通過式固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定淡水魚中14種麻醉劑的殘留量

趙 瑩,尹丹陽,王 瑋,胡佳薇

(陜西省疾病預(yù)防控制中心,西安 710054)

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活水平的逐漸提高,人們對水產(chǎn)品的需求已不僅僅停留在其種類上,同時對其質(zhì)量和鮮活度也提出了更高的要求。為了使水產(chǎn)品保活保鮮,運(yùn)輸和暫養(yǎng)過程中開始廣泛使用漁用麻醉劑來降低水產(chǎn)品的代謝強(qiáng)度、抑制應(yīng)激反應(yīng),以減緩損傷,延長其存活時間。目前,在鮮活魚類的流通環(huán)節(jié)中常使用的漁用麻醉劑有三卡因、普魯卡因、利多卡因、丁香酚類化合物、二氧化碳、乙醚等。丁香酚類化合物屬于天然提取的植物性香料,常作為食品添加劑或化妝品的定香劑。同時,該類化合物對魚類有很強(qiáng)的麻醉作用,具有高效、價格低廉、在水產(chǎn)品體內(nèi)代謝快的優(yōu)點(diǎn)。雖然沒有充分的試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明丁香酚類化合物對人體具有致癌性,但毒理數(shù)據(jù)表明,其對肝細(xì)胞具有一定毒性,存在肝損傷的風(fēng)險。普魯卡因、利多卡因等常見的局部麻醉劑屬于神經(jīng)中樞阻滯藥品,根據(jù)中間鏈的不同,又可分為以普魯卡因?yàn)榇淼谋郊姿狨ヮ惢衔锖鸵岳嗫ㄒ驗(yàn)榇淼孽０奉惢衔颷1]。這些局部麻醉劑具有作用效果快、操作簡單的優(yōu)點(diǎn),但是過量攝入可能會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性反應(yīng),如肌肉震顫、驚厥、昏迷、呼吸抑制等不良反應(yīng)[2]。三卡因是目前應(yīng)用最廣的漁用麻醉劑,具有易溶于水、麻醉效果快、對水產(chǎn)品無毒害性的特點(diǎn)[3-4]。美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)三卡因在指定水產(chǎn)品的運(yùn)輸中使用,但需經(jīng)過21 d的停藥期才能投放市場銷售[5]。丙泊酚化學(xué)名為2,6-雙異丙基苯酚,常作為臨床靜脈麻醉劑,具有麻醉誘導(dǎo)起效快、可控性強(qiáng)且功能恢復(fù)完善等優(yōu)點(diǎn),過量使用會導(dǎo)致心衰及腎衰等[6]。丙泊酚作為一種新型的漁用麻醉劑雖然沒有被廣泛應(yīng)用,但已有文獻(xiàn)報道其在水產(chǎn)品中被檢出[7]。目前,大部分漁用麻醉劑的使用存在廣泛爭議,主要原因是麻醉劑殘留對人體的風(fēng)險危害還沒有完全明確,且國內(nèi)對各種麻醉劑的使用和殘留限量尚無明確的政策法規(guī)[8],缺乏有效的監(jiān)管和安全劑量的權(quán)威判定。

檢測漁用麻醉劑的主要方法有高效液相色譜法[9-10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-12]、氣相色譜法[13]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]等。但檢測對象局限于單一或有限種類,且方法檢出限較高,未見水產(chǎn)品中多種麻醉劑同時檢測的研究報道。本工作的檢測對象兼顧了傳統(tǒng)和新型麻醉劑,提出了氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)同時測定淡水魚中丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、順式-甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙?；惗∠惴?、丙泊酚、三卡因、苯佐卡因、利多卡因、普魯卡因、普莫卡因、丁卡因和布他卡因等14種麻醉劑殘留量的方法,以期為食用魚類產(chǎn)品的麻醉劑質(zhì)量安全監(jiān)管提供檢測參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B-7000C型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀;CPA225D型分析天平;TTL-DCⅡ型氮吹儀;SI-T256型渦旋振蕩器;TG16-WS型高速離心機(jī);SPE-24A型固相萃取裝置。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:準(zhǔn)確稱取適量的14種漁用麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.000 1 g),以甲醇為溶劑,配制成各自的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于4℃冰箱避光密封保存;分別吸取一定量的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用丙酮稀釋,配制成質(zhì)量濃度為100.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于4℃冰箱避光密封保存。使用時,用丙酮稀釋至所需質(zhì)量濃度。

內(nèi)標(biāo)溶液:準(zhǔn)確稱取5.0 mg丁香酚-d3標(biāo)準(zhǔn)品,用甲醇溶解后定容至10 mL,配制成500 mg·L-1內(nèi)標(biāo)儲備溶液;再用丙酮稀釋,配制成5.00 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液,于4℃冰箱避光密封保存。

14種漁用麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)品和丁香酚-d3標(biāo)準(zhǔn)品的純度均不小于95%;其余試劑均為色譜純;試驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

HP-5MS UI毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);載氣為高純氦氣,流量1.0 mL·min-1;進(jìn)樣口溫度250℃;進(jìn)樣量1μL,不分流進(jìn)樣。柱升溫程序:初始溫度80℃;以6℃·min-1速率升溫至170℃,保持1 min;再以50℃·min-1速率升溫至220℃;最后以15℃·min-1速率升溫至270℃,保持4 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊離子(EI)源;離子源溫度230℃;離子化能量70 e V;溶劑延遲時間8 min;傳輸線溫度280℃;碰撞氣為高純氮?dú)?流量1.5 mL·min-1;猝滅氣為高純氦氣,流量2.25 mL·min-1;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式,其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

1.3 試驗(yàn)方法

將淡水魚樣品清洗干凈,去除頭、骨、內(nèi)臟,取肌肉等可食部位絞碎,混合均勻,于-18℃以下冷凍保存,備用。準(zhǔn)確稱取混勻樣品2 g(精確至0.000 1 g)于50 mL聚丙烯離心管中,加入5.00 mg·L-1內(nèi)標(biāo)溶液100μL和水5 mL,渦旋混勻,使樣品完全浸潤,靜置30 min。精密加入乙腈10 mL,渦旋混勻,以500次·min-1速率劇烈振蕩10 min后,加入氯化鈉2 g鹽析分層,以8 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min。取5 mL上清液加載到PRi ME HLB柱上,收集流出液。取2 mL流出液于10 mL離心管中,加入50μL二甲基亞砜(DMSO),常溫下氮吹至近干,用1.0 mL丙酮復(fù)溶,振蕩30 s,再用0.22μm微孔濾膜過濾,濾液供GCMS/MS測定。根據(jù)保留時間和特征離子對定性,內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),進(jìn)樣口溫度、進(jìn)樣方式等色譜條件對目標(biāo)物的峰形和靈敏度都有較大影響,主要表現(xiàn)為:進(jìn)樣口溫度過低,后出峰的丁卡因、普莫卡因和布他卡因等靈敏度降低;進(jìn)樣口溫度過高,前出峰的丁香酚類目標(biāo)物拖尾嚴(yán)重。當(dāng)進(jìn)樣口溫度為250℃,不分流進(jìn)樣時,各目標(biāo)物的峰形尖銳、對稱且柱流失較小,后出峰的丁卡因、普魯卡因和布他卡因的靈敏度較高。

試驗(yàn)選用HP-5MS UI、INNO-WAX毛細(xì)管色譜柱對14種目標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明:INNO-WAX毛細(xì)管色譜柱對丙泊酚、甲基丁香酚的分離能力較差,三卡因、苯佐卡因的響應(yīng)值較低,普莫卡因、布他卡因在該色譜柱上較難出峰;而HP-5MS UI毛細(xì)管色譜柱能夠?qū)?4種目標(biāo)物較好分離,且各組分的響應(yīng)值較高。

綜上分析,試驗(yàn)選擇進(jìn)樣口溫度為250℃,進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣,選用HP-5MS UI毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離。MRM模式下混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖如圖1所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the mixed standard solution

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

在選定的色譜條件下,對14種目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)進(jìn)行單桿全掃描(MS1 Scan)分析,得到每種物質(zhì)的總離子流色譜圖。依次選擇相對豐度較高的一級碎片為各目標(biāo)物的前級離子。在同樣的色譜條件下,選擇產(chǎn)物離子(Product Ion)掃描模式,設(shè)定適宜的碰撞電壓,使碰撞氣對目標(biāo)物的前級離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離,產(chǎn)生碎片離子,得到二級質(zhì)譜圖。依次選取3組豐度高且基質(zhì)干擾小的碎片離子與前級離子組成定量和定性離子對,選擇EI源和MRM模式,進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量,確保特征碎片離子產(chǎn)生的離子對強(qiáng)度達(dá)到最大。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 凈化方法的選擇

水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜,需要對樣品進(jìn)行有效的凈化,以去除脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖類、有機(jī)酸等干擾物質(zhì),保證準(zhǔn)確定量的同時避免色譜柱和離子源的污染。常用的凈化方法主要有液液萃取法、分散固相萃取法和固相萃取法等。液液萃取法是將乙腈飽和的正己烷溶液直接加入到提取液中,利用目標(biāo)物和雜質(zhì)在兩相中重新分配的原理對基質(zhì)進(jìn)行除脂凈化。該方法能大大提高目標(biāo)物的回收率,但是對樣品中有機(jī)酸、糖類及其他極性較強(qiáng)的雜質(zhì)去除效果不好,上機(jī)檢測后雜質(zhì)峰明顯,對魚類基質(zhì)的凈化效果不理想。分散固相萃取法是使用Qu ECh ERS萃取包凈化樣品。雖然QuECh ERS已不再局限于果蔬中農(nóng)藥殘留的檢測,但檢測高脂肪和高油脂的動物性樣品時,需要對現(xiàn)有的QuECh ERS進(jìn)行改進(jìn)。這是因?yàn)槭惺鄢善份腿“衅毡椴捎玫氖己?GCB)對油脂類雜質(zhì)的凈化效果差,且GCB的吸附性較強(qiáng),目標(biāo)物不易洗脫,所以在試驗(yàn)過程中需要根據(jù)待測樣品和目標(biāo)物的實(shí)際情況對C18吸附劑、N-丙基乙二胺(PSA)、GCB等吸附凈化材料及其配比進(jìn)行選擇和優(yōu)化。

常用的固相萃取法主要依靠硅膠柱、C18柱、HLB柱等實(shí)現(xiàn)樣品的凈化。使用硅膠柱等正相柱進(jìn)行固相萃取時,需在提取之后置換弱極性溶劑上樣,這不僅增加了前處理步驟,而且置換溶劑的氮吹過程易造成目標(biāo)物(如丁香酚類化合物,沸點(diǎn)較低)的損失。使用C18柱和HLB柱等反向柱進(jìn)行固相萃取時,需要活化、淋洗和洗脫等步驟,尤其C18柱不能干柱使用,在實(shí)際操作中更加繁瑣。與之相比,同為反向柱的PRiME HLB柱更具優(yōu)勢,使用通過式處理的方式,無需活化和平衡,提取液直接上柱,雜質(zhì)在柱上保留,目標(biāo)物直接通過,被收集于流出液中,簡化和加速了凈化過程。因此,試驗(yàn)選擇PRiME HLB柱凈化樣品。

2.4 提取溶劑的選擇

提取液直接過柱后被收集,無需淋洗和洗脫條件的優(yōu)化,因此提取溶劑既要保證目標(biāo)物在提取步驟中的提取率,又要確保凈化過程中目標(biāo)物的回收率。常用80%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈溶液提取傳統(tǒng)水產(chǎn)品中的丁香酚類化合物[16]。在本方法中,為保證不同種類的麻醉劑過柱后均能獲得較好的回收率,考察了以乙腈和體積分?jǐn)?shù)分別為70%,80%,90%的乙腈溶液為提取溶劑時對各目標(biāo)物回收率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 提取溶劑對14種麻醉劑回收率的影響Fig.2 Effect of the extract solvent on recovery of 14 anesthetics

結(jié)果表明:對于丁香酚類化合物,使用80%乙腈溶液的回收率比使用其他體積分?jǐn)?shù)的乙腈溶液要高,但是其他種類目標(biāo)物的回收率總體偏低;使用乙腈提取后,丁香酚類化合物的回收率雖然比使用80%乙腈溶液的偏低,但苯佐卡因、利多卡因、普莫卡因、普魯卡因、丁卡因和布他卡因等麻醉劑的回收率均有顯著提高,且14種麻醉劑的回收率均能達(dá)到85.0%以上,滿足同時檢測的需求。同時,用乙腈提取后,無需除水,更易氮吹濃縮,減少了后續(xù)步驟中目標(biāo)物的損失。因此,試驗(yàn)選擇的提取溶劑為乙腈。

樣品經(jīng)乙腈提取凈化后,將乙腈置換成丙酮,便于上機(jī)檢測。在使用常規(guī)的氮吹方法對凈化液進(jìn)行濃縮時,發(fā)現(xiàn)丁香酚類化合物因沸點(diǎn)低、易氣化的原因,很容易造成損失,其回收率均小于60.0%,其中丁香酚和異丁香酚的回收率不足50.0%。為解決丁香酚類化合物損失問題,試驗(yàn)選擇在凈化液中加入微量的DMSO。由于DMSO的沸點(diǎn)高,能與大多數(shù)有機(jī)溶劑互溶,且對丁香酚類化合物的溶解性好,通過微量的加入,可使其保留在DMSO中,減少了加熱氮吹過程中的氣化損失,有效提高了目標(biāo)物的回收率。

2.5 工作曲線、檢出限和測定下限

選取陰性樣品為空白基質(zhì),依次加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,配制成各目標(biāo)物質(zhì)量濃度為0,0.005,0.010,0.020,0.040,0.060,0.080,0.100,0.200,0.400 mg·L-1,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為0.100 mg·L-1的基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。按照儀器工作條件進(jìn)行測定,以各目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo),其對應(yīng)的峰面積比為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果顯示:14種麻醉劑工作曲線的線性范圍為0.005～0.400 mg·L-1,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear regression equations and correlation coefficients

采用逐級稀釋空白基質(zhì)加標(biāo)溶液的方式,以信噪比(S/N)為3時對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為檢出限,以S/N為10時對應(yīng)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為測定下限,結(jié)果得14種麻醉劑的檢出限均為0.001 mg·kg-1,測定下限均為0.002 5 mg·kg-1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

在空白基質(zhì)中加入低、中、高等3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和一定量的內(nèi)標(biāo)溶液,每個濃度水平平行處理6份,按照儀器工作條件進(jìn)行分析,計算各目標(biāo)物的日內(nèi)回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD);按照同樣的方法,連續(xù)6 d,每天制備低、中、高等3個濃度水平的空白加標(biāo)樣品,按照儀器工作條件進(jìn)行分析,計算各目標(biāo)物的日間回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表3。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表3(續(xù))

結(jié)果顯示:14種目標(biāo)物的日內(nèi)回收率為78.2%～120%,測定值的RSD為1.6%～10%,日間回收率為75.3%～118%,測定值的RSD為1.3%～9.7%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度、精密度和重現(xiàn)性,滿足魚類樣品中麻醉劑殘留檢測分析的要求。

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對市售的草魚、黑魚、鮰魚、鯽魚、江團(tuán)、鯉魚、鰱魚、鱸魚、鱘魚等33份鮮活淡水魚樣品進(jìn)行分析,其中草魚樣品的總離子流色譜圖見圖3。

圖3 總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatogram

結(jié)果顯示,4份草魚、1份黑魚、1份鮰魚、2份鯽魚、1份江團(tuán)、3份鯉魚、2份鰱魚、1份鱸魚共15份樣品中檢出丁香酚,檢出率為45.5%,最低檢出量為0.013 6 mg·kg-1(草魚),最高檢出量為0.462 mg·kg-1(草魚),其余麻醉劑均未檢出。

本工作提出了通過式固相萃取-GC-MS/MS同時測定淡水魚中14種麻醉劑含量的方法。樣品經(jīng)乙腈提取后,使用通過式PRiME HLB柱凈化,在濃縮過程中加入微量DMSO,有效減少了目標(biāo)物的損失,提高了檢測的靈敏度。該方法具有雜質(zhì)干擾小、準(zhǔn)確度好、靈敏度高、方法簡便快捷等優(yōu)點(diǎn),各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足日常檢測分析要求,適用于魚類樣品中多種麻醉劑殘留的同時檢測和快速確證。