20個玉米自交系SSR指紋圖譜的構建

連靈燕，趙 慧，王國英，王建華，孫世賢

（1.長治市潞州區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山西 長治 046000；2.中國農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學與生物技術學院種子科學系，北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京 100081；4.全國農(nóng)業(yè)技術推廣服務中心，北京 100125）

DNA指紋圖譜是根據(jù)每個品種的DNA組成，為其建立的可見的條碼式譜帶圖譜。它提供的證據(jù)是品種的基因型，是穩(wěn)定的DNA帶譜，不受栽培條件影響，并可通過計算機進行系統(tǒng)管理。DNA指紋圖譜技術可對植物基因做出明確的鑒定，特別是對那些沒有準確系譜記載的育種材料進行遺傳分類，彌補系譜記載的缺失；育種人員可以采用這項技術鑒定自交系的遺傳特征，保護這些自交系的品種權免受侵犯。因此，研究玉米自交系的指紋圖譜具有重要意義。

本研究利用SSR分子標記技術構建20個玉米自交系的指紋圖譜，以期找出其特征譜帶，以便進一步利用并發(fā)揮其優(yōu)勢。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究所用的材料包括20份玉米自交系，其中昌7-2、P138、478、HC、Mo17、Sh15、鄭58、B73、丹598、9058為育種中常用的優(yōu)良自交系，HCL2、HCL4、HCL5、P1、紫58、P2、J53、L50、Y1382、Y1281為中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術學院種子科學系近年選育的優(yōu)良自交系。

表1 20個玉米自交系的編號及名稱Tab.1 The number and name of 20 maize inbred lines

1.2 SSR分析

1.2.1 基因組DNA提取

采用改進的CTAB法提取葉片總DNA，用紫外可見分光光度計檢測DNA的濃度，將DNA樣品稀釋至10 ng/μL備用。

1.2.2 PCR擴增

PCR擴增所需SSR引物由上海生工合成，溶解后置于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

反應體系：每20μL體積中含1×EasyTaq Buffer，0.4 mmol/L dNTP Mix，SSR引 物(正 向 引 物 和 反 向 引 物)各0.25μmnol/L，1U EasyTaq DNA聚合酶，20 ng DNA模板，反應液上加蓋一滴礦物油，于ABI 9700型PCR擴增儀上進行擴增。反應程序：94℃預變性5 min，1個循環(huán)；94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸40 s，共進行35個循環(huán)，最后在72℃延伸7 min。

1.2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳

在擴增產(chǎn)物中加入1/6體積的Loading Buffer，用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。緩沖液為1×TBE，400V電壓電泳2 h，銀染顯影。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.3.1 指紋圖譜數(shù)字化

讀取SSR標記，將SSR帶型轉換為0、1、2數(shù)據(jù)，在相同遷移率位置，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“2”，建立數(shù)字指紋數(shù)據(jù)庫。

1.3.2 SSR引物的多態(tài)性信息量分析

多態(tài)性信息量（Polymorphism Information Content，PIC）是指一個標記依靠其可檢測的等位基因數(shù)和它們的分布頻率，從而得到該標記在一個群體中檢測的多態(tài)性大小值。PIC值按照Anderson等[1]的方法計算，對于標記i的PIC值計算公式為：

式中：Pij——標記i的第j個帶型出現(xiàn)的頻率，標記i的總帶型從1～n。PIC值的大小為0～1，0——無多態(tài)性，l——具有非常高的多態(tài)性（Anderson et al，1993）。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選及其多態(tài)性

本研究依據(jù)MaizeGDB（http://www.maizegdb.org/）上提供的資料，初步選擇了225對SSR引物。引物的選取原則是在染色體上均勻分布。根據(jù)225對SSR引物的擴增結果，最終選取帶型清晰、重復性好、多態(tài)性高的21對引物作為構建指紋圖譜的核心引物，統(tǒng)計結果見表2。21對SSR引物均勻分布于玉米10條染色體上，在20個玉米自交系共檢測出105個等位變異，引物等位位點數(shù)在3～10個，平均每對引物檢測出5.0個等位變異。引物等位位點多態(tài)性信息含量PIC變幅為0.460～0.780，平 均0.643。其 中 以 引 物umc2164值 最 高（0.780），引物umc1072值最低（0.460）。從表2還可看出，SSR多態(tài)性信息含量與等位變異數(shù)不盡一致。

表2 SSR引物序列及其擴增的多態(tài)性帶數(shù)Tab.2 The SSR primer sequence and the number of polymorphic bands amplified

2.2 DNA指紋圖譜的構建

根據(jù)擴增的帶型，選出在大部分材料中都僅擴增出一條譜帶，且多態(tài)性、重復性好，能區(qū)分所有供試材料的引物，用于構建本試驗的20個玉米自交系的指紋圖譜。其中有umc1038、bnlg2047、umc2323、umc2164、umc1432、umc1072、umc1037、phi308707、umc1185等9對引物組合可以將供試材料分開；引物umc1037對材料1有特征譜帶；引物umc1185對材料7有特征譜帶；引物umc2323對材料12有特征譜帶；引物bnlg2047對材料5，13，20有特征譜帶；引物umc2164對材料10、16、18有特征譜帶；umc1072與phi308707組合區(qū)分材料2、3、4；其余材料可由引物bnlg2047、umc2164、umc1432、umc1072、umc1037、phi308707與phi116的組合來區(qū)分。

趙久然等[3]提出當引物對的等位基因數(shù)為N時，理論上該引物可區(qū)分的最大自交系的數(shù)為N。本研究確定的一套21個核心引物組合可區(qū)分的最大自交系數(shù)N=1.79×1014，且得到相同指紋圖譜的概率P=5.6×10-15。因此，用這套引物來構建20個玉米自交系的指紋圖譜是完全可行的。將篩選到的21對引物所擴增的條帶出現(xiàn)與否進行記錄，將DNA指紋轉換成由1和0組成數(shù)值，完成指紋圖譜的數(shù)字化，見表3。

表3 用引物umc2164建立的20個玉米自交系的數(shù)字指紋Tab.3 The digital fingerprints of 20 maize inbred lines established with primer umc2164

3 結果與討論

3.1 玉米自交系SSR指紋圖譜的構建與應用

指紋圖譜的建立可為自交系材料的保護提供重要依據(jù)。此外，指紋圖譜的遺傳距離、親緣關系分析同樣是對指紋圖譜的重要應用，其分析結果可以幫助育種家較為準確地進行種質資源的血緣類群劃分以及雜種優(yōu)勢的預測，減少了育種的盲目性。

利用SSR技術建立指紋圖譜除了結果可靠、應用廣泛的優(yōu)越性外，也存在一定的局限性。如：改良品種與被改良品種的雙親血緣關系極為相近，難以利用SSR標記將其全部區(qū)分。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因主要是SSR標記與基因連鎖不緊密或與SSR標記連鎖的基因并不完全表達。所以，在構建玉米DNA指紋圖譜時對于差異小的品種如改良品種和轉基因品種，應增加引物數(shù)量，且最好在每條染色上均勻分布。

3.2 核心引物的選取

在選取核心引物時，多態(tài)性信息量是重要的選擇條件，但同時還應充分考慮引物對的整體的區(qū)分效果,盡可能反映出基因組的差異。多態(tài)性信息量高說明其擴增產(chǎn)物的多樣性好，能區(qū)分較多的供試材料，從而用較少的引物就可以將供試材料分開；對于少數(shù)特殊的材料（不易找出特征譜帶或不易區(qū)分），只有個別PIC值較低的引物，對其有特征性譜帶或與其他引物組合才能將其區(qū)分開，為了便于區(qū)分供試材料也應保留這些引物，如：本實驗中引物umc1072、umc1185雖然它的PIC值低于0.5，但由于umc1185對材料7有特征性譜帶，umc1072與引物與phi308707組合能區(qū)分親緣關系較近的材料HCL2、HCL4、HCL5。