牛至油對(duì)斷奶仔豬小腸形態(tài)、細(xì)胞因子含量及緊密連接蛋白mRNA表達(dá)的影響

曾 麗，蔡旭濱，閔思明，王小輝，陳凌峰，黃一帆*，馬玉芳*

(1.中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；2.福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

仔豬斷奶技術(shù)引起環(huán)境及飼料等方面的改變，使得仔豬抗病力降低、腸道正常功能受損等，引起腹瀉甚至死亡[1-2]。飼用抗生素因其能有效提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能、抗病能力等作用被大量應(yīng)用于養(yǎng)豬生產(chǎn)中，但其濫用而造成的細(xì)菌耐藥性、機(jī)體抵抗力降低甚至影響人體健康的問題也十分突出。我國(guó)已于2020年7月1日停止生產(chǎn)含有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料[3]。因此，尋找合適的抗生素替代物是行業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點(diǎn)。而植物提取物因其有抗菌、殺菌、提高動(dòng)物免疫力、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能等作用成為替抗熱點(diǎn)之一[4-5]。牛至油(oregano essential oil，OEO)是從植物牛至(OriganumvulgareL.)中提取的一種植物精油，已被我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)作為一種藥物飼料添加劑可長(zhǎng)期在飼料中添加[6-7]。OEO具有抗氧化、促生長(zhǎng)、促進(jìn)消化吸收、增強(qiáng)免疫力等作用，且綠色環(huán)保無污染，可作為飼用抗生素的一種替代物[7-8]。課題組前期研究表明，飼糧中添加OEO能提高血清和小腸組織中胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量，促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)[9]。研究表明，IGF-Ⅰ對(duì)腸道的發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用，并在其發(fā)育過程中起重要作用[10]。但是，目前關(guān)于OEO對(duì)斷奶仔豬腸道健康影響的研究卻鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)在斷奶仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加不同添加量的OEO，通過檢測(cè)試驗(yàn)豬小腸形態(tài)、小腸組織細(xì)胞因子和分泌型免疫球蛋白(SIgA)含及和腸道緊密連接相關(guān)基因表達(dá)的變化，從腸道健康方面探討OEO對(duì)斷奶仔豬保健的作用機(jī)制，為其在斷奶仔豬方面的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑牛至油(半包被的10%牛至油預(yù)混劑，主要成分為香芹酚和百里香酚各占5%，包被材料為輕質(zhì)碳酸鈣)，購(gòu)自福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司[9]。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與分組選取胎次相近、25日齡斷奶的“大白×長(zhǎng)白”二元雜交仔豬120頭，按公母各半、體質(zhì)量相近的原則隨機(jī)分為4組，對(duì)照組(A組)飼喂基礎(chǔ)日糧，3個(gè)試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加OEO 300(B組),500(C組),800(D組) mg/kg，每組3個(gè)重復(fù)。預(yù)試期為5 d，正試期為30 d。日糧配方參見文獻(xiàn)[9]飼養(yǎng)管理與免疫程序按照常規(guī)進(jìn)行。

1.3 測(cè)定的指標(biāo)及方法

1.3.1樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)挑選1頭仔豬剖殺，分別取十二指腸、空腸、回腸，取1份樣品進(jìn)行4%多聚甲醛溶液固定，用于腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的測(cè)定。另取1份樣品裝入凍存管中，-80℃保存，用于腸道細(xì)胞因子(IL-2、IL-6、IFN-γ)和SIgA及仔豬腸道緊密連接相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定。

1.3.2小腸組織樣品處理 具體操作見參考文獻(xiàn)[11],運(yùn)用ImageProPlus6.0軟件計(jì)算腸絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度比值(V/C)。

1.3.3腸細(xì)胞因子和SIgA含量測(cè)定 ELISA測(cè)定腸道組織黏膜中IL-2、IL-6、IFN-γ的含量及不同腸段組織中SIgA含量，具體操作見試劑盒說明書，測(cè)試儀器為全自動(dòng)酶標(biāo)儀(STATFAX2100，Awareness Technology Inc.USA)。

1.3.4仔豬腸道緊密連接相關(guān)基因表達(dá)的測(cè)定 采用熒光定量PCR檢測(cè)仔豬十二指腸、空腸、回腸黏膜的閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)、閉鎖蛋白(Occludin)和跨膜蛋白(Claudin)的mRNA相對(duì)表達(dá)量。具體操作及引物序列按照參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法計(jì)算，△△Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)試驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對(duì)照組。引物序列見表1。

表1 基因的擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 OEO對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響試驗(yàn)仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)見表2。由表2可知，各試驗(yàn)組仔豬腸道絨毛長(zhǎng)度均有一定程度提高,十二指腸和空腸中C組與A組差異顯著(P<0.05);各試驗(yàn)組隱窩深度均有一定程度下降，十二指腸中C組與A組差異顯著(P<0.05)；各試驗(yàn)組絨毛高度與隱窩深度的比值均有一定程度降低，空腸中B組與A組差異顯著(P<0.05)，C組與A組差異極顯著(P<0.01)，回腸中C組與A組差異顯著(P<0.05)。

表2 牛至油對(duì)斷奶仔豬小腸形態(tài)的影響 μm

2.2 OEO對(duì)斷奶仔豬腸道細(xì)胞因子和SIgA的影響由表3可知，各試驗(yàn)組仔豬腸道IL-2、IL-6、IFN-γ及SIgA均有一定程度提高，除回腸IL-2和IL-6以及空腸IFN-γ在3個(gè)試驗(yàn)組中與A組相比無顯著性差異(P>0.05)外，其余各組與A組相比有顯著性差異或極顯著性差異(P<0.05或P<0.01))。

表3 牛至油對(duì)斷奶仔豬腸道組織細(xì)胞因子和SIgA含量的影響

2.3 OEO對(duì)斷奶仔豬小腸緊密連接基因相對(duì)表達(dá)的影響

2.3.1OEO對(duì)斷奶仔豬十二指腸緊密連接基因相對(duì)表達(dá)的影響 從圖1可見，與A組相比，試驗(yàn)仔豬十二指腸腸緊密連接基因表達(dá)量均有一定程度提高，其中除D組Occludin和Cladudin mRNA表達(dá)量顯著提高外(P<0.05)，其余各組與A組相比有極顯著性差異(P<0.01)。

與A組相比，** P<0.01，*P<0.05。下同

2.3.2OEO對(duì)斷奶仔豬空腸緊密連接基因相對(duì)表達(dá)量的影響 從圖2可見，與A組相比，試驗(yàn)仔豬空腸緊密連接基因表達(dá)量均有一定程度提高，其中C組緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)量有極顯著提高(P<0.01)，B、C組Occludin和Cladudin mRNA表達(dá)量有極顯著提高(P<0.01)，而D組有顯著提高(P<0.05)。

圖2 OEO對(duì)斷奶仔豬空腸緊密連接基因相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.3OEO對(duì)斷奶仔豬回腸緊密連接基因相對(duì)表達(dá)量的影響 從圖3可見，與A組相比，試驗(yàn)仔豬回腸緊密連接基因表達(dá)量均有一定程度提高，其中緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)量在C組極顯著提高(P<0.01)，而B、D組顯著提高(P<0.05)，Occludin mRNA表達(dá)量在B、C、D組極顯著提高(P<0.01)，Cladudin mRNA表達(dá)量在B、C、D組顯著提高(P<0.05)。

圖3 OEO對(duì)斷奶仔豬回腸緊密連接基因相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討論

3.1 OEO對(duì)斷奶仔豬小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響斷奶仔豬小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性是仔豬腸道吸收功能和機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，而絨毛高度、隱窩深度及V/C值是反映小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)[12]。研究表明，仔豬早期斷奶會(huì)引起小腸絨毛長(zhǎng)度[13]、形狀[14]、隱窩深度[15]等指標(biāo)變化。腸絨毛能擴(kuò)大腸內(nèi)吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的面積，較高的V/C值更有利于吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而腸絨毛萎縮、隱窩變深則會(huì)降低營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收率[15-16]。日糧中添加百里香酚或香芹酚和百里香酚混合物可增強(qiáng)斷奶仔豬腸道屏障功能，減少斷奶應(yīng)激，改善腸道健康[17-18]。MICHIELS等[19]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加香芹酚和百里酚可提高小腸遠(yuǎn)端V/C值。宋轉(zhuǎn)等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加復(fù)合植物精油(含牛至油、百里香油等)能夠增加斷乳仔豬空腸和回腸的腸絨毛長(zhǎng)度，提高V/C值，緩解腸道損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加不同質(zhì)量濃度OEO可以不同程度地提高十二指腸、空腸和回腸的腸絨毛長(zhǎng)度，降低隱窩深度，提高V/C值，且在飼糧中添加500 mg/kg OEO對(duì)提高小腸V/C值效果最好，這也與本課題組前期研究結(jié)果一致[9]：日糧中添加OEO后，斷奶仔豬平均日采食量、平均日增重提高，腹瀉率降低，且相關(guān)血清激素指標(biāo)及小腸組織中的IGF-Ⅰ含量升高，說明OEO同上述植物提取物一樣能夠促進(jìn)腸道發(fā)育，改善小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)小腸的吸收功能，促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)。

3.2 OEO對(duì)斷奶仔豬腸道細(xì)胞因子、SIgA含量的影響腸黏膜免疫屏障能主要依靠腸道相關(guān)淋巴組織、SIgA和細(xì)胞因子等其他免疫活性物質(zhì)發(fā)揮其免疫功能。SIgA具有防止病原微生物在腸道附著、激活補(bǔ)體及溶解細(xì)菌等作用，而細(xì)胞因子對(duì)腸黏膜免疫屏障作用進(jìn)行調(diào)節(jié)[13]。IL-2能夠激活和促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化，具有免疫激活、免疫耐受及雙向調(diào)節(jié)作用[19]。IL-6可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)IL-2受體，增強(qiáng)IL-2作用等功能，從而改善機(jī)體免疫功能[20]。因此，腸黏膜白介素能夠促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖分化，產(chǎn)生特異性抗體，提高SIgA腸道黏膜免疫功能[21]，而IFN-γ能夠通過促進(jìn)IL-2生成，進(jìn)而發(fā)揮其黏膜免疫的功能。OEO中的百里香酚和香芹酚可增強(qiáng)腸道屏障功能，減少病原微生物對(duì)腸道上皮細(xì)胞的損傷[22]。XUN等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬日糧中添加300或400 mg/kg姜黃素21 d后SIgA的含量增加；白藜蘆醇可通過提高IFN-γ水平和降低TNF-α水平進(jìn)而調(diào)節(jié)仔豬的體液免疫應(yīng)答[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加OEO能不同程度地提高斷奶仔豬腸道黏膜IL-2、IL-6以及IFN-γ和SIgA含量，這可能與OEO有效成分能激活效應(yīng)T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-2、IL-6等有關(guān)，這些細(xì)胞因子能促進(jìn)B細(xì)胞增殖，進(jìn)一步分化為漿細(xì)胞，從而促進(jìn)SIgA的合成，加強(qiáng)腸道的免疫功能。

3.3 OEO對(duì)斷奶仔豬緊密連接基因相對(duì)表達(dá)量影響腸道黏膜屏障發(fā)揮正常功能主要依賴于腸上皮細(xì)胞間緊密連接的狀況，其中緊密連接蛋白Occludin、Claudins和ZO-1等是形成其結(jié)構(gòu)與組成的基礎(chǔ)[25-26]。ZO-1和Occludin的表達(dá)量與腸道屏障的正常功能密切相關(guān)，前者影響腸道屏障的通透性，后者則影響腸黏膜機(jī)械屏障的穩(wěn)定性，而Claudins的磷酸化程度則反映與腸上皮緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)，其磷酸化失調(diào)將導(dǎo)致胃腸屏障功能受損，黏膜通透性增強(qiáng)[25,27]。研究表明，仔豬斷奶后，腸上皮緊密連接蛋白表達(dá)量下降(包括Occludin、ZO-1 mRNA豐度以及ZO-1的表達(dá)量降低)，腸黏膜通透性增加[28],姜黃素可通過上調(diào) Occludin 和ZO-1 表達(dá)來改善緊密連接和腸黏膜屏障功能受損程度，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞間緊密連接，降低腸黏膜通透性，進(jìn)而增強(qiáng)其機(jī)械屏障功能[29]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示在飼糧中添加不同濃度OEO可以不同程度地提高回腸、空腸和十二指腸連接蛋白ZO-1、Claudin、Occludin表達(dá)，其中C組效果最好，表明OEO能通過提高緊密連接基因表達(dá)量，增強(qiáng)腸黏膜機(jī)械屏障功能，但其有效成分如何影響緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)、功能甚至基因表達(dá)的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。