植物乳桿菌高密度發(fā)酵

張國柱，宮俊峰，趙玉明，彭曉光，麻杰，王慕華*

1. 山西維爾生物乳制品有限公司（太原 030006）；

2. 山西省生物研究院有限公司醫(yī)藥生物技術(shù)山西省重點實驗室（太原 030006）

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）為乳桿菌科乳桿菌屬，同型發(fā)酵，最適生長溫度為30～35 ℃，最適pH在6.5左右，兼性厭氧，耐鹽、耐酸，是一種重要益生菌[1-2]，具有調(diào)節(jié)動物胃腸道菌群平衡、改善腸道內(nèi)環(huán)境、增強(qiáng)免疫力和抵抗力等多種功能[3-7]，在食品、飼料及醫(yī)療保健等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[8-10]。獲得植物乳桿菌高密度培養(yǎng)物對其商業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。不同發(fā)酵工藝對其生長有不同影響，通過培養(yǎng)基成分的優(yōu)化獲得高密度細(xì)胞是最為經(jīng)濟(jì)、有效的途徑[11]。為充分發(fā)揮菌種的生產(chǎn)能力實現(xiàn)高產(chǎn)，不僅需要擁有一個良好的發(fā)酵培養(yǎng)基，還需要對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化[12]。試驗探究培養(yǎng)基成分對植物乳桿菌生長的影響，確定優(yōu)化培養(yǎng)基配方。同時，對植物乳桿菌的培養(yǎng)方式、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基初始pH、接種量進(jìn)行研究，旨在獲得植物乳桿菌的最佳發(fā)酵條件，提高菌體生物量，為植物乳桿菌高密度發(fā)酵提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌SX68（山西省生物研究院有限公司分離、保藏[12]）。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉浸膏5 g/L、酵母浸膏4 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、硫酸錳0.05 g/L、吐溫80 1.0 mL/L，pH 6.5，用蒸餾水定容至1 000 mL，于121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉，于121 ℃滅菌15 min，用于活菌計數(shù)。

葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸三銨、吐溫80等（國產(chǎn)分析純）；麥芽糖、可溶性淀粉、酵母粉、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、胰蛋白胨等（生物試劑）。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-2CD超凈工作臺（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；FE28-standard pH計（瑞士梅特勒-托利多公司）；MTV-1漩渦振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；DK-8D電熱恒溫水浴槽（常州諾基儀器有限公司）；UV-1500分光光度計（上海美析儀器有限公司）；C-32厭氧培養(yǎng)盒（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社）。

1.3 方法

1.3.1 參數(shù)測定

菌體生物量測定：培養(yǎng)液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，以稀釋相同倍數(shù)同一批次滅菌而未接入菌種的MRS液體培養(yǎng)基為參照，經(jīng)UV-1500分光光度計測600 nm波長處的吸光度。

活菌計數(shù)：采用平板菌落計數(shù)法，厭氧培養(yǎng)統(tǒng)計植物乳桿菌活菌數(shù)。

pH測定：FE28-standard pH計測定。

1.3.2 植物乳桿菌生長曲線繪制

將活化好的植物乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下靜置培養(yǎng)，每間隔2 h取樣測定培養(yǎng)液pH和吸光度（A），繪制菌體生長曲線。

1.3.3 最佳碳源的確定

分別以20 g/L麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉替換MRS液體培養(yǎng)基中的碳源，2%接種量，在37 ℃下三角瓶靜置培養(yǎng)18 h，測定吸光度，確定最佳碳源；將最佳碳源分別以10，15，20，25和30 g/L的質(zhì)量濃度加入MRS液體培養(yǎng)基中，在2%接種量、37 ℃下三角瓶靜置培養(yǎng)18 h，測定活菌數(shù)，確定最佳添加量。

1.3.4 最佳氮源的確定

分別以20 g/L玉米漿干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、牛肉浸膏替換MRS液體培養(yǎng)基中的氮源，在2%接種量、37 ℃下三角瓶靜置培養(yǎng)18 h，測定吸光度，比較各氮源的影響。在此基礎(chǔ)上，玉米漿干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨中選最好的1種，酵母粉、酵母浸膏中選較好的1種，與牛肉浸膏組合形成最佳氮源復(fù)配方案，確定最佳組合中各氮源添加量。

1.3.5 緩沖鹽、生長因子對植物乳桿菌發(fā)酵的影響

分別將緩沖鹽2 g/L磷酸氫二鈉、2 g/L磷酸氫二鉀、5 g/L乙酸鈉、2 g/L檸檬酸三銨或生長因子0.2 g/L硫酸鎂、0.05 g/L硫酸錳單一加入MRS液體培養(yǎng)基中，在2%接種量、37 ℃下三角瓶靜置培養(yǎng)18 h，測定吸光度，確定影響比較大的緩沖鹽和生長因子。

1.3.6 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

采用四因素三水平L9(34)正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗，將影響菌體生物量的主要因素碳源、氮源、緩沖鹽和生長因子作為影響因素進(jìn)行正交試驗，以得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配比。

1.3.7 發(fā)酵條件優(yōu)化

采用四因素三水平L9(34)正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗，將影響菌體生物量的主要因素接種量、發(fā)酵溫度、起始pH、溶氧量作為影響因素進(jìn)行正交試驗，以得到最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌MRS液體培養(yǎng)的生長曲線

植物乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，每間隔2 h取樣測定發(fā)酵液pH和吸光度，繪制菌體生長曲線及pH變化情況曲線，如圖1所示。

從圖1中可知，植物乳桿菌在MRS液體培養(yǎng)基中，8 h進(jìn)入對數(shù)期，18 h達(dá)到穩(wěn)定期，pH由起始的6.5降到3.3。因此，可以確定植物乳桿菌的發(fā)酵時長達(dá)到18 h即可。

圖1 植物乳桿菌生長曲線及培養(yǎng)過程中的pH變化曲線

2.2 不同碳源對植物乳桿菌生長的影響

麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖、可溶性淀粉替換MRS液體培養(yǎng)基中的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)18 h后，測定吸光度，考察不同碳源對植物乳桿菌生長的影響，如圖2所示。確定最佳碳源后，設(shè)定不同添加量，考察不同濃度對植物乳桿菌生長的影響，如圖3所示。

圖2 不同碳源對植物乳桿菌生長的影響

圖3 不同蔗糖質(zhì)量濃度對植物乳桿菌生長的影響

從圖2中可知，麥芽糖、乳糖、蔗糖對植物乳桿菌生長的影響和葡萄糖差異不大，菌體生長量A600nm基本都在10左右，考慮到可將食品級蔗糖添加到培養(yǎng)基中，降低發(fā)酵成本，因此，選擇蔗糖作為最佳碳源。從圖3中可知，蔗糖添加量為25 g/L最適于植物乳桿菌的生長。

2.3 不同氮源對植物乳桿菌生長的影響

玉米漿干粉、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、牛肉浸膏替換MRS液體培養(yǎng)基中的氮源，發(fā)酵培養(yǎng)18 h后，測定吸光度，考察不同氮源對植物乳桿菌生長的影響，如圖4所示。

圖4 不同氮源對植物乳桿菌生長的影響

蛋白胨含有豐富的氨基酸，特別是含硫氨基酸較多，還含有細(xì)菌生長需要的維生素和其他生長因子，是各種培養(yǎng)基制備的基礎(chǔ)原材料，主要作用是提供氮源；酵母膏含有氨基酸類、肽類、水溶性維生素、酵母多糖、酵母核酸等，在培養(yǎng)基中可補(bǔ)充氮源和提供細(xì)菌生長的各種維生素及氨基酸；牛肉膏含有肌酸、肌酸酐、多肽類、氨基酸類、核苷酸類、有機(jī)酸類、礦物質(zhì)類及維生素類的水溶性物質(zhì)，在培養(yǎng)基中的主要作用是補(bǔ)充蛋白胨及其他氮源的營養(yǎng)不足。乳酸菌培養(yǎng)營養(yǎng)要求苛刻，因此考慮將3種氮源復(fù)配使用，以期達(dá)到較好的效果。從圖4中可知，胰蛋白胨的效果優(yōu)于其他2種蛋白胨，酵母膏和酵母粉效果差不多，選較便宜的酵母膏。按總添加量20 g/L計，胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏的比例分別設(shè)置1∶1∶1，2∶1∶1和3∶2∶1，比較不同氮源復(fù)配比例的影響，如圖5所示。由圖5可知，胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏按3∶2∶1的比例復(fù)配，最有益于植物乳桿菌的生長。

圖5 不同氮源復(fù)配比例對植物乳桿菌生長的影響

2.4 緩沖鹽、生長因子對植物乳桿菌生長的影響

在MRS液體培養(yǎng)基中分別只添加2 g/L磷酸氫二鈉、2 g/L磷酸氫二鉀、5 g/L乙酸鈉、2 g/L檸檬酸三銨中的一種和0.2 g/L硫酸鎂、0.05 g/L硫酸錳中的一種，考察不同緩沖鹽、生長因子對植物乳桿菌生長的影響，如圖6所示。

從圖6中可知，緩存鹽磷酸氫二鉀、微量生長因子硫酸錳對植物乳桿菌生長的影響較大。

圖6 不同緩沖鹽、生長因子對植物乳桿菌生長的影響

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以對植物乳桿菌生長影響較大的蔗糖、復(fù)配氮源（胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏3∶2∶1）、磷酸氫二鉀、硫酸錳作為不同的因素，設(shè)計正交試驗，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化，如表1所示。培養(yǎng)基中其他成分及添加量分別為乙酸鈉5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、吐溫80 1.0 mL/L。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基正交優(yōu)化

從表1可知，不同因素對菌株高密度培養(yǎng)影響大小依次為蔗糖＞氮源＞硫酸錳＞磷酸氫二鉀。最佳添加量為蔗糖25.0 g/L、氮源24.0 g/L、硫酸錳0.07 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L。氮源按胰蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏3∶2∶1分配為胰蛋白胨12 g/L、牛肉浸膏8 g/L、酵母膏4 g/L。最優(yōu)培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨12 g/L、牛肉膏8 g/L、酵母膏4 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸三胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸鎂 0.07 g/L、吐溫80 1 mL/L、pH 6.4。用此培養(yǎng)基10 L發(fā)酵罐發(fā)酵，最高A600nm可達(dá)14.38，平板活菌計數(shù)，活菌量可達(dá)1.64×1012CFU/mL。

2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化

在10 L發(fā)酵罐單因素試驗基礎(chǔ)上，以生物量（A600nm）為評價指標(biāo)，以接種量、發(fā)酵溫度、起始pH、溶氧量作為影響因素，正交試驗優(yōu)化發(fā)酵條件，如表2所示。

從表2可知，不同因素對菌株高密度培養(yǎng)影響大小依次為起始pH＞發(fā)酵溫度＞接種量＞溶氧。最佳發(fā)酵條件為起始pH 6.5，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量0 mL/L。確定最優(yōu)發(fā)酵條件為起始pH 6.5、發(fā)酵溫度35 ℃、接種量20 mL/L、溶氧量0 mL/L（控制低于100 mL/L），攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，罐壓0.03 MPa。在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件下，最高A600nm可達(dá)15.72，活菌數(shù)可達(dá)9.63×1012CFU/mL。

表2 發(fā)酵條件正交優(yōu)化

3 結(jié)論

通過植物乳桿菌生長曲線的繪制，可以確定其在MRS液體培養(yǎng)基中18 h進(jìn)入穩(wěn)定期，因此，在后續(xù)試驗中可將18 h確定為發(fā)酵的終點。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，確定植物乳桿菌的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨12 g/L、牛肉膏8 g/L、酵母膏4 g/L、磷酸氫二鉀2 g/L、檸檬酸三胺2 g/L、乙酸鈉5 g/L、硫酸鎂 0.58 g/L、硫酸鎂0.07 g/L、吐溫80 1 mL/L、pH 6.4。通過培養(yǎng)基配方優(yōu)化，菌體生長量從MRS液體培養(yǎng)基中的A600nm的10.53提高到14.38，蔗糖可以替代葡萄糖作為碳源，節(jié)約生產(chǎn)成本。通過發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終確定植物乳桿菌的最優(yōu)發(fā)酵條件：起始pH 6.5，發(fā)酵溫度35 ℃，接種量20 mL/L，溶氧量0 mL/L（控制低于100 mL/L），攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，罐壓0.03 MPa。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，植物乳桿菌最高A600nm值可達(dá)15.72，活菌數(shù)可達(dá)9.63×1012CFU/mL，植物乳桿菌的菌體生物量提高顯著。植物乳桿菌高密度發(fā)酵的研究為今后工業(yè)化生產(chǎn)植物乳桿菌奠定基礎(chǔ)，具有較好的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和發(fā)展前景。