酶法制備燕麥多肽的工藝條件優(yōu)化及分析

陳敏，何遠(yuǎn)清，馬超月，丁陽陽

江蘇大學(xué)（鎮(zhèn)江 212013）

燕麥（Avena sativaL.）是禾本科、燕麥屬1年生草本植物，是8種主要糧食作物之一[1]。燕麥在中國種植范圍廣（多集中在內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西等地）、產(chǎn)量高、價(jià)格低，且燕麥中蛋白質(zhì)含量豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4種蛋白組成，其中以球蛋白含量最高，在禾谷類糧食中居首位[2]。燕麥蛋白中富含人體必需的8種氨基酸，符合FAO/WHO提出的參考蛋白模式，其中賴氨酸含量是大米和小麥的2倍以上，經(jīng)常食用燕麥，可有效改善由我國不良膳食結(jié)構(gòu)引起的“賴氨酸缺乏癥”[3]。燕麥蛋白質(zhì)凈利用率高達(dá)65.7%，功效比達(dá)2.25，氨基酸分?jǐn)?shù)高達(dá)68.2，生物價(jià)達(dá)64.9%，顯著高于大多數(shù)其他植物蛋白，且燕麥蛋白的凈利用率和功效比與牛肉相當(dāng)，表明其在體內(nèi)有較高的吸收利用率[4]。燕麥主要利用方式是作為主食、加工成零食或兒童輔食，而對(duì)于其潛在的更高效的生物利用價(jià)值開發(fā)較少，因此迫切需要研究燕麥更高價(jià)值利用的方法，為燕麥的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

大量研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解可獲得比原蛋白更好生物活性的物質(zhì)，稱之為生物活性肽[5]。生物活性肽（bioactive peptides）是指長度在2～30個(gè)氨基酸之間，具有特定生物活性的肽類復(fù)合物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。生物活性肽可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生積極的健康效應(yīng)，如免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂等生物活性[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆、乳清、魚肉、雞蛋、菜籽等蛋白水解生物活性肽可通過清除自由基、減少脂肪過氧化氫含量和螯合金屬離子來發(fā)揮其抗氧化活性[8-10]。Takahashi等[11]研究表明，大米蛋白經(jīng)胰蛋白酶消化后可通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬和增加超氧陰離子的產(chǎn)生改善人體的免疫功能。任清等[12]以燕麥麩皮為原料，經(jīng)堿性蛋白酶（alcalase）酶解得到的多肽DPPH清除率可達(dá)57.39%。Ramak等[13]采用木瓜蛋白酶水解燕麥麩皮制備多肽，其產(chǎn)物在體外具有較好的抗氧化活性，其中ABTS自由基清除活性為866.9±10.6 μmol/L TE/g?？梢?，燕麥作為優(yōu)質(zhì)蛋白的來源，應(yīng)對(duì)其進(jìn)一步開發(fā)利用。因此，為獲得具有較高生物活性的燕麥多肽，試驗(yàn)通過單因素和響應(yīng)面方法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解燕麥蛋白的工藝條件，并通過測(cè)定DPPH清除率和羥自由基清除率以評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥粒（凌峰農(nóng)副產(chǎn)品有限公司）；堿性蛋白酶（南京誠納化工有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸等試劑（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

METTLER TOLEDO Five Easy Plus pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）；凱特GL10 MA大容量冷凍離心機(jī)（鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；BioTek Eon TM微孔板分光光度計(jì)（美國Biotek Instruments）；Free Zone 12plus真空冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）。

1.3 方法

1.3.1 燕麥蛋白的提取

提取工藝參照李桂娟等[14]的方法并有所改動(dòng)。

具體工藝：燕麥按料液比1∶9（g/mL）加水溶解→用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH 10.0→置于50 ℃水浴鍋中浸提120 min→4 500 r/min離心15 min→分離得上清液→用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液pH 4.0→4 500 r/min離心15 min→得到蛋白質(zhì)沉淀→真空冷凍干燥得燕麥蛋白質(zhì)干粉。

1.3.2 單因素優(yōu)化試驗(yàn)

堿性蛋白酶水解燕麥蛋白工藝流程如圖1所示，每個(gè)因素研究范圍見表1。

圖1 堿性蛋白酶水解燕麥蛋白工藝流程

表1 每個(gè)單因素研究范圍

1.3.3 響應(yīng)面工藝優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，研究各參數(shù)對(duì)研究指標(biāo)的影響，得出最佳酶解條件（表2）[15]。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.3.4 酶解指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 水解度（DH）的測(cè)定

水解度的計(jì)算根據(jù)Adler-Nissen[16]建立的pH-stat法，其計(jì)算公式見式（1）。

式中：V為NaOH溶液體積，mL；Np為NaOH溶液濃度，mol/L；Mp為酶解底物中凈蛋白的質(zhì)量，g；α為α-NH2在蛋白底物中的平均解離度，Alcalase對(duì)蛋白平均解離度為0.885；htot為單位質(zhì)量蛋白中肽鍵的總量，mmol/g，對(duì)于某一特定蛋白質(zhì)htot為固定值，經(jīng)查閱文獻(xiàn)得到燕麥蛋白htot=7.31 mmol/g[17]。

1.3.4.2 多肽得率的測(cè)定

將燕麥蛋白水解液稀釋數(shù)倍后，等比例（1∶1）添加15%的三氯乙酸（15 g三氯乙酸+85 mL水），置于30 ℃時(shí)水浴反應(yīng)30 min，按5 000 r/min離心10 min后去沉淀以除去大分子蛋白，收集上清液。按照福林酚法測(cè)水解液中的多肽濃度，多肽得率按式（2）計(jì)算[18]。

1.3.4.3 燕麥多肽DPPH清除率的測(cè)定

用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，在棕色瓶中低溫保存?zhèn)溆?，按照?進(jìn)行試驗(yàn)[19]。

表3 燕麥多肽DPPH清除率的測(cè)定步驟 單位：mL

按式（3）計(jì)算樣品DPPH清除率。

1.3.4.4 燕麥多肽羥自由基清除率的測(cè)定

試驗(yàn)步驟參照原洪[20]的方法并有所改動(dòng)。如表4所示，設(shè)3組平行試驗(yàn)。

表4 燕麥多肽羥自由基清除率的測(cè)定步驟 單位：mL

按式（4）計(jì)算羥自由基清除率。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin pro 8和Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖。使用SPSS 17.0通過單因素方差分析（ANOVA）和Duncan方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)結(jié)果的分析。使用Design Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 加酶量對(duì)酶解效果的影響

如圖2所示，在0～2.4 mL/L的酶濃度范圍內(nèi)，燕麥蛋白水解度隨酶濃度增大而逐漸升高，從7.20%增加到9.14%。此外，在0～1.6 mL/L的酶濃度范圍內(nèi)，多肽得率呈上升趨勢(shì)，在添加量1.6 mL/L時(shí)達(dá)到最高17.49%，之后呈緩慢下降趨勢(shì)。這主要由于當(dāng)溶液中酶的濃度較低時(shí)，加酶量增加，酶與底物最大限度結(jié)合，促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行。但當(dāng)溶液中酶的濃度達(dá)到飽和后，底物的水解度不斷增大，溶液中肽鍵減少，從而導(dǎo)致多肽得率下降，這與劉媛等[21]在優(yōu)化杏仁粕蛋白酶解過程中的結(jié)果一致。因此，試驗(yàn)選擇1.6 mL/L作為最適加酶量。

圖2 加酶量對(duì)酶解效果的影響

2.1.2 溫度對(duì)酶解效果的影響

研究表明，溫度對(duì)酶的活性能夠產(chǎn)生較大的影響。當(dāng)試驗(yàn)溫度低于其發(fā)揮作用的溫度時(shí)，酶的活性會(huì)受到一定抑制。溫度高于其發(fā)揮作用的溫度時(shí)，酶分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，酶分子會(huì)變性或解聚，從而使酶的催化作用降低[22]。如圖3所示，在40～60 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的增加，水解度呈先升高后下降趨勢(shì)，在50 ℃時(shí)達(dá)到最高7.78%。此外，隨著溫度逐漸升高，多肽得率總體呈增加趨勢(shì)，在55 ℃后增速減慢。由此可見，溫度對(duì)燕麥蛋白的酶解效果影響較大。綜合兩項(xiàng)指標(biāo)，試驗(yàn)選擇55 ℃作為燕麥蛋白堿性蛋白酶水解的最適酶解溫度。

圖3 溫度對(duì)酶解效果的影響

2.1.3 pH對(duì)酶解效果的影響

研究表明，pH能夠影響酶活性基團(tuán)的分子構(gòu)象，以及與底物的結(jié)合或解離狀態(tài)，從而影響酶解效果[23]。如圖4所示，在pH 8.0～10范圍內(nèi)，水解度和多肽得率變化趨勢(shì)基本一致，均隨pH的不斷升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，在pH 9.5時(shí)，水解度和多肽得率均達(dá)到最高值，分別為8.37%和13.49%。表明水解度和多肽得率受pH的影響較為一致，可見，最適pH為9.5。

圖4 pH對(duì)酶解效果的影響

2.1.4 底物濃度對(duì)酶解效果的影響

底物在一定濃度范圍內(nèi)影響著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，當(dāng)?shù)孜餄舛鹊陀诿笣舛葧r(shí)，酶與底物充分結(jié)合，促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行。而底物濃度過高時(shí)，溶液黏稠度過大，抑制酶的擴(kuò)散與結(jié)合，導(dǎo)致酶解速率降低。如圖5所示，底物濃度在2%～10%范圍內(nèi)，水解度和多肽得率均隨底物濃度的升高呈先升高后降低趨勢(shì)，不同的是水解度在8%時(shí)達(dá)到最高值12.78%，而多肽得率在6%時(shí)達(dá)到最高值20.63%，之后開始緩慢下降。綜合2項(xiàng)指標(biāo)，選擇8%為最佳酶解底物濃度。

圖5 底物濃度對(duì)酶解效果的影響

2.1.5 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

如圖6所示，0～90 min內(nèi)，水解度的增加速率較大，90 min時(shí)達(dá)到11.03%，之后增速減慢。另外，在此時(shí)間段內(nèi)，多肽得率隨酶解時(shí)間的增加呈先增加后下降趨勢(shì)，在120 min時(shí)達(dá)到最大值20.27%。這可能是由于：在酶解初始階段，可斷裂的肽鍵多，且酶活較高，使得酶解速度快；隨著酶解時(shí)間不斷延長，溶液中可斷裂的肽鍵減少，酶的活性有所下降，且反應(yīng)體系中短鏈肽可能重新聚合生成新的物質(zhì)，與原本的底物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，酶與新物質(zhì)結(jié)合反應(yīng)從而導(dǎo)致酶解速度緩慢[24]。因此，試驗(yàn)選擇120 min為最佳酶解時(shí)間。

圖6 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面模型建立

在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上，按照表2進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果見表5。對(duì)其進(jìn)行多元回歸擬合，獲得二次多元回歸方程：Y1=1 226.725 8+13.416 2X1+0.055 837X2+ 202.046 07X3+8.017 60X4+2.958 33×10-3X1X2-1.22X1X3+0.015 5X1X4-0.011 833X2X3-4.233 33× 10-3X2X4-0.022X3X4-0.191 94X12-8.683 33×10-3X22-10.181X32-0.070 660X42。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

回歸分析結(jié)果如表6所示，模型極顯著（P＜ 0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.066 2＞0.05），表明方程與預(yù)測(cè)值之間有較好的擬合度。模型總決定系數(shù)0.975 8，表明該模型能解釋97.58%的響應(yīng)值變化。另外，結(jié)果顯示X2、X3、X4對(duì)燕麥蛋白的水解度具有極顯著的影響，X1X3、X2X4存在顯著的交互作用，其余不顯著。根據(jù)F值和P值，各因素對(duì)燕麥蛋白水解度的影響程度為X3（pH）＞X4（溫度）＞X2（時(shí)間）＞X1（底物濃度）。此外，通過運(yùn)用軟件得到的水解度響應(yīng)曲面圖和等高線圖（圖7～圖12）可以更清晰地反映各響應(yīng)值對(duì)結(jié)果的影響。

表6 回歸模型方差分析（感官評(píng)分）

圖7 底物濃度和時(shí)間對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面與等高線圖

圖8 底物濃度和pH對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面與等高線圖

圖9 底物濃度和溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面與等高線圖

圖10 時(shí)間和pH對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面與等高線圖

圖11 時(shí)間和溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面與等高線圖

圖12 pH和溫度對(duì)水解度影響的響應(yīng)曲面與等高線圖

2.2.3 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

通過軟件Design-Expert求解方程，得到優(yōu)化alcalase 2.4 L FG水解燕麥蛋白的條件：底物濃度10%，水解時(shí)間149.41 min，pH 9.18，水解溫度51.92 ℃。在此條件下，燕麥蛋白的理論水解度為15.75%。為驗(yàn)證該條件的準(zhǔn)確性，在此條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，燕麥蛋白的平均水解度為14.86%，與理論計(jì)算值誤差僅為0.89%。

2.3 燕麥多肽體外抗氧化指標(biāo)的測(cè)定及分析

2.3.1 DPPH清除率

1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（1, 1-diphenyl-2- picrylhydrazyl radical，DPPH）是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，DPPH的單電子可被自由基清除劑捕捉而顏色變淺，導(dǎo)致其在510 nm處的吸光度下降，通常被用來評(píng)價(jià)樣品的自由基清除能力和抗氧化能力[25]。由圖13可知，在3.125～50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，燕麥多肽的DPPH自由基清除率隨濃度升高呈上升趨勢(shì)。經(jīng)計(jì)算，燕麥多肽清除DPPH的IC50值為9.112 mg/mL，在50 mg/mL時(shí)，DPPH清除率可達(dá)90.8%。馬洪鑫[26]優(yōu)化得到的藜麥蛋白抗氧化肽DPPH自由基清除率為74.82%±0.04%。同政泉等[27]制備的猴頭菇多肽DPPH的清除率為51.17%，表明經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化工藝制得的燕麥多肽具有較好的DPPH清除能力。

圖13 不同濃度燕麥多肽DPPH清除率

2.3.2 羥自由基清除率

羥自由基是體內(nèi)最活潑的活性氧，其可破壞蛋白質(zhì)、DNA、脂肪等生物大分子的結(jié)構(gòu)，引起衰老、癌癥和其他相關(guān)疾病，因此清除羥自由基是預(yù)防各種疾病發(fā)生的最有效的防御機(jī)制之一[28]。由圖14可知，在3.125～50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，燕麥多肽的羥自由基清除率隨濃度升高呈先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)，在12.5 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率接近100%。經(jīng)計(jì)算，燕麥多肽清除羥自由基的IC50值為3.062 mg/mL。楊珊珊等[29]制備的蛋清多肽濃度為5 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率為68.5%。張浩玉等[30]制備的綠豆多肽羥自由基消除能力在25 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值61.3%，表明按此工藝制得的燕麥多肽具有較好的羥自由基清除能力。

圖14 不同濃度燕麥多肽羥自由基清除率

3 結(jié)論

試驗(yàn)以燕麥蛋白為酶解底物，采用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到堿性蛋白酶的最佳酶解條件：堿性蛋白酶alcalase 2.4 L FG使用量1.6 mL/L，底物濃度10%，酶解時(shí)間150 min，溫度保持在52 ℃，pH調(diào)整并保持在9.2。此條件下燕麥蛋白的水解度達(dá)到14.86%，多肽得率為19.02%。

所得燕麥多肽DPPH清除率達(dá)90.8%，羥自由基清除率達(dá)99.2%，表明由此工藝制得的燕麥多肽具有較高的體外抗氧化活性，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。但試驗(yàn)未對(duì)燕麥多肽進(jìn)行進(jìn)一步分離純化和進(jìn)行體內(nèi)的抗氧化效果驗(yàn)證，在后續(xù)試驗(yàn)中可將已知有活性的燕麥多肽片段做進(jìn)一步的分離純化，并通過動(dòng)物試驗(yàn)找到抗氧化活性最高的肽段，將具有更高的應(yīng)用價(jià)值。