茭白內(nèi)生真菌的分離與鑒定

陳 虹，丁晨曦

（浙江樹人學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310015）

菰[Zizania latifolia（Griseb.）Stapf]別稱茭白、茭瓜、茭筍、高瓜等，是一種在我國有著3 000 多年種植歷史的禾本科水生植物。古人采集菰的種子即菰米食用，早在我國周朝時期菰就被記為六谷之一[1]。在后來的種植過程中，菰植株被菰黑粉菌（Ustilago esculentaP.Henn）侵染后，抽穗開花受到抑制，莖部組織膨大成肉質(zhì)莖，即為鮮嫩可食用的茭白，后來成為主要的蔬菜經(jīng)濟(jì)作物。

菰黑粉菌是一種典型的植物內(nèi)生真菌，會刺激菰植株內(nèi)細(xì)胞的異常生長，使菰成為一種特殊的蔬菜。茭白作為我國第二大水生蔬菜，已有許多相關(guān)研究報道，其中菰黑粉菌在孕茭過程中的作用已被研究得較為透徹。由于菰黑粉菌的影響，茭白有3 種表現(xiàn)型，即正常茭、灰茭及雄茭。菰植株被菰黑粉菌侵染并成功繁殖后，其莖部膨大形成可食用的正常茭，且菰黑粉菌與茭白植株多年同生，即菰黑粉菌以菌絲型（MT型）存在；若黑粉菌潛伏周期縮短，則在茭白膨大初期，內(nèi)部形成黑褐色冬孢子（T型），使得茭白潔白的肉質(zhì)莖中布滿黑色斑點，這樣的茭白則稱為灰茭，一般不能食用；如果菰植株成功抵抗住了菰黑粉菌的侵入，能夠繼續(xù)開花結(jié)實，但不會長出茭白的植株稱為雄茭[2-3]。

植物內(nèi)生真菌在多數(shù)情況下并不影響植物的正常生長發(fā)育，不會表現(xiàn)出病害癥狀。內(nèi)生真菌普遍存在于植物組織內(nèi)，種類較多，根據(jù)內(nèi)生真菌與宿主專一性分析，平均每種植物中約有4～5 種內(nèi)生真菌[4]，基于全球龐大的植物種類，可見植物內(nèi)生真菌的總數(shù)量巨大。目前，內(nèi)生真菌與宿主植物之間的共生機(jī)制、內(nèi)生真菌天然代謝產(chǎn)物、對植物生長和抗病蟲害作用機(jī)制等都是研究熱點。關(guān)于茭白內(nèi)生真菌的研究，一直以來對菰黑粉菌的關(guān)注較多[5]，除占夢丹從茭白植株中分離到毛霉菌和煙管菌外[6]，少有茭白中其他內(nèi)生真菌的報道。本研究對正常茭白和灰茭中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定，為茭白內(nèi)生真菌的多樣性研究、內(nèi)生真菌的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 植物材料

2021年12月初采自寧波市海曙區(qū)洞橋鎮(zhèn)百樑村水田的正常茭白2 kg和灰茭0.5 kg。

1.1.2 主要試劑

次氯酸鈉、無水乙醇、葡萄糖為市售分析純試劑，氨芐青霉素、UNIQ-10 柱式真菌基因組抽提試劑盒、真菌通用引物ITS1 和ITS4、PCR 擴(kuò)增試劑盒（Taq）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

光學(xué)顯微鏡[尼康儀器（上海）有限公司，YS 100]、PCR 儀（美國BIORAD 公司，MJ-PTC-200）、凝膠電泳儀（杭州博日科技股份有限公司，GE-100）、高壓滅菌鍋（日本Hirayama 公司，HVA-110）、搖床（上海蘇坤實業(yè)有限公司，SKY-2102C）。

1.2 方法

1.2.1 真菌的分離培養(yǎng)

先將茭白樣品用實驗室流水清洗干凈，再使用無菌水沖洗3遍，次氯酸鈉消毒8 min，無菌水沖洗3遍，75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3 遍。用滅菌過的解剖刀切去茭白表皮，然后將中間部分組織切片，切取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的組織切片，置于含氨芐青霉素的PDA 固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3～7 d。取最后一次沖洗茭白的無菌水涂布于PDA 平板上培養(yǎng)作為對照。定期觀察茭白樣品組織切片周圍是否有菌絲長出，及時轉(zhuǎn)接。采用菌絲頂端純化法對分離到的真菌進(jìn)行2～3次分離純化。

1.2.2 真菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：純化后的絲狀真菌采用插片法觀察菌絲及孢子形態(tài)，單細(xì)胞真菌直接挑取少量菌落用生理鹽水稀釋后蓋上蓋玻片鏡檢，并結(jié)合各個菌株的菌落形態(tài)，對照《真菌分類學(xué)》[7]進(jìn)行形態(tài)鑒定。

內(nèi)生菌株的ITS 分子鑒定：將純化的菌種接種至PDA 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，通過抽濾、離心的方法獲得菌體。采用上海生工的UNIQ-10 柱式真菌基因組抽提試劑盒制備各菌株的基因組DNA。選擇通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），進(jìn) 行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為50 μL（2×Taq Mix 25 μL，DNA模板、ITS1、ITS4 各1 μL，ddH2O 22 μL）。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃5 min；94 ℃45 s，55 ℃30 s，72 ℃10 s，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。之后取10 μL 反應(yīng)液用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。將PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）進(jìn)行序列相似性比對分析，利用MEGA7.0 軟件的NJ 法對擴(kuò)增片段序列和部分已知的真菌DNA序列做進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常茭白與灰茭的觀察

將正常茭白及灰茭對半切開后可見兩者內(nèi)部的不同（見圖1），正常茭白組織白色細(xì)膩，灰茭內(nèi)部則分布著一個個黑色的冬孢子堆，取冬孢子堆粉末進(jìn)行稀釋鏡檢，可以看到褐色圓形的黑粉菌冬孢子。

圖1 正常茭白、灰茭及黑粉菌冬孢子形態(tài)

2.2 真菌分離純化及形態(tài)鑒定結(jié)果

將正常茭白及灰茭經(jīng)外部消毒后，組織切塊接種于PDA 平板，48 h 后隱約可見組織塊邊上有菌落及菌絲長出，至72 h 左右菌落菌絲明顯可見，此時取菌絲尖端進(jìn)行分離，并多次在平板上劃線分離純化，最終篩選得到6 種形態(tài)的真菌。菌落及鏡檢照片如圖2 所示，結(jié)合菌落形態(tài)學(xué)特征及典型的菌絲特征，查詢《真菌分類學(xué)》后作出初步鑒定。

圖2 茭白中6株內(nèi)生真菌的菌落及鏡檢照片

J-1～J-5 分離自正常茭白的組織，其中包括3 種酵母及2種絲狀真菌。J-1的菌落為紅色酵母樣，在最初被認(rèn)為是環(huán)境污染所致，但是數(shù)次重復(fù)分離實驗中均發(fā)現(xiàn)此菌出現(xiàn)在正常茭白周邊，且作為對照的空白平板未有真菌污染，所以判斷此菌源自于正常茭白組織內(nèi)。J-2 菌落潔白蓬松，經(jīng)過平板插片法觀察到鐮刀形的分隔孢子，為典型的鐮刀菌屬真菌。J-3 與J-2菌一開始混合生長，經(jīng)過多次分離后純化出來。J-3菌落呈絮狀，初期白色，老后變暗；背面呈褐色，插片法觀察到典型的棒狀具有縱橫隔膜的分生孢子，可確定為鏈格孢屬真菌。J-4、J-5 的菌落為乳白色酵母狀，J-4 的菌落光滑且邊緣整齊，J-5 的菌落表面有些干燥。經(jīng)過鏡檢觀察，J-4 具有酵母菌橢圓形單細(xì)胞且出芽生殖的典型特征，J-5 菌株則是多個橢圓形出芽細(xì)胞連起來呈假菌絲狀。J-6 菌是源自于灰茭內(nèi)部的黑粉菌孢子。對于灰茭內(nèi)生真菌的分離，本實驗采取了組織切片放置培養(yǎng)及冬孢子稀釋涂布培養(yǎng)，組織切片樣本周邊生長的菌落形態(tài)單一，且與冬孢子涂布后長出來的菌落形態(tài)一致，菌落乳白色，外觀類似酵母菌落，但該菌落表面粗糙、較干燥，邊緣規(guī)則。用接種環(huán)挑取少許菌落進(jìn)行稀釋鏡檢，看到細(xì)長針狀具分隔的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可產(chǎn)生分枝，這與李志蘭等在菰黑粉菌孢子萌發(fā)過程形態(tài)學(xué)觀察到的情況一致[8]。

2.3 茭白內(nèi)生真菌的5.8S rDNA-ITS序列分析

將6 株內(nèi)生真菌提取基因組，進(jìn)行ITS 序列PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物交由上海生工進(jìn)行測序后，所得到的結(jié)果放在NCBI 上進(jìn)行Blast 比對，除J-4 菌株與最為相似的Pichia cactophila菌株的序列比對相似度為94.82%外，其余菌株與各自對比菌株的最高相似度均高于96%。將所得菌株的測序序列及Blast 網(wǎng)站上比對結(jié)果最相似的序列通過MEGA 7.0 軟件，采用臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖3）。J-2、J-3、J-6 菌株與各自最相似菌株的自檢支持率為100%，J-1、J-5 菌株與其最相似菌株的自檢支持率均為99%，結(jié)合之前各個菌株的菌落特征及鏡檢到的菌絲、孢子形態(tài)特征，可以確定各自的歸屬（見表1）。J-4 菌株與最相似菌株的序列比對相似度自檢支持率僅為84%，因此無法確定到具體的屬名，只知是酵母科（Saccharomycetaceae）微生物。

圖3 茭白6株內(nèi)生真菌與相關(guān)種的ITS DNA系統(tǒng)發(fā)育樹

表1 茭白6株內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

本研究對正常茭白和灰茭的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定，得到鐮刀菌屬和鏈格孢屬真菌各1株，酵母菌3株，菰黑粉菌1 株。與此前占夢丹在茭白中分離到的煙管菌、毛霉菌不同，這5 種真菌均為首次檢出。在灰茭中僅分離到菰黑粉菌，未分離到別的菌株；在正常茭白中分離到其他5 種真菌。由于本實驗取樣時間在冬季，氣候寒冷，植株和微生物處于休眠期，若在生長旺盛的季節(jié)，有可能會分離到更多種類的內(nèi)生真菌。冬季灰茭內(nèi)部已經(jīng)形成大量的黑粉菌冬孢子堆，其菌絲充滿茭白組織內(nèi)，具有明顯生長優(yōu)勢，其他內(nèi)生真菌的含量極少。曹乾超等用切片和研磨法從正常茭白中分離出菰黑粉菌，認(rèn)為采用茭白組織研磨法比切片培養(yǎng)法更容易分離到菰黑粉菌[9]。

內(nèi)生真菌在植物中廣泛存在，從每種植物中都能分離到不同種類的內(nèi)生真菌。孫璐等在毛序棘豆中分離到10 屬29 株內(nèi)生真菌，其中鏈格孢屬和鐮刀菌屬是優(yōu)勢菌屬[10]；魏艷妮等在遠(yuǎn)志中分離到19 屬36 種內(nèi)生真菌，不同生長年限、定殖部位的內(nèi)生真菌在種類和數(shù)量上也有差異，且鐮刀屬和鏈格孢屬也是遠(yuǎn)志內(nèi)生真菌中的優(yōu)勢屬[11]。陳頤輝等在化感水稻中分離到粘紅酵母和鐮刀菌[12]；裴冬麗等在銀杏根中分離到酵母和鏈格孢屬真菌[13]?？梢钥闯觯狙芯繌能字蟹蛛x到的這5種真菌是植物中常見的內(nèi)生真菌。

內(nèi)生真菌與植物之間的關(guān)系較為復(fù)雜，多種內(nèi)生真菌同時存在于植物內(nèi)部，起到一定的競爭作用或者互相協(xié)調(diào)作用。除了菰黑粉菌之外，其余內(nèi)生真菌在茭白孕茭中能否起到促進(jìn)作用或是抑制黑粉菌的生長等，還有待于進(jìn)一步研究。