不同前處理方式結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定當(dāng)歸中30種禁用農(nóng)藥殘留量

朱仁愿 ,陳 婷 ,閆 君 ,丁 輝 ,劉國華 ,蒲玉紅 ,李 堅(jiān)

(1.蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院 甘肅省種植中藥材外源性污染物監(jiān)測工程研究中心,蘭州 730050;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,蘭州 730030)

當(dāng)歸是甘肅省的大宗道地藥材,亦屬藥食同源物質(zhì),其藥用歷史悠久,具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便之效,是常用的婦科病“圣藥”[1]?，F(xiàn)今,當(dāng)歸被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、保健品、化妝品等領(lǐng)域產(chǎn)品的生產(chǎn)加工,且出口至美國、日本、韓國等國家和地區(qū)。近年來,國內(nèi)外關(guān)于中藥質(zhì)量安全的負(fù)面事件頻繁曝光,以農(nóng)藥殘留量超標(biāo)為代表的外源性污染問題,嚴(yán)重威脅了民眾的用藥安全和中藥國際貿(mào)易的可持續(xù)發(fā)展[2-3]。隨著我國中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展以及當(dāng)歸產(chǎn)業(yè)的深度開發(fā)研究,當(dāng)歸的需求量不斷增加,因此保障其品質(zhì)的安全性,既與人民飲食用藥安全息息相關(guān),也可提升國際市場競爭力。前處理是農(nóng)藥殘留分析的重要環(huán)節(jié),包括提取、凈化兩個(gè)過程,目的是在提取殘留農(nóng)藥的同時(shí),將油脂、色素、糖類、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸等會(huì)干擾檢測結(jié)果的化學(xué)成分進(jìn)行分離,以達(dá)到凈化效果。目前,常用的前處理方式主要包括直接提取法、Qu ECh ERS法和固相萃取法[4]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),由于中藥材本身含水量普遍較低,直接提取法在提取前未加入水或酸溶液浸泡,無法使植物細(xì)胞溶脹,糖類充分溶解,導(dǎo)致內(nèi)吸性農(nóng)藥提取效率較低。因此,本工作采用Qu ECh ERS法和固相萃取法進(jìn)行前處理,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)同時(shí)測定當(dāng)歸中30種禁用農(nóng)藥殘留量,以期為控制當(dāng)歸質(zhì)量提供數(shù)據(jù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Acquity I-Class/Xevo TQD型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配Mass Lynx 4.1工作站;AH 40型全自動(dòng)均質(zhì)器;Auto EVA-60型平行氮吹儀;5810R型離心機(jī);IQ 7000型超純水機(jī);MS105DU型電子天平;RV 10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;MS 3型渦旋混勻器;KS 501型振蕩器。

混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液:精密稱取30種禁用農(nóng)藥對(duì)照品各10.00 mg,用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL棕色容量瓶中,稀釋至刻度,配制成1 g·L-1混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,密封,于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

QuEChERS鹽包:含無水硫酸鎂6 g、無水乙酸鈉1.5 g,貨號(hào)5982-5755。

QuEChERS凈化管:含無水硫酸鎂900 mg、N-丙基乙二胺300 mg、C18吸附劑300 mg、硅膠300 mg、石墨化碳黑(GCB)90 mg,貨號(hào)5610-2048。

Carb/NH2固相萃取柱:1 g·支-1,貨號(hào)186003877。

30種禁用農(nóng)藥對(duì)照品的純度均大于95.0%;甲醇、乙腈、甲酸、甲酸銨均為色譜純;氯化鈉、甲苯、冰乙酸均為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

23批當(dāng)歸藥材均購自甘肅省定西市岷縣,經(jīng)蘭州市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院丁愛華副主任藥師鑒定。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,3.5μm);柱溫40℃;流動(dòng)相A為含5 mmol·L-1甲酸銨的0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸溶液,B為乙腈;流量0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量2μL。梯度洗脫程序:0～1.0 min時(shí),A為70%;1.0～12.0 min時(shí),A由70%降至0,保持2.0 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子模式掃描;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;碰撞氣為氬氣(純度99.999%);離子源溫度150℃,干燥氣溫度500℃;干燥氣流量900 L·h-1;毛細(xì)管電壓4 kV。

30種禁用農(nóng)藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子。

表1 30種禁用農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of 30 banned pesticides

表1(續(xù))

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 Qu ECh ERS法

精密稱取樣品粉末3 g于50 mL離心管中,加入1%(體積分?jǐn)?shù),下同)冰乙酸溶液15 mL及1顆陶瓷均質(zhì)子,渦旋2 min,靜置30 min,再精密加入乙腈15 mL,渦旋2 min,以300次·min-1速率振蕩10 min,加入QuEChERS鹽包,立即搖散,以300次·min-1速率振蕩3 min,冰浴中冷卻10 min,以4 000 r·min-1速率離心5 min,分取上清液9 mL于Qu ECh ERS凈化管中,渦旋1 min,以300次·min-1速率振蕩10 min,以4 000 r·min-1速率離心5 min,精密吸取上清液5 mL,于40℃氮吹濃縮至近干,用60%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液稀釋至1 mL,渦旋混勻,過0.22μm濾膜,取濾液待測。

1.3.2 固相萃取法

精密稱取樣品粉末3 g于50 mL離心管中,加入15 mL水及1顆陶瓷均質(zhì)子,渦旋2 min,靜置30 min,加入含1%冰乙酸的乙腈溶液30 mL和QuEChERS鹽包,以300次·min-1速率振蕩10 min,以4 000 r·min-1速率離心5 min,分取上清液10 mL,于40℃減壓濃縮至約2 mL,裝入經(jīng)體積比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液預(yù)活化的Carb/NH2固相萃取柱上,用體積比3∶1的乙腈-甲苯混合溶液30 mL洗脫,洗脫液于40℃減壓濃縮至近干,用60%乙腈溶液稀釋至1 mL,渦旋混勻,過0.22μm濾膜,取濾液待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)和Agilent ZORBAX SB-C18色 譜 柱(100 mm×2.1 mm,3.5μm)對(duì)30種農(nóng)藥分離效果的影響,結(jié)果見圖1。

由圖1可知:Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱上甲胺磷響應(yīng)值高,但殺蟲脒分離度差,硫環(huán)磷、氯磺隆等農(nóng)藥響應(yīng)值低;Agilent ZORBAX SBC18色譜柱上各農(nóng)藥峰形良好,響應(yīng)值和分離度均較佳。因此,試驗(yàn)選擇以Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱分離各目標(biāo)物[5]。

圖1 不同色譜柱上30種禁用農(nóng)藥的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 30 banned pesticides on different chromatographic columns

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

用甲醇配制各農(nóng)藥的單標(biāo)準(zhǔn)溶液(20μg·L-1),通過軟件自動(dòng)優(yōu)化和手動(dòng)優(yōu)化30種農(nóng)藥的質(zhì)譜參數(shù)。Mass Lynx 4.1工作站的Target Ly Nxxs軟件自動(dòng)優(yōu)化結(jié)果顯示,殺蟲脒、3-羥基克百威、甲拌磷、硫線磷、甲拌磷砜、苯線磷、苯線磷亞砜、治螟磷各有3對(duì)監(jiān)測離子對(duì),涕滅威砜、甲拌磷亞砜各有4對(duì)監(jiān)測離子對(duì),手動(dòng)優(yōu)化選取其中的2對(duì)監(jiān)測離子對(duì),其中豐度較強(qiáng)的一對(duì)作為定量離子對(duì)。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 稀釋溶劑的選擇

由于各農(nóng)藥極性和溶解度不同,導(dǎo)致其色譜行為差異較大。鑒于流動(dòng)相以乙腈和水為主,試驗(yàn)比較了乙腈和體積分?jǐn)?shù)分別為20%,60%,80%的乙腈溶液作為稀釋溶劑時(shí)各農(nóng)藥的峰形。結(jié)果顯示:乙腈的溶劑化效應(yīng)明顯,其作為稀釋溶劑時(shí),50%左右的農(nóng)藥峰形不好;當(dāng)以20%乙腈溶液為稀釋溶劑時(shí),胺苯磺隆的溶解度不好;當(dāng)以80%乙腈溶液為稀釋溶劑時(shí),保留時(shí)間小于1 min的農(nóng)藥易出現(xiàn)雙峰,可能是由于稀釋溶劑與流動(dòng)相中有機(jī)相比例相差較大引起的;當(dāng)以60%乙腈溶液為稀釋溶劑時(shí),各農(nóng)藥溶解度均較好,且雙峰現(xiàn)象得到顯著改善。因此,試驗(yàn)選擇60%乙腈溶液作為混合對(duì)照品溶液和供試品溶液的稀釋溶劑[6]。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

痕量分析中,基質(zhì)效應(yīng)(ME)會(huì)影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度,一般采取基質(zhì)匹配法和分析保護(hù)劑法來降低ME的影響。試驗(yàn)分別用陰性當(dāng)歸樣品的基質(zhì)匹配溶液和稀釋溶劑稀釋混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,使30種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度依次為10,25,50,75μg·L-1,以各農(nóng)藥在基質(zhì)匹配溶液中與在稀釋溶劑中的峰面積之比計(jì)算ME值。

結(jié)果顯示:兩種前處理方式下,涕滅威的ME值為1.30～1.93,其他農(nóng)藥的ME值為0.24～1.09,說明存在一定的ME。為降低ME的影響,試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配法繪制工作曲線[7]。

2.5 工作曲線和檢出限

取適量的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液,用基質(zhì)匹配溶液逐級(jí)稀釋,配制成6個(gè)濃度水平的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按照儀器工作條件進(jìn)行測定,以各農(nóng)藥質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的定量離子對(duì)峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,不同前處理方式下的線性參數(shù)見表2。

將最低濃度水平的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行稀釋后進(jìn)樣,以不小于3倍信噪比確定檢出限,結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)和檢出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

表2(續(xù))

2.6 精密度試驗(yàn)

將2.5節(jié)中最高濃度水平的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算定量離子對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果顯示QuEChERS法和固相萃取法下30種禁用農(nóng)藥測定值的RSD分別為1.4%～12%和1.0%～13%。

2.7 回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)陰性當(dāng)歸樣品進(jìn)行低、中、高等3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平平行測定5次,計(jì)算回收率,結(jié)果見表3。

表3 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of test for recovery

表3(續(xù))

結(jié)果顯示:30種禁用農(nóng)藥經(jīng)Qu ECh ERS法和固相萃取法處理后的回收率分別為60.4%～140%和61.0%～144%,結(jié)果較為接近,且主要集中在80.0%～90.0%。GCB對(duì)磺隆類農(nóng)藥有較強(qiáng)的吸附性,所以甲磺隆、氯磺隆和胺苯磺隆經(jīng)固相萃取法處理后的回收率均低于經(jīng)QuEChERS法處理后的[8]。內(nèi)吸磷的回收率在兩種前處理方式下均偏高,因其有硫酮式(O)和硫醇式(S)兩種異構(gòu)體,液相色譜-質(zhì)譜法不能做到完全分離,可考慮用氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行驗(yàn)證確認(rèn)。

2.8 樣品測定

按照試驗(yàn)方法對(duì)23批當(dāng)歸藥材進(jìn)行測定,結(jié)果有2批樣品中檢出禁用農(nóng)藥甲拌磷亞砜,其余農(nóng)藥均未檢出,不同前處理方式下甲拌磷亞砜的測定結(jié)果見表4。

表4 樣品分析結(jié)果Tab.4 Analytical results of the samples

結(jié)果顯示,采用QuEChERS法和固相萃取法處理后甲拌磷亞砜的測定結(jié)果較為接近。參考《中華人民共和國藥典》(2020年版)四部通則“甲拌磷及其氧類似物(砜、亞砜)之和,以甲拌磷表示,應(yīng)不得過0.02 mg·kg-1”的規(guī)定,2批樣品均符合要求。

本工作采用不同的前處理方式,提出了UHPLC-MS/MS同時(shí)測定當(dāng)歸中30種禁用農(nóng)藥殘留量的方法。以回收率為指標(biāo)對(duì)不同前處理方式進(jìn)行考察評(píng)估,結(jié)果表明QuECh ERS法和固相萃取法均符合殘留分析的要求,可用于當(dāng)歸中30種禁用農(nóng)藥殘留的定性和定量分析。