茶渣堿提取物中的蛋白質(zhì)性質(zhì)分析

魏 漢，劉 派，黃貞勝，張 晨*

（1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 福州 350108 2 福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心 福州 350108 3 福建大昌生物科技實(shí)業(yè)有限公司 福州 350108）

隨著社會(huì)節(jié)奏的加快，人們對(duì)快消茶飲料的需求也越來(lái)越旺盛，茶葉的消費(fèi)模式從家庭式消費(fèi)逐漸向大型茶飲料企業(yè)的采買轉(zhuǎn)變[1]。僅兩家福建省速溶茶加工企業(yè)，每年茶葉消費(fèi)量就達(dá)15 萬(wàn)t，需要處理的茶渣量近10 萬(wàn)t。這些茶渣大多直接用于堆肥或焚燒，而茶渣中含有20%～30%的蛋白質(zhì)[2]，易產(chǎn)生富營(yíng)養(yǎng)污染或形成NO2等有害氣體[3]。深入研究茶渣蛋白質(zhì)的應(yīng)用價(jià)值，可減少副產(chǎn)物的污染，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代食品工業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。

蛋白質(zhì)產(chǎn)品在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在其具有溶解性、起泡性、乳化性等理化性質(zhì)，以及抑菌性、抗氧化性等生理活性。茶蛋白質(zhì)主要包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶、膜蛋白、多酚氧化酶等[4]，由于其有較好的理化性質(zhì)與生理活性[5-6]，可作為食品蛋白質(zhì)原料。本課題組前期研究表明：采用堿法獲得的茶渣蛋白質(zhì)性價(jià)比最高，提取率高達(dá)95%，且每噸蛋白質(zhì)生產(chǎn)成本較低[2]。然而，茶渣蛋白質(zhì)在堿性條件下可能會(huì)與多酚、糖類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，生成褐色復(fù)合物，改變其物質(zhì)組成。分析堿法獲得的茶渣蛋白質(zhì)的組成、分子質(zhì)量分布和理化性質(zhì)，可揭示其理化性質(zhì)變化及生理活性形成的原因。

為提高茶渣蛋白質(zhì)的起泡性、乳化性或抗氧化性，可采用酶（如胃蛋白酶或碳水化合物復(fù)合酶） 對(duì)堿法獲得的茶渣蛋白質(zhì)提取物的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。胃蛋白酶主要通過(guò)斷裂茶渣蛋白質(zhì)上芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵，將茶渣蛋白質(zhì)分解為多肽或氨基酸，從而可能釋放與多肽或氨基酸相連的糖類物質(zhì)或多酚，增加茶渣蛋白質(zhì)的起泡性與乳化性[7]。碳水化合物復(fù)合酶，如ViscozymeRL，可通過(guò)斷裂糖苷鍵，將茶渣蛋白質(zhì)中的糖類物質(zhì)分解為游離態(tài)的小分子寡糖或單糖，同時(shí)可能釋放部分與寡糖或單糖結(jié)合的多酚，促進(jìn)蛋白質(zhì)的分離，提高茶渣蛋白質(zhì)的抗氧化性[8]。

本文以綠茶渣為原料，通過(guò)堿提獲得茶渣蛋白質(zhì)提取物，測(cè)定其組分、分子質(zhì)量分布及各組分中主要成分，以及在不同pH 值下的溶解性、分散穩(wěn)定性、起泡性、乳化性。分析茶渣蛋白質(zhì)提取物的理化性質(zhì)、抑菌性以及與多酚含量的相關(guān)性。采用碳水化合物復(fù)合酶和胃蛋白酶水解茶渣蛋白質(zhì)提取物，以改進(jìn)其產(chǎn)品的起泡性、乳化性和抗氧化性，為茶渣蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶渣，由福建大閩食品有限公司提供。綠茶葉經(jīng)85 ℃的熱水抽提45 min 后，過(guò)濾獲得的茶渣于60 ℃烘干制成綠茶渣樣品。

Viscozyme?L，美國(guó)Sigma 公司；胃蛋白酶、茶多酚，上海源葉生物科技有限公司；其它分析純?cè)噭┚鶠閲?guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CF16RXII 高速離心機(jī)，日本HITACHI 公司；LXJ-IIB 低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TE601-L 分析天平，德國(guó)賽多利斯公司；HH-6 恒溫水浴鍋，金壇市新航儀器廠；TNG-T98 真空干燥儀，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；BR415 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；WKB-100-4 恒溫振蕩器，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；MS-H280-Pro 加熱磁力攪拌器，中國(guó)大龍公司；OMNI Zeta 電位和粒徑分析儀，美國(guó)Brookhaven儀器公司；HR-6B 均質(zhì)機(jī)，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；6890 N 氣相色譜，美國(guó)Agilent 科技有限公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 茶渣蛋白質(zhì)的提取 參考Zhang 等[2]的方法，將10 g 茶渣與200 mL 氫氧化鈉溶液（0.4 mol/L）混合，于加熱磁力攪拌器（95 ℃，4 h）攪拌反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后離心（13 952×g，10 min），分離獲得上清液和沉淀。使用100 mL 去離子水清洗沉淀，充分混合10 min 后離心（13 952×g，10 min），分離獲得沉淀和上清液。重復(fù)清洗沉淀3 次，離心獲得上清液，并將所有的上清液混合。使用鹽酸溶液（1 mol/L）調(diào)上清液至pH 3.5，靜置10 min 后，離心（13 952×g，10 min）獲得蛋白質(zhì)沉淀。加入20 mL去離子水于蛋白質(zhì)沉淀中不斷攪拌，然后緩慢加入氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）將酸沉后的蛋白質(zhì)復(fù)溶至溶液pH 值為7，冷凍干燥后得到茶渣蛋白質(zhì)干燥樣品。

1.3.2 茶渣蛋白質(zhì)的水解 水解條件分別如下：

1） 胃蛋白酶水解 以磷酸調(diào)PBS 緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0）至pH 3.5，使用其配置質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液，并加入20 U 胃蛋白酶。

2） 碳水化合物復(fù)合酶水解 以磷酸調(diào)PBS緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0）至pH 4.0，使用其配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液，并加入10 U 的碳水化合物復(fù)合酶（Viscozyme?L）。

分別取兩種混合液于恒溫振蕩儀 （1 000 r/min，35 ℃，20 h）上水解。水解結(jié)束后，水浴滅活（100 ℃，10 min）。反應(yīng)后將樣品冷卻至室溫，使用氫氧化鈉溶液（0.1 mol/L）調(diào)各酶解液至pH 7，并將蛋白質(zhì)溶液濃度稀釋至5 mg/mL。冷凍干燥后得到茶渣蛋白質(zhì)干燥樣品。

1.3.3 透析去除游離多酚 配制質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液，將該茶渣蛋白質(zhì)溶液放入3 ku 透析袋中，在密閉條件下透析24 h（中間換水3 次），透析結(jié)束將袋內(nèi)溶液冷凍干燥。

1.4 組分測(cè)定

1.4.1 蛋白質(zhì)測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法[9]于波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定樣品吸光度，并以牛血清白蛋白溶液（100 μg／mL）作為標(biāo)準(zhǔn)樣品計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.4.2 多酚測(cè)定 采用酒石酸亞鐵法[10]于波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)定樣品吸光度，并以茶多酚溶液（1 mg／mL）作為標(biāo)準(zhǔn)樣品計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.4.3 灰分測(cè)定 采用《食品中灰分的測(cè)定方法》GB 5009.4-2016[11]，以W（灰分）/W（蛋白質(zhì)干重）計(jì)算蛋白質(zhì)灰分含量。

1.4.4 糖測(cè)定 參考劉路[12]的方法，稱取30.0 mg茶渣蛋白質(zhì)提取物于干凈的具塞試管中，加入2.0 mL 三氟乙酸溶液（2 mol/L），密封振蕩均勻后水解（120 ℃，5 h）。反應(yīng)結(jié)束后，利用氮吹儀吹干（水浴溫度：70 ℃），重復(fù)3～4 次。樣品用色譜級(jí)三氯甲烷溶解，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)微孔濾膜，注入色譜進(jìn)樣瓶，進(jìn)行氣相色譜分析。

氣相色譜操作條件的設(shè)置參照Yu 等[13]的研究。檢測(cè)器：氫火焰離子化檢測(cè)器；色譜柱：RTX-1701 石英毛細(xì)管，0.25 μm×30.0 m；程序升溫：180～220 ℃（5 ℃/min），220 ℃（5 min），220～280 ℃（10 ℃/min）；載氣：氮?dú)?；進(jìn)樣量：1.0 μL。

1.5 理化指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 茶渣蛋白質(zhì)不同pH 值下的溶解性 參考田元勇等[14]的方法，配置pH 值為7.0 的PBS 緩沖液（0.05 mol/L），分別用磷酸調(diào)至不同pH 值（2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0）。稱取10 mg 茶渣蛋白質(zhì)，分別加入不同pH 值的緩沖液2 mL，混勻后離心（13 952×g，10 min），取上清測(cè)定蛋白含量。以V（上清液總體積）×C（上清液蛋白含量）/V（總?cè)芤后w積）計(jì)算蛋白質(zhì)溶解度。

1.5.2 Zeta 電位測(cè)定 通過(guò)Zeta 電位儀的測(cè)定分析茶渣蛋白質(zhì)的分散穩(wěn)定性： 配置質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液于Zeta 電位測(cè)定儀中測(cè)定電位。

1.5.3 粒徑 配置pH 值為7.0 的PBS 緩沖液（0.05 mol/L），并以磷酸調(diào)PBS 緩沖液至pH 5.0。分別使用pH 5.0 和pH 7.0 的PBS 緩沖液配置質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的茶渣蛋白質(zhì)溶液，通過(guò)粒徑分析儀測(cè)定樣品的粒度分布和平均流體動(dòng)力學(xué)直徑。

1.5.4 起泡性及乳化性 參考李永富[15]的方法。

1） 起泡性 取2 mL 茶渣蛋白質(zhì)溶液（10 mg/mL）于均質(zhì)機(jī)（10 000 r/min，2 min）攪打后，測(cè)定泡沫總體積。以V（起泡體積）/W（蛋白質(zhì)）計(jì)算蛋白質(zhì)起泡能力。

2） 乳化性 取2 mL 茶渣蛋白質(zhì)溶液（10 mg/mL）與2 mL 大豆油混合，于均質(zhì)機(jī)（10 000 r/min，2 min）攪打后，離心（3 240×g，10 min），測(cè)定乳化層的體積。以V（乳化層體積）/W（蛋白質(zhì)）計(jì)算蛋白質(zhì)乳化能力。

1.5.5 抑菌性 參考程慧青[16]的方法，選用在7℃以下時(shí)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯的嗜冷菌及在常溫時(shí)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯的假單胞菌測(cè)定茶渣蛋白質(zhì)的抑菌性。

1） 抑菌圈試驗(yàn) 菌液的制備：分別挑嗜單胞菌菌落和嗜冷菌菌落接種至100 mL 液體培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.8），搖床培養(yǎng)（假單胞菌25 ℃，嗜冷菌5 ℃，200 r/min）過(guò)夜。

取20 mL 培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.8）于已滅菌平板，水平靜置凝固，接種0.1 mL 菌液均勻涂布。使用打孔器在培養(yǎng)基上打孔后，取0.1 mL 茶渣蛋白質(zhì)溶液（10 mg/mL）注入孔中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（假單胞菌25 ℃，嗜冷菌5 ℃，200 r/min，12 h）。以1.0 mL 蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。

2） 比濁法測(cè)定抑菌率 菌液的制備：分別取100 mL 假單胞菌及嗜冷菌培養(yǎng)基（牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7.8），于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（假單胞菌25 ℃，嗜冷菌5 ℃，220 r/min，7 h）。培養(yǎng)結(jié)束后，取1 mL 培養(yǎng)液稀釋至OD600為0.5，再將1 mL 稀釋液用無(wú)菌水稀釋至10 mL。

取0.1 mL 茶渣蛋白質(zhì)溶液（10 mg/mL），加入1 mL 菌液，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（假單胞菌25 ℃，嗜冷菌5 ℃，200 r/min，7 h），于波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)定混合液吸光度。以1.0 mL 蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。

1.5.6 抗氧化性 參考黃夢(mèng)姣[17]的方法，選用DPPH·清除能力、ABTS·+清除能力和鐵離子還原力測(cè)定茶渣蛋白質(zhì)抗氧化性。

1） 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·） 清除能力 取不同體積（100，200，300，400，500 μL）樣品溶液（1 mg/mL）與無(wú)水乙醇配制成總體積為500 μL 的溶液，再向溶液中加入1 mL DPPH·乙醇溶液（0.1 mmol/L）并混合均勻，避光靜置20 min 后，于517 nm 處測(cè)定其吸光值（Ai）；在相同條件下，取不同濃度的樣品溶液與無(wú)水乙醇配制成總體積為1.5 mL 的溶液作為空白，測(cè)定其吸光值 （Aj）；以0.5 mL 乙醇與1 mL DPPH·乙醇溶液（0.1 mmol/L）混合作為對(duì)照，測(cè)定其吸光值 （Ac）。以不同體積（200，400，600，800 μL，1 mL） 丁基羥基茴香醚 （Butylated hydroxy anisol，BHA）溶液（0.05 mg/mL）代替樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。

式中：Ai——測(cè)定樣的吸光值；Aj——標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光值；Ac——對(duì)照樣的吸光值。

2） 2，2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基（ABTS·+）清除能力 ABTS·+自由基工作液：取ABTS 二銨鹽儲(chǔ)備液（7.4 mmol/L）與等體積無(wú)水乙醇混合，避光室溫靜置12 h，以PBS 緩沖液（pH 7.4）將混合液稀釋至吸光度為0.70±0.02。取不同體積（40，80，120，160，200 μL）的樣品溶液（1 mg/mL）與無(wú)水乙醇配制成總體積為200 μL 的溶液，再向溶液中加入800 μL ABTS·+自由基溶液并混合均勻，靜置10 min 后，于734 nm 處測(cè)定其吸光值（Ai），以0.2 mL 乙醇與0.8 mL DPPH·乙醇溶液（0.1 mmol/L）混合作為空白，于734 nm 處測(cè)定其吸光值 （Ac）。以不同體積（200，400，600，800 μL，1 mL）BHA 溶液（0.1 mg/mL）代替樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。

式中：Ai——測(cè)定樣的吸光值；Ac——空白樣的吸光值。

3） 鐵離子還原力（FRAP 抗氧化能力） 取不同體積 （0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL） 的樣品溶液（1 mg/mL），加入2.5 mL PBS 緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）和2.5 mL 鐵氰化鉀溶液（10 mg/mL），混合均勻后水?。?0 0，20 min）。取出快速冷卻后，再加入2.5 mL 三氯乙酸溶液（0.1 mL/mL），離心（3 600×g，10 min）。取上清液加入2.5 mL 蒸餾水和0.5 mL 三氯化鐵溶液（1 mg/mL）并混合均勻，靜置10 min 后，于700 nm 處測(cè)定其吸光值。以不同體積（200，400，600，800 μL，1 mL）BHA 溶液 （0.5 mg/mL）代替樣品作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

以3 次重復(fù)試驗(yàn)每次同時(shí)做平行試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)為結(jié)果，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Microsoft excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶渣蛋白質(zhì)提取物的組分與分子質(zhì)量分布

對(duì)堿法提取的茶渣蛋白質(zhì)提取物中的蛋白質(zhì)、總糖、多酚、灰分進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1a 所示。在茶渣蛋白質(zhì)提取物中，蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到了52%。提取物中總糖含量占18%，其中半乳糖醛酸含量最高，達(dá)9.0%。這些半乳糖醛酸主要是來(lái)源于茶渣細(xì)胞壁中果膠[18]。提取物中未測(cè)定的成分占16%，這些成分可能主要來(lái)源于茶渣中多酚氧化形成的醌類化合物、脂質(zhì)（蠟、有機(jī)酸）和木質(zhì)素[19]及木質(zhì)素被降解后的產(chǎn)物[20]。

采用SEC 色譜檢測(cè)茶渣蛋白質(zhì)提取物的分子質(zhì)量分布，結(jié)果如圖1b。茶渣蛋白質(zhì)依據(jù)分子質(zhì)量分布主要分為3 個(gè)組分（F1、F2、F3），其分子質(zhì)量范圍分別為F1＞100 ku，100 ku＞F2＞3 ku，F(xiàn)3＜3 ku。根據(jù)圖1b 中虛線劃分的3 個(gè)區(qū)域進(jìn)行樣品收集，并測(cè)定各組分的蛋白質(zhì)含量，其中，F(xiàn)1 樣的蛋白質(zhì)含量最高，達(dá)到了83.2%，F(xiàn)2 樣蛋白質(zhì)含量為56.3%，F(xiàn)3 樣蛋白質(zhì)含量?jī)H為32.3%。經(jīng)推測(cè)，提取物中的F1 樣蛋白質(zhì)主要來(lái)源于細(xì)胞膜內(nèi)的大分子二磷酸核酮糖羧化酶 （RuBisCO）[21]，F(xiàn)2樣蛋白質(zhì)主要來(lái)源于細(xì)胞壁表面的膜蛋白、細(xì)胞膜內(nèi)的大分子糖蛋白以及各種生物酶[22]，F(xiàn)3 樣蛋白質(zhì)主要來(lái)源于細(xì)胞膜內(nèi)小分子質(zhì)量的多肽、氨基酸等物質(zhì)[23]。

圖1 茶渣蛋白質(zhì)提取物Fig.1 Tea residue protein product

2.2 茶渣蛋白質(zhì)提取物的理化性質(zhì)和抑菌性

2.2.1 茶渣蛋白質(zhì)提取物的溶解度與分散穩(wěn)定性 通過(guò)測(cè)定茶渣蛋白質(zhì)提取物在不同pH 值下的溶解度、Zeta 電位和粒徑分布，探究了其溶解度與分散穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2所示。在pH 值為7 時(shí)，茶渣蛋白質(zhì)提取物具有較好的溶解度與分散穩(wěn)定性。由圖2a 可知，隨著pH 值升高，茶渣蛋白質(zhì)的Zeta 電位由正電位變?yōu)樨?fù)電位，且負(fù)電位時(shí)的絕對(duì)值不斷升高。當(dāng)pH=7 時(shí)，Zeta 電位值為-31.89 mV，此時(shí)溶液應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)不易發(fā)生沉淀。在Zeta 電位為0 mV 時(shí)，茶渣蛋白質(zhì)pH 值為3.6，即為等電點(diǎn)pI。同時(shí)，隨著溶液pH值升高，茶渣蛋白質(zhì)的溶解度呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，在pH 值為7 時(shí)，茶渣蛋白質(zhì)完全溶解，溶解度大于5 mg/mL。由圖2b 可知，隨著pH 值升高，茶渣蛋白質(zhì)粒徑逐漸減小，且在pH 7 時(shí)茶渣蛋白質(zhì)溶液均勻分布。在pH 值為7 時(shí)，茶渣蛋白質(zhì)粒徑的4 個(gè)峰分別出現(xiàn)在4，9，40 和180 nm處，而當(dāng)pH 值為5 時(shí)，粒徑的4 nm 和9 nm 兩處峰消失，40 nm 處的峰增大，并右移至55 nm 附近。當(dāng)pH 值繼續(xù)降低后，由于溶液中蛋白顆粒過(guò)大而沉淀。這是因?yàn)榈鞍追肿右詢尚噪x子形式存在，當(dāng)pH 值靠近pI 時(shí)，分子表面所帶同性電荷減少，靜電排斥作用減小，導(dǎo)致體系中蛋白分子傾向于相互聚集，使溶液溶解度和穩(wěn)定性降低[24]。

圖2 茶渣蛋白質(zhì)提取物不同pH 值下的溶解度和分散穩(wěn)定性Fig.2 Solubility and dispersion stability of tea residue protein product at different pH

2.2.2 茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性和乳化性 通過(guò)測(cè)定茶渣蛋白質(zhì)提取物在不同pH 值下的起泡性與乳化性，結(jié)果如圖3所示。隨著pH 值增大，茶渣蛋白質(zhì)的起泡性與乳化性均呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，其中起泡性快速升高，而乳化性升高緩慢。茶渣蛋白質(zhì)在pH 4 時(shí)，起泡性較低，為13.0 mL/g，當(dāng)在pH 12 時(shí)，起泡性為75.0 mL/g。這可能是因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近時(shí)，蛋白分子所帶同性電荷最少，由于靜電排斥作用減少，蛋白粒子易發(fā)生聚集和絮凝，使得蛋白顆粒表面無(wú)法形成水化層，從而導(dǎo)致起泡性最弱；在偏離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白顆粒間靜電斥力作用增強(qiáng)，分子向界面擴(kuò)散能力增強(qiáng)，保持其形成蛋白膜性狀的能力增強(qiáng)[25]。茶渣蛋白質(zhì)在pH 4 時(shí)，乳化性為33.5 mL/g，當(dāng)在pH 12 時(shí)，乳化性為45.7 mL/g。這是因?yàn)椋琾H 值的升高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)顆粒尺寸變小，蛋白質(zhì)基團(tuán)的親水能力增強(qiáng)，同時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，原本包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，增強(qiáng)了其表面親油活性[26]。然而，可能因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子內(nèi)部疏水基團(tuán)較少，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)乳化性未顯著提高。

圖3 不同pH 值下茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性和乳化性Fig.3 Foamability and emulsification capacity of tea residue protein product at different pH

2.2.3 茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌性與其多酚含量的相關(guān)性 通過(guò)測(cè)定茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物對(duì)嗜冷菌和假單胞菌的抑菌圈及抑菌率，其抑菌效果如圖4所示。結(jié)果表明，茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物對(duì)假單胞菌的抑菌效果強(qiáng)于嗜冷菌。隨著物質(zhì)濃度的增加，茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物抑菌效果不斷增強(qiáng)，且茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌效果均較其脫酚處理產(chǎn)物更佳，該抑菌效果多為提取物中的多酚提供。由圖4a 可知，在接種假單胞菌的培養(yǎng)基中，與空白對(duì)照相比，茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物均呈現(xiàn)出明顯的抑菌圈，且茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌圈范圍較其脫酚處理產(chǎn)物大。在接種嗜冷菌的培養(yǎng)基中，與空白對(duì)照相比，茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌圈范圍較小，其脫酚處理產(chǎn)物則沒(méi)有出現(xiàn)明顯的抑菌圈（見(jiàn)圖4a）。這可能是因?yàn)椴柙鞍踪|(zhì)提取物中的多酚具有較強(qiáng)的抑制假單胞菌活性[27]。由圖4b、4c 可知，隨著茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚處理產(chǎn)物濃度的增大，抑菌率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在質(zhì)量濃度為80 mg/mL 時(shí)，茶渣蛋白質(zhì)提取物對(duì)嗜冷菌和假單胞菌的抑菌率分別可達(dá)98%和93%，具有較好的抑菌活性，而茶渣蛋白質(zhì)脫酚處理產(chǎn)物則分別只有39%和50%，這表明茶渣蛋白質(zhì)的多酚物質(zhì)含量的增大可更為有效地抑制腐敗菌活性，且茶渣蛋白質(zhì)提取物的抑菌率較其脫酚處理產(chǎn)物抑菌率高。

圖4 茶渣蛋白質(zhì)提取物及其脫酚產(chǎn)物對(duì)兩株腐敗菌的抑菌圈試驗(yàn)及抑菌率Fig.4 Inhibition zone experiment and inhibition rate of tea residue protein product and its dialysis products to two putrefactive bacteria

2.3 酶解對(duì)茶渣蛋白質(zhì)提取物性質(zhì)的影響

2.3.1 茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的起泡性和乳化性

在不同體系的工業(yè)應(yīng)用中，蛋白質(zhì)溶液常以中性形式存在，因此測(cè)定pH 7 下茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的起泡性和乳化性，結(jié)果如圖5所示。經(jīng)胃蛋白酶水解后，茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性與乳化性均有較大幅度的提升，而經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶水解后，其起泡性略微升高，乳化性下降，經(jīng)脫酚處理后，其乳化性與起泡性基本無(wú)變化。

圖5 pH 7 下茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的起泡性和乳化性Fig.5 Foamability and emulsification capacity of tea residue protein extract and its enzymatic hydrolysis products at pH 7

與茶渣蛋白質(zhì)提取物起泡性 （40.2 mL/g）相比，經(jīng)胃蛋白酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性（66.7 mL/g）提升了近2 倍，這可能是因?yàn)槲傅鞍酌笖嗔训鞍踪|(zhì)的芳香族氨基酸或酸性氨基酸上的肽鍵，從而增加蛋白質(zhì)的表面疏水性，使蛋白質(zhì)分子在界面大量聚集，提高了蛋白的起泡能力[28]。經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性（52.4 mL/g）略高于茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性，原因可能是碳水化合物復(fù)合酶通過(guò)水解糖類物質(zhì)打破蛋白復(fù)合物的交聯(lián)狀態(tài)，降低蛋白復(fù)合物的親水基團(tuán)，從而增加形成的泡沫數(shù)量，提高了蛋白質(zhì)的起泡性[29]。經(jīng)脫酚處理后，茶渣蛋白質(zhì)提取物的起泡性基本無(wú)影響。

與茶渣蛋白質(zhì)提取物乳化性 （35.8 mL/g）相比，胃蛋白酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的乳化性（100.0 mL/g）有顯著的提高，這可能是因?yàn)槲傅鞍酌竿ㄟ^(guò)斷裂大分子復(fù)合物中蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸或酸性氨基酸的氨基所組成的肽鍵為小分子蛋白-多酚復(fù)合物、蛋白-多糖復(fù)合物、多肽和氨基酸等[30]，使得多酚的親水性酚羥基通過(guò)增加體系的溶解度來(lái)幫助提高乳化性[31]。碳水化合物復(fù)合酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的乳化性（12.0 mL/g）低于茶渣蛋白質(zhì)提取物的乳化性，原因可能是碳水化合物復(fù)合酶在水解蛋白復(fù)合物時(shí)，其中大量游離態(tài)多酚、單糖等小分子親水性物質(zhì)被透析釋放，導(dǎo)致乳化性降低[29]。茶渣蛋白質(zhì)提取物經(jīng)脫酚處理后，其乳化性基本無(wú)變化。經(jīng)脫酚處理后，茶渣蛋白質(zhì)提取物的乳化性基本無(wú)影響。

2.3.2 茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的抗氧化性 通過(guò)測(cè)定DPPH 清除率、ABTS 的清除率和鐵離子還原能力，分析幾種酶解方法對(duì)茶渣蛋白質(zhì)提取物抗氧化性的影響，結(jié)果如圖6所示。茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的抗氧化性均與樣品濃度呈正相關(guān)。經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶水解后，茶渣蛋白質(zhì)提取物抗氧化性顯著提高，而經(jīng)胃蛋白酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的抗氧化性變化較小，但均低于陽(yáng)性對(duì)照BHA 的抗氧化性（Butylated hydroxy anisol，丁基羥基茴香醚）。由圖6a、6b、6c 可知，經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶水解后的茶渣蛋白質(zhì)提取物顯示出較強(qiáng)的DPPH 清除能力、ABTS 的清除能力及鐵原子還原力，僅低于陽(yáng)性對(duì)照BHA。計(jì)算可得，碳水化合物復(fù)合酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物清除DPPH 的IC50為0.18 mg/mL，清除ABTS的IC50為0.07 mg/mL，在樣品質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，其FRAP 值為2.1 mmol/L Fe2+。經(jīng)胃蛋白酶水解后，茶渣蛋白質(zhì)提取物的DPPH 清除能力、ABTS 清除能力及鐵原子還原力的變化較小。計(jì)算可得，胃蛋白酶水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物清除DPPH 的IC50為0.21 mg/mL，清除ABTS 的IC50為0.09 mg/mL，在樣品質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，其FRAP 值為2.0 mmol/L Fe2+。這可能是因?yàn)?，茶渣蛋白質(zhì)提取物對(duì)DPPH 清除率、ABTS 的清除率和鐵離子還原能力與多酚的酚羥基及蛋白質(zhì)上的羥基等相關(guān)。碳水化合物復(fù)合酶水解了復(fù)合物中呈交聯(lián)狀態(tài)的碳水化合物，釋放了大量連接碳水化合物的多酚[29]，而胃蛋白酶通過(guò)水解蛋白質(zhì)為具有暴露羥基的多肽或氨基酸在一定程度上提高了茶渣蛋白質(zhì)的抗氧化性[32]。

圖6 茶渣蛋白質(zhì)提取物及其酶解產(chǎn)物的抗氧化性Fig.6 Antioxidant activity of protein extract from tea residue and its hydrolysates

3 結(jié)論

茶渣堿提取物中蛋白質(zhì)含量為52%，可主要分為3 個(gè)組分（F1＞100 ku，100 ku＞F2＞3 ku，F(xiàn)3＜3 ku）。其中，F(xiàn)1 樣的蛋白質(zhì)含量達(dá)83.2%，具有較高的商業(yè)價(jià)值。茶渣蛋白質(zhì)等電點(diǎn) （pI） 為3.6，當(dāng)pH＞7 時(shí)，蛋白質(zhì)具有良好的溶解度和分散穩(wěn)定性，可較好地應(yīng)用于食品工業(yè)。在茶渣蛋白質(zhì)提取物質(zhì)量濃度為80 mg/mL 時(shí)，茶渣蛋白質(zhì)提取物對(duì)嗜冷菌和假單胞菌的抑菌率分別可達(dá)98%和93%，該抑菌效果多為提取物中的多酚提供。采用碳水化合物復(fù)合酶ViscozymeRL 和胃蛋白酶對(duì)茶渣蛋白質(zhì)提取物進(jìn)行水解，較茶渣蛋白質(zhì)提取物相比，經(jīng)胃蛋白酶水解的起泡性（58.3 mL/g）提升了近1 倍，乳化性（100.0 mL/g）提升了近3 倍。經(jīng)碳水化合物復(fù)合酶ViscozymeRL 水解的茶渣蛋白質(zhì)提取物的抗氧化性提升了約0.5 倍，其清除DPPH 的IC50為0.18 mg/mL，清除ABTS 的IC50為0.07 mg/mL，其在提取物質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL 時(shí)的FRAP 值為2.1 mmol/L Fe2+。茶渣蛋白質(zhì)提取物的性質(zhì)分析與進(jìn)一步優(yōu)化改性，為茶渣資源的合理利用和深度開(kāi)發(fā)提供必要的理論保障。