂有血漿蛋白的非生物表面。識別黏附基質(zhì)分子的微生物表面成分(MSCRAMMs)作為細(xì)菌表面蛋白,可以與人類基質(zhì)蛋白結(jié)合,這與生物被膜形成的早期階段有關(guān)[30]。MSCRAMMs主要包括葡萄球菌蛋白A(SpA)、纖連蛋白-結(jié)合蛋白(FnBPs)、生物被膜相關(guān)蛋白(Bap)、聚集相關(guān)蛋白(Aap) 和凝集因子(Clfs)等。它們大多數(shù)具有共同的細(xì)胞壁靶向基序(LPXTG),并通過轉(zhuǎn)肽酶A(SrtA)錨定到細(xì)胞壁上,該酶可以催化表面蛋白與肽聚糖的五甘氨酸交聯(lián)劑進(jìn)行共價連接[31]。Archer等[29]研究表明：在不依賴Ica的生物被膜形成途徑中,細(xì)胞間的黏附可以替代PIA介導(dǎo)的生物被膜的形成。

2.3 胞外DNA(eDNA)

eDNA來源于細(xì)菌的程序性死亡和裂解,在生物被膜的初始黏附階段起連接作用,同時也是生物被膜的胞外基質(zhì)的重要組成成分[32]。eDNA的釋放促進(jìn)了金黃色葡萄球菌生物被膜的形成,該過程主要由Cid、Lrg和Atl操縱子調(diào)控。在金黃色葡萄球菌中,細(xì)胞的死亡和裂解受Cid和Lrg操縱子的控制,它們編碼蛋白的功能與孔蛋白(Holin)和孔蛋白拮抗蛋白(antiholin)類似,通過調(diào)節(jié)胞壁水解酶的活性,從而影響生物被膜的形成[33]。金黃色葡萄球菌的cidA基因在生物被膜發(fā)育過程中促進(jìn)細(xì)胞裂解,而lrgAB基因抑制細(xì)胞裂解[34]。有研究顯示：細(xì)胞的自溶作用對eDNA釋放和生物被膜的形成是必要的[32]。自溶素基因atl可以通過促進(jìn)細(xì)胞自溶來增加eDNA的釋放。細(xì)胞溶解和eDNA的釋放是金黃色葡萄球菌生物被膜形成復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的另一個分支。

2.4 群體感應(yīng)(QS)系統(tǒng)

革蘭氏陽性菌在形成生物被膜的過程中通過QS系統(tǒng)傳導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞,因此QS系統(tǒng)控制著金黃色葡萄球菌生物被膜的形成和毒力因子的表達(dá)[35]。輔助基因調(diào)節(jié)(Agr)系統(tǒng)和LuxS/自誘導(dǎo)分子-2(AI-2)系統(tǒng)是葡萄球菌兩種主要的QS系統(tǒng)。agr基因編碼RNAⅡ和RNAⅢ,前者含有agrABCD4個基因,后者是一種自誘導(dǎo)肽。有研究顯示：Agr系統(tǒng)通過上調(diào)胞外蛋白酶的表達(dá),使生物被膜中的細(xì)胞從生物被膜結(jié)構(gòu)中分離,從而抑制了生物被膜的形成[36]。luxS/AI-2系統(tǒng)對生物被膜的抑制作用與Agr系統(tǒng)相似,研究發(fā)現(xiàn)：LuxS/AI-2系統(tǒng)可以通過激活icaR來減少金黃色葡萄球菌生物被膜的形成[37]。Agr系統(tǒng)在毒力因子的表達(dá)中起著關(guān)鍵作用,使其成為一個潛在的治療靶標(biāo)[38]。

2.5 全局調(diào)控因子

全局調(diào)控因子主要包括葡萄球菌輔助調(diào)節(jié)因子(SarA)和轉(zhuǎn)錄因子SigB等,對金黃色葡萄球菌的基因表達(dá)和生物被膜形成具有全面的影響[39]。SarA是控制金黃色葡萄球菌毒力因子產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)元件,對于PIA的合成至關(guān)重要[40]。SarA可以增強(qiáng)ica操縱子的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)金黃色葡萄球菌生物被膜的發(fā)育[41]。同時SarA也可以上調(diào)agr基因的表達(dá),從而影響金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。有研究顯示：金黃色葡萄球菌的sigB基因突變菌株通過下調(diào)編碼耐熱核酸酶的nuc基因的表達(dá)來促進(jìn)生物被膜的形成[42]。SarA能夠調(diào)控多種生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá),是抑制生物被膜形成的關(guān)鍵靶標(biāo)。金黃色葡萄球菌生物被膜形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖2。

圖2 金黃色葡萄球菌生物被膜形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[8]Fig.2 Regulatory network of Staphylococcus aureus biofilm formation[8]

3 抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成的中藥單體

中藥作為中華民族文化的瑰寶,其應(yīng)用歷史十分悠久。中藥是天然存在的，或是經(jīng)過特殊加工的植物、動物部位和礦物質(zhì)。中藥發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要是其所含有的各種活性單體成分，因此，對于中藥及其單體成分藥理作用的研究也成了當(dāng)今國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。中藥具有來源廣泛,價格便宜,毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),符合現(xiàn)代社會倡導(dǎo)的“綠色”和“天然”的趨勢[43]。有研究顯示：由于中藥及其單體成分降低了產(chǎn)生耐藥性的可能,因此它們比合成衍生物更具有優(yōu)勢[44]。中藥發(fā)揮作用的一大特色為中藥的復(fù)方性,中藥復(fù)方不僅僅是簡單的幾味中藥藥效的加和,而是多環(huán)節(jié)、多目標(biāo)、多靶點(diǎn)的[45]。目前，中藥復(fù)方對金黃色葡萄球菌生物被膜抑制作用的相關(guān)報道還比較少,因此，對于中藥復(fù)方的進(jìn)一步研究也是未來發(fā)展的重要趨勢。

3.1 黃酮類化合物

黃酮類化合物在自然界中分布廣泛,以唇形科、蕓香科、姜科中存在較多。Lee等[12]的研究結(jié)果顯示：槲皮素下調(diào)了icaA和icaD基因的表達(dá),從而抑制了生物被膜的形成。Chen 等[46]研究發(fā)現(xiàn)：黃芩素能夠阻斷QS系統(tǒng)調(diào)控的細(xì)胞間信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),從而下調(diào)了QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子agrA和sarA的基因表達(dá),最終阻礙了生物被膜的形成。Ming等[13]發(fā)現(xiàn)：山奈酚通過降低金黃色葡萄球菌SrtA的活性和黏附相關(guān)基因fnbA、fnbB、clfA、clfB的表達(dá),抑制了生物被膜形成的初始黏附階段,從而干擾了生物被膜的發(fā)育。

3.2 苯丙素類化合物

目前認(rèn)為苯丙素類化合物通常包括簡單苯丙素類、香豆素類和木脂素類,屬于酚類化合物。Yadav等[14]研究發(fā)現(xiàn)：丁香酚在體外降低了sarA和icaD基因的表達(dá),從而導(dǎo)致多糖的積累減少,抑制了細(xì)胞在生物被膜中的黏附作用,最終阻礙了生物被膜的形成,同時對已形成的生物被膜也有明顯的根除作用。Wang等[47]的研究結(jié)果顯示：厚樸酚可以通過抑制cidA基因，并誘導(dǎo)lrgAB基因的表達(dá),減少eDNA的釋放,從而阻礙生物被膜的形成。Jia等[15]研究了肉桂醛對生物被膜相關(guān)基因sarA表達(dá)的影響,結(jié)果表明：肉桂醛抑制了sarA的表達(dá)和金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。Bai等[48]發(fā)現(xiàn)：莽草酸可以通過干擾生物被膜形成的早期階段來下調(diào)sarA基因的表達(dá),但是對已形成的生物被膜并沒有影響。

3.3 萜類化合物

萜類化合物通過異戊二烯法則進(jìn)行分類,常見的單萜以及倍半萜類化合物在唇形科、蕓香科以及菊科中大量存在,二萜類化合物則集中分布在五加科、大戟科、茜草科中。Farha等[16]的研究結(jié)果顯示：圓柚酮可以下調(diào)icaA、sarA和agrA基因的表達(dá),降低胞外多糖的合成,從而抑制生物被膜的形成；同時還發(fā)現(xiàn)圓柚酮可以使已成熟的生物被膜的平均厚度減小,生物被膜內(nèi)細(xì)胞的存活能力也明顯降低。戴雨蕓等[49]研究了香芹酚對金黃色葡萄球菌生物被膜的作用機(jī)制,發(fā)現(xiàn)香芹酚通過減少PIA的合成,可顯著抑制icaA、sarA和cidA基因的表達(dá),對金黃色葡萄球菌生物被膜的形成與根除已成熟的生物被膜都有一定的效果。

3.4 醌類化合物

醌類化合物在植物中的分布也非常廣泛,常見的如：蓼科植物大黃、唇形科植物丹參等均含有醌類化合物。剛果紅可以與細(xì)菌生物被膜表面PIA反應(yīng),導(dǎo)致菌落變黑。Xiang等[50]發(fā)現(xiàn)：蘆薈大黃素以劑量依賴性的方式顯著減少了黑色菌落的數(shù)量,該結(jié)果表明蘆薈大黃素可以減少細(xì)胞表面PIA的積累,從而減弱了生物被膜的形成能力。

3.5 鞣酸類化合物

鞣酸類化合物通常是指一種特殊的植物多元酚,許多中草藥例如：五倍子、大黃、地榆中均發(fā)現(xiàn)了較高含量的鞣酸類化合物。Liu等[51]的研究結(jié)果顯示：沒食子酸通過上調(diào)icaR并下調(diào)icaA和icaD的表達(dá)來調(diào)節(jié)Ica操縱子,從而減少了多糖黏液的產(chǎn)生并抑制了生物被膜的形成,但是沒食子酸對icaB和icaC基因沒有明顯的調(diào)節(jié)作用。

中藥單體的抗生物被膜分子機(jī)制見表1。

表1 中藥單體的抗生物被膜分子機(jī)制

4 結(jié)論

生物被膜的形成是金黃色葡萄球菌產(chǎn)生耐藥性的原因之一。生物被膜的結(jié)構(gòu)使細(xì)菌對抗生素具有更強(qiáng)的抵抗力,從而增加了從宿主根除病原體的難度。近年來,隨著植入醫(yī)療設(shè)備的廣泛使用,葡萄球菌可以通過形成生物被膜進(jìn)行定植。金黃色葡萄球菌生物被膜對多種抗生素耐藥性的增強(qiáng)，對人類健康構(gòu)成了重大威脅。金黃色葡萄球菌形成生物被膜的能力與慢性感染的持續(xù)存在息息相關(guān)。與浮游細(xì)菌相比,生物被膜下的細(xì)菌由于缺少氧氣和營養(yǎng)物質(zhì),其生長代謝速度遲緩,對外界刺激的敏感性降低,很難被徹底清除,這也是生物被膜感染易反復(fù)發(fā)作的原因之一。

常規(guī)抗生素治療在抑制和消除生物被膜感染方面效果甚微。與化學(xué)合成藥物相比,中藥單體成分由于不易產(chǎn)生耐藥性而具有獨(dú)特的優(yōu)勢。許多中藥單體成分在多種生物被膜模型中對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抗生物被膜活性。除此之外,分子對接方法已成為計算機(jī)輔助藥物研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)。在進(jìn)行傳統(tǒng)生物學(xué)測定之前,將中藥中的藥物分子與金黃色葡萄球菌中常見靶點(diǎn)蛋白之間的相互作用進(jìn)行預(yù)測評估,可以有效地縮小篩選的范圍、提高命中率、降低藥物研發(fā)成本。盡管許多中藥單體具有治療生物被膜相關(guān)感染的巨大潛力,但它們的某些作用機(jī)制仍不清楚。因此，尚需開展深入研究,揭示其具體作用方式及關(guān)鍵靶點(diǎn),結(jié)合物理化學(xué)手段,進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制,可以為抗生物被膜天然藥物的研發(fā)提供新的思路。