液質(zhì)聯(lián)用法測定南美白對蝦中84種農(nóng)藥殘留

項愛麗，段曉然，馬瑞欣，張誼，湯思凝*，周鑫*

1. 唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心（唐山 063000）；2. 河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站（石家莊 050000）

水產(chǎn)品的質(zhì)量安全問題日益受到政府、消費者的關(guān)注[1]。水產(chǎn)品中的漁藥殘留、毒素類、重金屬等物質(zhì)超標，可能對人體健康產(chǎn)生不利影響，因此這些化學(xué)污染物受到廣泛監(jiān)測或控制[2-5]。近年來，動物源性食品中的農(nóng)藥、殺蟲劑等藥物殘留受到廣泛重視[6-8]，GB 2763—2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》增加動物源性食品農(nóng)藥殘留限量的食品種類和藥物種類。水產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留可能來源于混合養(yǎng)殖模式的推廣[6]、降雨降水、陸地徑流和大氣循環(huán)等途徑[9]。這些藥物通過大氣、水文和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)進入食物鏈，可能間接威脅人類健康[10]。然而，對動物源性食品中的農(nóng)藥殘留的研究并不甚多。

農(nóng)藥殘留的分析方法以氣相色譜-質(zhì)譜法（GCMS/MS）和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS）技術(shù)應(yīng)用最廣[11-12]。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS）具有抗干擾能力強、靈敏度高、檢測效率高等優(yōu)點[13]。SCRS固相萃取柱，是在QuEChERS方法基礎(chǔ)上開發(fā)出的對樣品提取液進行凈化的前處理耗材，能實現(xiàn)單步凈化[14]。

試驗建立固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，對南美白對蝦中的農(nóng)藥多殘留進行測定方法的開發(fā)，通過優(yōu)化樣品前處理的操作條件和儀器參數(shù)，實現(xiàn)快捷高效、準確可靠測定84種農(nóng)藥殘留的目的，為實驗室測定水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留提供方法支持，對評估農(nóng)藥殘留對水產(chǎn)品的風(fēng)險、持續(xù)監(jiān)測水產(chǎn)品中殘留物和進一步評估對人體健康危害提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

乙腈、甲醇（色譜純，Dikma公司）；甲酸（色譜純，Thermo Fisher公司）；二甲基亞砜（DMSO）、氯化鈉（國產(chǎn)優(yōu)級純）；試驗用水為超純水（電阻率18.25 MΩ·cm）。

SCRS固相萃取柱（天津賽恩博瑞科技有限公司）；微孔濾膜（0.22 μm），親水性聚四氟乙烯（WWPTFE）膜，PALL公司。

84種農(nóng)藥殘留標準品（天津阿爾塔公司）。

1.2 標準溶液配制

準確吸取適量農(nóng)藥標準品，用乙腈稀釋并定容，配制成1 μg/mL的農(nóng)藥混合標準溶液，在-18 ℃條件下保存。

1.3 儀器與設(shè)備

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源（ESI），Triple Quad 5500+，美國AB SCIEX公司）；離心機（Thermo Sorvall RC-6 Plus，美Thermo Fisher公司）；超聲清洗儀（KQ-800KDB型，昆山市超聲儀器有限公司）；多位渦旋儀（Multi Reax，德國Heidolph公司）。

1.4 前處理方法

稱取2 g（精確至0.001 g）勻漿蝦肉試樣于50 mL離心管中，加入10 mL 80%乙腈水溶液，渦旋混勻，振蕩提取5 min，超聲提取10 min。加入1.0 g氯化鈉，渦旋混合2 min，按4 000 r/min離心5 min，乙腈層經(jīng)SCRS萃取柱凈化后，取4 mL乙腈凈化液置于10 mL離心管并加入50 μL DMSO，于40 ℃氮氣吹掃，10%乙腈水溶液定容至1 mL，混勻過0.22 μm濾膜，待上機分析。

1.5 液相色譜條件

Kinetex F5液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm，phenonenex公司）；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流動相A為水（含0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸銨），流動相B為甲醇（含0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸銨）。洗脫方式為梯度洗脫，洗脫條件：0.0～1.0 min，97% A；1.0～1.5 min，97% A降至85% A；1.5～2.5 min，85% A降至50% A；2.5～10.0 min，50% A下降到30% A；10.0～13.0 min，30% A下降到2% A；13.0～17.0 min，保持2% A；17.0～17.1 min，2% A上升至97% A；17.1～20.0 min，保持97% A。

1.6 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧正電離模式（ESI+）。檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。氣簾氣（CUR）30 psi；霧化氣（GS1）45 psi；輔助氣（GS2）45 psi；碰撞氣（CAD）9；源溫500 ℃；噴霧電壓（IS）5 500 V；入口電壓（EP）10 V。目標化合物監(jiān)測離子對和碰撞能量（CE）、去簇電壓（DP）參數(shù)見表1。

表1 化合物的選擇離子及質(zhì)譜參數(shù)

接表1

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

根據(jù)84種農(nóng)藥的理化性質(zhì)及其相應(yīng)的母離子，通過儀器軟件優(yōu)化母、子離子信息，選擇信號強度大、穩(wěn)定性高的離子碎片作為定量離子和定性離子，并以此為基礎(chǔ)，對離子源參數(shù)和去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化，以多反應(yīng)監(jiān)測為檢測方式，使目標化合物的離子化達到最佳的水平。

液相色譜方法對目標化合物[15]的定性定量分析有很大的影響，體現(xiàn)在保留時間、基質(zhì)效應(yīng)、色譜峰型等方面[16]。在流動相的選擇上，有機相分別考察甲醇和乙腈，水相比較純水、甲酸水、甲酸銨水溶液、乙酸銨水溶液等對梯度洗脫和目標化合物色譜行為的影響。因質(zhì)譜端掃描應(yīng)用的是ESI+模式，在流動相中加入低濃度的甲酸，以提供H+，有利于在正掃描模式下目標化合物形成[M+H]+形式的母離子，增強離子化效果；流動相中加入甲酸銨，有利于各物質(zhì)間的色譜分離和改善色譜峰型。通過試驗對比，最終選取水和甲醇作為洗脫溶劑，兩者均加入0.01%甲酸和2 mmol/L甲酸銨，以保持在一定流速下甲酸和甲酸銨的比例穩(wěn)定不變。84種農(nóng)藥的MRM掃描色譜圖見圖1。

圖1 84種農(nóng)藥的MRM掃描色譜圖

2.2 前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取試劑

基于涉及的農(nóng)藥種類較多，其極性、溶解性等理化性質(zhì)不盡相同，且蝦肉的基質(zhì)成分比較復(fù)雜，考察乙腈、乙酸乙酯等常用的針對動物源性基質(zhì)的藥物殘留提取試劑[17]對目標化合物的提取效果，并對回收率進行分析，結(jié)果見圖2。使用80%乙腈作為提取試劑時，回收率在80%～120%的農(nóng)藥數(shù)量為65種，占總農(nóng)藥數(shù)量的77.4%；分別應(yīng)用甲醇和乙酸乙酯作為提取試劑，農(nóng)藥最終回收率小于80%的占比分別為91.7%和53.6%。比較常見的提取試劑中添加甲酸、乙酸，使提取條件呈酸性[18]，在80%乙腈中分別添加1%和5%的甲酸，有20種和19種農(nóng)藥落入回收率低于60%的區(qū)域。綜上，選用80%乙腈作為提取試劑，在處理過程中收取良好的蛋白沉淀效果，并得到目標化合物回收率的保證。

圖2 提取試劑對回收率的影響

2.2.2 氮吹條件

氮氣吹掃是藥物殘留定性定量分析中常用的濃縮方式[19]。氮氣吹掃的過程可能會影響最終的定量準確性。試驗考察凈化提取液直接氮氣吹掃至干、凈化提取液中加入DMSO吹掃、凈化提取液中加入DMSO吹掃至干3種情況，結(jié)果見圖3。在3種條件下，藥物回收率沒有明顯的區(qū)別，考慮到氮吹后復(fù)溶定容等操作便捷性，選取在凈化液中加入DMSO進行氮氣吹掃。

圖3 氮吹條件對回收率的影響

2.2.3 復(fù)溶液成分

樣品提取液經(jīng)濃縮后，復(fù)溶步驟采用的試劑種類不一[20-21]，不同的試劑對儀器響應(yīng)值和回收率有著影響[13]。試驗選擇10%乙腈、30%乙腈和10%乙腈（含1%甲酸）3種復(fù)溶液對氮吹殘留物進行處理，經(jīng)儀器分析，選擇30%乙腈作為試驗復(fù)溶試劑，結(jié)果見圖4。

圖4 復(fù)溶液對回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的考察

蝦肉中富含蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)等物質(zhì)致使樣品成分復(fù)雜。選用電噴霧離子源，因其特殊的結(jié)構(gòu)特點和電離機理，如果在樣品前處理過程中凈化效果不佳，會產(chǎn)生影響目標化合物響應(yīng)強度和定量分析的基質(zhì)抑制效應(yīng)[22-23]。在凈化過程中，使用SCRS固相萃取柱對提取液中的雜質(zhì)進行吸附，經(jīng)SCRS濾過的提取液，通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，得到84種農(nóng)藥殘留的基質(zhì)效應(yīng)數(shù)據(jù)，對農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)的強弱進行區(qū)域劃分[24]，見圖5?；|(zhì)效應(yīng)落入[80%，100%]區(qū)間的農(nóng)藥數(shù)量為50種，落入[100%，120%]區(qū)間的農(nóng)藥數(shù)量為31種，96.4%的農(nóng)藥經(jīng)試驗的前處理后經(jīng)質(zhì)譜分析，表現(xiàn)為弱基質(zhì)抑制效應(yīng)，表明前處理方法去除雜質(zhì)能力較強，凈化效果良好。雖然基質(zhì)效應(yīng)的影響不大，為尋求更精準的定量分析結(jié)果，仍選用空白基質(zhì)加標的方法對目標化合物進行定性定量分析。

圖5 84種農(nóng)藥基質(zhì)效應(yīng)區(qū)間分布

2.4 定量限、回收率和精密度

以南美白對蝦空白基質(zhì)提取溶液配制基質(zhì)標準曲線對樣品進行定量分析，并采用低濃度加標于空白基質(zhì)樣品，計算信噪比得到方法定量限（limits of quantification，rSN=10）[25]，84種農(nóng)藥的定量限為1～10 μg/kg。針對于方法準確性和穩(wěn)健性，考察方法的回收率和精密度。選取空白南美白對蝦樣品進行標準添加，低、中、高3個添加水平（設(shè)置含量水平為5，10和50 μg/kg），每個水平做6個平行樣，進行前處理和上機儀器分析。經(jīng)計算得出各種藥物在低、中、高3個添加水平的回收率分別為62.4%～127.1%，58.0%～121.6%和51.9%～132.2%，精密度分別為0.13%～ 11.04%，0.69%～8.42%和0.29%～8.11%。

2.5 實際樣品測定

抽取35批市售南美白對蝦樣品，依照建立的試驗方法，對84種農(nóng)藥殘留進行測定分析。分析結(jié)果顯示，抽取的南美白對蝦樣品中，有4批樣品檢出西草凈，含量范圍為8.16～14.61 μg/kg，未檢測到其他農(nóng)藥殘留。

3 結(jié)論

試驗建立快速測定南美白對蝦中的84種農(nóng)藥殘留的固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。試樣用80%乙腈提取，通過鹽析使乙腈與水相分層，利用SCRS快速固相萃取吸附雜質(zhì)進行凈化，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測，基質(zhì)標定量。試驗方法簡單快捷，準確穩(wěn)健，能夠?qū)δ厦腊讓ξr樣品中84種農(nóng)藥殘留進行定性定量分析，為檢測南美白對蝦以至其他水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留提供方便、可靠的實驗室方法。