復(fù)合型固相萃取-離子對(duì)反相液相色譜法測(cè)定蔬菜中的滅蠅胺殘留

王成龍，劉 佳，王 宇，黃小清，林澤珊，趙金利，譚錦萍，黃 松

（廣州市食品檢驗(yàn)所 廣州 511400）

滅蠅胺（Cyromazine）為三嗪類化合物，屬低毒類昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，常用于抵御菜豆、黃瓜、韭菜等蔬菜上的美洲斑潛蠅和潛葉蠅[1-2]。滅蠅胺在許多國(guó)家獲準(zhǔn)登記并作為農(nóng)藥使用[3]。在豆類蔬菜與瓜果類水果中，歐盟和美國(guó)的最大殘留限量為0.01 mg/kg，我國(guó)明確規(guī)定滅蠅胺的最大殘留限量不超過(guò)0.5 mg/kg。由于種植方式和農(nóng)藥施用不當(dāng)?shù)仍?，使得滅蠅胺的濫用與違規(guī)添加現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[4-6]。國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局近年均有通報(bào)食用農(nóng)產(chǎn)品豇豆中滅蠅胺殘留超標(biāo)的案例[7]。滅蠅胺具有極性親水、強(qiáng)內(nèi)吸性的特點(diǎn)，易通過(guò)生物鏈富集作用，對(duì)人體的生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)造成損害，而濫用或違規(guī)添加可能會(huì)引發(fā)潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn)[8-10]。

目前，針對(duì)滅蠅胺的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[11]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-16]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17]、分子印跡快檢技術(shù)[18-19]等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法一般采用有機(jī)溶劑萃取，滅蠅胺極性大，方法的提取效率不高，且檢測(cè)成本高昂、不易推廣；氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法需要對(duì)化合物衍生處理，前處理繁瑣，測(cè)定干擾大；分子印跡技術(shù)存在一定的假陽(yáng)性，在食品監(jiān)管中存在結(jié)果的可靠性風(fēng)險(xiǎn)。依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[20]的最新規(guī)定，滅蠅胺的指定判定檢驗(yàn)方法為《蔬菜中滅蠅胺殘留量的測(cè)定高效液相色譜法》NY/T 1725-2009[21]，然而，該方法存在凈化效果差，回收率偏低的缺點(diǎn)。該方法采用正相色譜柱——氨基柱進(jìn)行分離，柱鍵合相氨丙基易脫落，導(dǎo)致柱壽命較短，柱的維護(hù)與儲(chǔ)存難度大，分析平衡時(shí)間長(zhǎng)，不適于批量檢測(cè)。

本研究基于滅蠅胺檢測(cè)方法，前處理采用復(fù)合型固相萃取凈化，在目標(biāo)物的提取與除雜上兼顧非極性保留與離子保留，改善凈化效果并增強(qiáng)方法的選擇性。色譜分析時(shí)，采用以硅膠基質(zhì)固定相、離子對(duì)試劑為流動(dòng)相的離子對(duì)反相液相色譜法，以使滅蠅胺這類強(qiáng)極性化合物有較好的保留，并期望建立起一個(gè)快速、高效、特異性好的檢測(cè)方法以克服當(dāng)下蔬菜基質(zhì)滅蠅胺殘留定性、定量相對(duì)復(fù)雜的監(jiān)管痛點(diǎn)，為后續(xù)檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)的整合更新提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

豆角、黃瓜、大白菜、豇豆等具有代表性的蔬菜采買(mǎi)于廣州市場(chǎng)，并置于4 ℃冰箱中保存。

滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)品，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；鹽酸、碳酸氫胺、磷酸、氨水、氯化銨、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、三氯乙酸，廣州化學(xué)試劑廠；庚烷磺酸鈉，美國(guó)REGIS 科技公司；三乙胺，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司；乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮（均為色譜純），德國(guó)Merck 公司；MCX 復(fù)合型陽(yáng)離子萃取柱、WCX 弱陽(yáng)離子萃取小柱、HLB 固相萃取柱，美國(guó)waters 公司；SCX 強(qiáng)陽(yáng)離子萃取小柱、C18 固相萃取柱，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水（經(jīng)Milli-Q 超純水機(jī)制備）。

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY 高效液相色譜儀、配PDA detector紫外檢測(cè)器，美國(guó)waters 公司；Poroshell C8 色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），美國(guó)Agilent 科技公司；Kintex PFP 色譜柱 （4.6 mm×150 mm，2.6 μm），美國(guó)Phenomenex 公司；BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、BEH Amide （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），均為美國(guó)waters 公司；UW6200H 型電子天平，日本島津儀器有限公司；BackManX-30R 型離心機(jī)，美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；MS3-control 渦旋混合器，德國(guó)IKA 集團(tuán)；N-EvAP氮吹儀，美國(guó)Organomation 儀器公司；MIlli-Q 純水機(jī)，美國(guó)Millipore 公司；2600TH 超聲波清洗機(jī)、0.22 μm 水相針式濾膜，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取25 mg 滅蠅胺于小燒杯中，用去離子水溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL 規(guī)格的容量瓶中，定容至刻度，配成1 mg/mL 滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃冰箱冷藏保存。用去離子水逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，得到0.1，0.2，0.5，1，2 μg/mL 系列純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.2 樣品前處理 稱取10 g （精確至0.01 g）蔬菜樣品于50 mL 具塞離心管中，加入7 mL 20 mmol/L 碳酸氫胺溶液，以100 kHz 的頻率超聲提取10 min。分別于離心管中加入1 mL 220 g/L 乙酸鋅溶液和1 mL 109 g/L 亞鐵氰化鉀溶液的組合沉淀劑，渦旋振蕩3 min，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心3 min。離心后，轉(zhuǎn)移清液于25 mL 容量瓶中后，以7 mL 20 mmol/L 碳酸氫胺溶液重復(fù)提取2 次，合并提取液，以碳酸氫銨溶液定容至刻度。分取10 mL 定容液，待凈化。

依次用5 mL 甲醇、5 mL 水活化萃取小柱，將待凈化液分2 次（5 mL/次）上樣至萃取小柱中。隨后添加5 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液于小柱，再分別用5 mL 去離子水、5 mL 甲醇淋洗，最后以8 mL 5%（體積分?jǐn)?shù)）氨水-甲醇洗脫，收集洗脫液。將洗脫液于40 ℃下氮吹至近干，以1 mL 去離子水復(fù)溶，渦旋混勻3 min 后將復(fù)溶液過(guò)0.22 μm 濾膜，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜條件 采用C8 色譜柱分離（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫40 ℃；流動(dòng)相A 為離子對(duì)試劑（庚烷磺酸鈉溶液： 吸取7 mL 磷酸于200 mL 水中，加入1 g 庚烷磺酸鈉，溶解，再加入10 mL 三乙胺，用去離子水稀釋至1 000 mL），流動(dòng)相B 為乙腈，流動(dòng)相比例VA∶VB=95∶5，等度洗脫；流速1 mL/min；分析時(shí)間12 min。滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)出峰圖及紫外吸收全光譜見(jiàn)圖1。

圖1 滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)化合物色譜出峰及其紫外吸收全光譜圖Fig.1 The chromatogram and full spectrum of ultraviolet absorption of cyromazine

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑與提取方式優(yōu)化結(jié)果

滅蠅胺作為極性農(nóng)藥，其pKa=5.2，具有可離子化的官能團(tuán)氨基（-NH2）與環(huán)丙氨基（-C3H6N）[22]。比較碳酸氫胺溶液與前處理常用的甲醇、乙腈等萃取溶劑的提取效果，見(jiàn)圖2。

如圖2a 所示，滅蠅胺極性強(qiáng)、脂溶性差，采用有機(jī)溶劑提取時(shí)回收率均較低。而直接用水提取目標(biāo)物或采用1%三氯乙酸水溶液提取時(shí)，回收率均低于60%。由酸式解離方程[23]可知，當(dāng)采用25 mmol/L 碳酸氫胺溶液（pH=8.5）提取時(shí)，溶劑體系的pH 值與滅蠅胺的pKa值相差大于2，目標(biāo)化合物滅蠅胺呈中性態(tài)，官能團(tuán)未離子化，此時(shí)提取溶劑穿透力強(qiáng)，有利于目標(biāo)物的提取，且碳酸氫銨水溶液還具有比氨水穩(wěn)定性更好的優(yōu)點(diǎn)。本研究采用碳酸氫胺溶液作為提取溶劑。

圖2 不同萃取溶劑及萃取方式對(duì)滅蠅胺提取回收率的影響Fig.2 Effects of different extraction solvents and methods on the recovery of cyromazine

由圖2b 可見(jiàn)，采用多次萃取合并提取液方式雖能有效提高滅蠅胺的萃取效率，而反復(fù)萃取操作使試驗(yàn)過(guò)程繁瑣且不利于后續(xù)提取液的濃縮。超聲輔助萃取通過(guò)超聲波空化作用增加樣品溶劑滲透并加速目標(biāo)物遷移[24]。采用碳酸氫胺溶液對(duì)樣品萃取3 次，并在萃取過(guò)程中應(yīng)用超聲輔助技術(shù)優(yōu)化，克服了滅蠅胺常規(guī)方法前處理提取回收率偏低的問(wèn)題。本試驗(yàn)采用超聲輔助萃取3 次。

2.2 沉淀劑優(yōu)化結(jié)果

測(cè)定蔬菜基質(zhì)中的農(nóng)藥殘留，可以通過(guò)沉淀植物蛋白、色素等干擾物提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究參照滅蠅胺檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[21]、研究文獻(xiàn)[25-26]中常用的沉淀劑濃度及用量，比較在前處理中采用不同沉淀劑的沉淀效果，見(jiàn)圖3。

圖3結(jié)果顯示：相較于A 組空白對(duì)照組，其余組加入沉淀劑，各提取液澄清度均有明顯改善，起到沉淀蛋白與部分色素雜質(zhì)干擾的作用。D 組乙酸鋅、亞鐵氰化鉀溶液組合沉淀劑的沉淀效果最佳，溶液呈澄清透明，且不影響后續(xù)測(cè)定回收率，故采用乙酸鋅、亞鐵氰化鉀作為前處理方法中的沉淀劑。

圖3 基于不同沉淀劑的沉淀效果Fig.3 Effect of various precipitants on vegetable matrices

2.3 固相萃取凈化方法優(yōu)化結(jié)果

蔬菜中豇豆基質(zhì)相對(duì)較復(fù)雜，含有大量的色素、植物蛋白、皂甙、生物堿等測(cè)定干擾物，對(duì)樣品的除雜與凈化有較高要求，同時(shí)豇豆也是果蔬中滅蠅胺農(nóng)藥殘留的“重災(zāi)區(qū)”[5]，因此選擇豇豆做試驗(yàn)樣品。分別考察SCX 強(qiáng)陽(yáng)離子、MCX 混合陽(yáng)離子、WCX 弱陽(yáng)離子、C18、HLB 固相萃取小柱（SPE），各SPE 的填料官能團(tuán)、凈化機(jī)理、生產(chǎn)廠見(jiàn)表1。其中，在MCX 小柱的使用上，上柱后淋洗過(guò)程中，通過(guò)鹽酸調(diào)節(jié)pH 值，達(dá)到不損失目標(biāo)化合物的前提下，能分別清除豇豆基質(zhì)中離子型、極性和非極性干擾物，較好地實(shí)現(xiàn)離子交換與非極性保留的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，詳見(jiàn)圖4。

圖4 MCX 固相萃取小柱復(fù)合型用法示意圖Fig.4 Instruction diagram of MCX composite solidphase extraction column

表1 5 種商品化固相萃取柱填料官能團(tuán)與凈化機(jī)理Table 1 Filler functional groups and purification mechanism of five commercial solid phase extraction column

在0.5 mg/kg 加標(biāo)質(zhì)量濃度下，各SPE 小柱加標(biāo)回收率見(jiàn)圖5。僅MCX 固相萃取柱滿足國(guó)標(biāo)GB/T 27404[27]的要求，因此選擇MCX 復(fù)合型固相萃取柱為方法凈化柱。

圖5 不同SPE 小柱凈化的回收率比較Fig.5 Comparison of recovery rates of different SPE columns

2.4 色譜柱優(yōu)化結(jié)果

針對(duì)滅蠅胺化合物極性強(qiáng)，在反相色譜柱中駐留時(shí)間短，出峰較快，難以與極性雜質(zhì)分開(kāi)。因此，在使用常規(guī)C18 色譜柱（BEH C18）分析之余，考察結(jié)合離子對(duì)試劑保留的C8 柱（poroshell C8），基于滅蠅胺三嗪環(huán)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)選取的五氟苯基柱（kintex PFP），針對(duì)極性化合物鍵合三官能團(tuán)C18 烷基的T3 柱（HSS T3）以及正相色譜柱氨基柱（BEH Amide），先通過(guò)優(yōu)化各柱流動(dòng)相比例等色譜參數(shù)獲得滅蠅胺的最佳洗脫條件，再綜合比對(duì)各色譜柱對(duì)滅蠅胺化合物的保留能力 （保留因子k）、出峰峰寬（半峰寬值）、峰形對(duì)稱性（|對(duì)稱因子-1|），結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 滅蠅胺在各色譜柱上的保留能力、峰寬與峰形對(duì)稱性Fig.6 Retention capacity，peak width and peak shape symmetry of cyromazine on each chromatographic column

上圖中其余色譜柱保留能力均優(yōu)于常規(guī)C18分析柱，唯有結(jié)合離子對(duì)試劑保留的C8 柱于半峰寬與|對(duì)稱因子-1|的指標(biāo)上均能處于低值，即滅蠅胺的出峰達(dá)到狹窄、尖銳、對(duì)稱、不拖尾等要求。本研究選擇庚烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑，以C8 色譜柱結(jié)合的離子對(duì)反相色譜分離體系測(cè)定目標(biāo)化合物滅蠅胺。

2.5 線性范圍及檢出限

滅蠅胺標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.5，1，2 μg/mL，按1.3.3 節(jié)所述色譜條件測(cè)定，計(jì)算峰面積，用最小二乘法進(jìn)行回歸分析。在0.1～2 μg/mL 線性范圍的回歸方程為y=1.20×105+1.25×103x（y：峰面積響應(yīng)；x：質(zhì)量濃度），相關(guān)系數(shù)R2為0.99871。分別以方法3 倍信噪比（S/N=3）與10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算檢出限（LOD）為0.012 mg/kg，定量限（LOQ）為0.040 mg/kg。

2.6 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

國(guó)標(biāo)[20]規(guī)定滅蠅胺在豇豆中的最大殘留限量為0.5 mg/kg。選取豆角、黃瓜、大白菜以及不合格、風(fēng)險(xiǎn)較高的豇豆樣品作為4 種代表性蔬菜（樣品已用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)為陰性樣品），按1.3.2 節(jié)方法做加標(biāo)試驗(yàn)，其中每種蔬菜選取3 個(gè)加標(biāo)濃度，各濃度測(cè)定6 個(gè)樣品，結(jié)果見(jiàn)表2。

如表2所示，各基質(zhì)平均回收率在77.7%～87.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.6%～3.7%，說(shuō)明方法穩(wěn)定可靠，精密度與準(zhǔn)確度良好，滿足實(shí)際測(cè)定要求。

表2 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)（n=6）Table 2 Recovery rate and precision experiment （n=6）

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

將建立的方法應(yīng)用于測(cè)定豆角、豇豆等實(shí)際檢出率較高的樣品。從本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽取30份該類樣品，近半樣品中檢出滅蠅胺，其含量在0～1.3 mg/kg 范圍，存在超標(biāo)違規(guī)現(xiàn)象，繼而引發(fā)相關(guān)的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)論

采用碳酸氫銨溶液結(jié)合超聲萃取的方式提取滅蠅胺，用復(fù)合型固相萃取小柱凈化，回收率好，克服了滅蠅胺這類強(qiáng)極性化合物萃取、凈化困難的問(wèn)題。通過(guò)優(yōu)化色譜條件，采用結(jié)合離子對(duì)試劑保留的C8 色譜柱分離，使滅蠅胺出峰尖銳、對(duì)稱，方法特異性好，抗干擾強(qiáng)。本方法相較于現(xiàn)行監(jiān)管判定方法[21]，具有靈敏度高、精密度與重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的除雜效果更為突出。方法的前處理簡(jiǎn)便、高效，單樣測(cè)定成本低廉，有利于推廣應(yīng)用，為蔬菜中滅蠅胺殘留監(jiān)管提供技術(shù)支持。