響應(yīng)面優(yōu)化黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片配方

馬子龍，李海龍，米帥，杜彬，李軍，朱鳳妹*

1. 河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院（昌黎 066600）；

2. 河北科技師范學(xué)院河北省天然產(chǎn)物活性成分與功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（秦皇島 066000）

黑果腺肋花楸是一種薔薇科植物，喜潮濕，來(lái)源于北美[1-2]。其提取物具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎和降血脂等功效[3-4]。

黑果腺肋花楸果實(shí)酸澀，難以直接食用，這使其發(fā)展受到限制，但在歐美等國(guó)家，其中富含的花色苷物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和功能性食品行業(yè)[5]?；ㄉ站哂辛己玫目寡趸钚?，可以清除人體內(nèi)多余的氧化自由基，研究發(fā)現(xiàn)花色苷可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧（ROS）的升高，同時(shí)抑制抗氧化活性酶的降低[6-7]。

當(dāng)前攝入花青素的方式仍為食補(bǔ)，關(guān)于其制劑的研究非常少。在此背景下以黑果腺肋花楸果粉為主要原料，通過(guò)在制備工藝中添加花色苷純品提高花色苷含量，采用響應(yīng)面優(yōu)化法探究咀嚼片制備的最佳工藝，并對(duì)其咀嚼性、硬度等進(jìn)行測(cè)定，為咀嚼片的制備提供較為直觀可靠的參考依據(jù)。此外，對(duì)其抗氧化性進(jìn)行了研究，此制備工藝可增加花楸產(chǎn)品的創(chuàng)新性和多樣性，為花楸產(chǎn)業(yè)的發(fā)展開闊思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黑果腺肋花楸凍果（種植于遼寧省海城市，2019年9月上旬采收）；β-環(huán)糊精、淀粉、甘露醇、檸檬酸（食品級(jí)，浙江一諾生物科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2, 2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS，純度98%，上海源葉生物科技有限公司）；維生素C咀嚼片（含20% VC，浙江康恩貝科技有限公司）；HP-20大孔吸附樹脂（上海昕滬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 主要儀器與設(shè)備

質(zhì)構(gòu)儀（Brookfielb CT3，上海茂默科學(xué)技術(shù)有限公司）；EYELA真空冷凍干燥機(jī)（FDU-1200，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DB，昆山市超聲儀器有限公司）；可見分光光度計(jì)（V-5100，武漢高精密科學(xué)儀器有限公司）；多沖壓片機(jī)（MYP-9，廣州市揚(yáng)鷹醫(yī)療器械有限公司）；超微粉碎機(jī)（RS-FS1401，合肥榮事達(dá)小家電有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N1100，上海愛(ài)朗儀器有限公司）；pH示差計(jì)（FE28-Standard，梅特勒托利多科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 黑果腺肋花楸果粉的制備

將黑果腺肋花楸凍果洗凈，去除壞果與果梗，于-20 ℃冷凍過(guò)夜，于真空冷凍干燥機(jī)凍干，超微粉碎機(jī)制粉，過(guò)0.150 mm（100目）孔徑篩，備用。

1.3.2 黑果腺肋花楸花色苷的制備

參考文獻(xiàn)[8-10]的方法制備花色苷。取適量花楸，提取溶劑為40%乙醇（含0.5%檸檬酸），按照料液比1∶10（g/mL）、提取溫度43 ℃，超聲功率200 W輔助提取23 min。抽濾后，于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。利用HP-20大孔吸附樹脂進(jìn)行純化，凍干后，得純化后花色苷樣品，備用。

1.3.3 黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片制備工藝

參考劉魁等[11]的制備方法。黑果腺肋花楸凍干后，超微粉碎，過(guò)0.150 mm（100目）孔徑篩。按比例稱取果粉與各種原料，混合均勻后制片，制片過(guò)程中根據(jù)情況補(bǔ)加潤(rùn)濕劑。

1.3.4 花色苷含量的測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定黑果腺肋花楸花色苷含量[12]，用分光光度計(jì)測(cè)定A510nm和A700nm，花色苷含量（g/100 g）計(jì)算見式（1）。

式中：ΔA=（A510nm-A700nm）pH 1.0-（A510nm-A700nm）pH 4.5；V為樣品體積，mL；F為稀釋倍數(shù)；Eav為平均消光系數(shù)，98.20；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 性能判定

參考李剛鳳等[13]壓片工藝評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，以外觀、口感質(zhì)地、相對(duì)片劑標(biāo)準(zhǔn)偏差、風(fēng)味為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.6 單因素試驗(yàn)

配方固定花色苷含量20%、微粉硅膠0.5%、乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，以果粉、甘露醇、β-環(huán)糊精和檸檬酸的添加量為考察因素，通過(guò)調(diào)整各因素比例，以淀粉填充至100%，探究不同因素對(duì)咀嚼片感官評(píng)分的影響。固定果粉30%、甘露醇10%、β-環(huán)糊精10%、檸檬酸2%，分別考察果粉（2 0%，2 5%，3 0%，35%和40%）、β-環(huán)糊精（5%，10%，15%，20%和25%）、甘露醇（5%，10%，15%，20%和25%）和檸檬酸（1%，2%，3%，4%和5%）對(duì)感官評(píng)分的影響。

1.3.7 響應(yīng)面優(yōu)化

采用SPSS軟件對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，選出3個(gè)對(duì)壓片評(píng)分影響顯著的因素——花楸果粉添加量（X1）、β-環(huán)糊精添加量（X2）和甘露醇添加量（X3）。每個(gè)變量分別以-1，0和1進(jìn)行編碼，因素和水平見表2。采用Design-Expert對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì) 單位：%

1.3.8 質(zhì)構(gòu)性質(zhì)測(cè)定

采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)咀嚼片的性能進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試條件：樣品高度7 mm，檢測(cè)速度60 mm/min，起始力0.1 N，形變量25%，間隔時(shí)間1 s。同時(shí)以市面上的VC咀嚼片為對(duì)照。

1.3.9 抗氧化活性研究

分別取1片VC片和1片花色苷壓片，碾碎，待測(cè)。將粉末用無(wú)水乙醇配制成10，20，30，40和50 μg/mL，實(shí)際VC與花色苷質(zhì)量濃度約為2，4，6，8和10 μg/mL，同時(shí)配制相同質(zhì)量濃度的花色苷溶液。采用朱璐等[14]的方法測(cè)定DPPH自由基清除率；采用黃彪等[15]的方法測(cè)定ABTS自由基清除率；重復(fù)3次取平均值，按式（2）計(jì)算清除率。

式中：A0為空白液代替樣液的吸光度；A1為樣液與自由基溶液的吸光度；A2為空白液代替自由基溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS 21對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，采用Design Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷提取與純化

前期研究中根據(jù)HPLC-MS分析得到，黑果腺肋花楸花色苷主要含有3種單體，分別為矢車菊素半乳糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷和矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，每種單體在花色苷樣品中所占比例分別為47.31%，20.04%和10.80%，共占花色苷樣品的78.15%，表明黑果腺肋花楸花色苷經(jīng)純化后的純度很高。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 果粉

黑果腺肋花楸中含有單寧等物質(zhì)，果實(shí)酸澀，因此果粉添加量對(duì)片劑的感官品質(zhì)具有十分重要的影響，過(guò)多的果粉會(huì)使片劑酸澀難食，而果粉過(guò)少會(huì)減弱黑果腺肋花楸特有的果香。由圖1可以看出，果粉添加量在35%左右出現(xiàn)峰值，在保證口感的同時(shí)，還能夠體現(xiàn)花楸果實(shí)特有果香，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示該因素對(duì)感官評(píng)分具有顯著影響（P＜0.05）。

圖1 果粉對(duì)感官評(píng)分的影響

2.2.2β-環(huán)糊精

花色苷穩(wěn)定性差，而β-環(huán)糊精是一種很好的藥物包合材料，可以提高藥物的穩(wěn)定性，還可以改善藥物的溶解度、溶出速率和生物利用度[16]。由圖2看出，隨著β-環(huán)糊精添加量的增加，感官評(píng)分逐漸升高，并在10%時(shí)出現(xiàn)峰值，隨著添加量繼續(xù)增加，片劑過(guò)硬，且過(guò)量白色的β-環(huán)糊精與深紫色的果粉混合后，顏色發(fā)灰，色澤暗淡?？梢姦?環(huán)糊精添加量對(duì)片劑也有重要影響，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示該因素對(duì)評(píng)分影響顯著（P＜0.05）。

圖2 β-環(huán)糊精對(duì)感官評(píng)分的影響

2.2.3 甘露醇

甘露醇溶解時(shí)吸熱，有甜味，對(duì)口腔有舒服感，十分適用口中清涼劑等咀嚼片的制造[17]。由圖3可知，甘露醇添加量的增加，可以提高片劑的評(píng)分，10%時(shí)達(dá)到峰值，隨著添加量繼續(xù)增加，甘露醇的甜味掩蓋果粉的香味，不具特色。可見甘露醇添加量也是一個(gè)重要的影響因素。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示該因素具有顯著影響（P＜0.05）。

圖3 甘露醇對(duì)感官評(píng)分的影響

2.2.4 檸檬酸

檸檬酸具有溫和爽快的酸味，非常適合掩蓋黑果腺肋花楸果粉的澀味[18]。由圖4可以看出，檸檬酸的添加確實(shí)提高了壓片的風(fēng)味評(píng)分，受到一致好評(píng)，但因個(gè)人對(duì)酸度的耐受性差異，使得該因素對(duì)感官評(píng)分并無(wú)顯著影響（P＞0.05），添加量3%左右的酸度較為適宜，因此后續(xù)試驗(yàn)采用3%檸檬酸添加量。

圖4 檸檬酸對(duì)感官評(píng)分的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以果粉添加量（A）、β-環(huán)糊精添加量（B）、甘露醇添加量（C）為自變量，感官評(píng)分（Y）為因變量做響應(yīng)面試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，果粉添加量（A）、β-環(huán)糊精添加量（B）和甘露醇添加量（C）與感官評(píng)分（Y）的二次多項(xiàng)回歸模型編碼方程為Y=96.76-6.26A+10.09B+3.08C-3.97AB+3.50AC-3.60BC-14.09A2-17.64B2-5.32C2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表

從表4可以看出，各因素一次項(xiàng)和交互項(xiàng)均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。這表明，試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)與交互項(xiàng)都對(duì)響應(yīng)值有很大影響。

表4 獨(dú)立變量響應(yīng)面模型方差分析

判定系數(shù)R2=0.984 6，R2越接近1，表明該模型擬合程度越好，也越能預(yù)測(cè)其響應(yīng)值。同時(shí)，失擬項(xiàng)為0.173 6＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明方程擬合充分，回歸方程極顯著（P＜0.01）。因此，可用上述回歸方程描述各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，對(duì)不同條件下片劑的感官評(píng)分進(jìn)行預(yù)測(cè)。

根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果見圖5～圖7。三維圖坡度較大，說(shuō)明響應(yīng)值對(duì)這些交互因素的改變?cè)矫舾?。圖5～圖7的等高線圖呈橢圓形表明其交互作用顯著，這與表4分析結(jié)果一致。

圖5 果粉添加量與環(huán)糊精添加量對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖6 環(huán)糊精添加量與甘露醇添加量對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖7 果粉添加量與甘露醇添加量對(duì)感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件得到黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片的最佳制備條件：果粉添加量33.74%、β-環(huán)糊精添加量11.49%、甘露醇添加量15.52%。在此工藝下黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片的感官評(píng)分理論值為99.24分。根據(jù)實(shí)際操作的可行性，調(diào)整為果粉添加量34%、β-環(huán)糊精添加量11%、甘露醇添加量16%。按照此條件制備咀嚼片，3次平行試驗(yàn)取平均值，感官評(píng)分為97.33分，與理論值接近，這就說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化的結(jié)果具有可信度。

2.4 花色苷含量測(cè)定

采用pH示差法測(cè)定每片中花色苷含量，結(jié)果為44.04±7.57 mg。花色苷推薦攝入量為50 mg/d。成人花色苷抗氧化保健功能有效成分的日服用劑量為140～ 160 mg[19]。因此每日服用1片，可保證每日花青素?cái)z入量，滿足人體的基本需求。每日服用3～4片，可以起到抗氧化功效，可以對(duì)疾病起到預(yù)防和改善的功效。

2.5 質(zhì)構(gòu)性質(zhì)測(cè)定

硬度是最直接反映口感的一項(xiàng)指標(biāo)，在質(zhì)地剖面分析中，直接影響咀嚼性。由表5可以看出，花色苷咀嚼片硬度1與VC咀嚼片無(wú)顯著差異，硬度較為適中，但第二次下壓花色苷咀嚼片硬度明顯下降，二者差異顯著，進(jìn)一步結(jié)合二者的彈性相比較，從表5可以看出花色苷咀嚼片的彈性顯著高于VC咀嚼片，花色苷咀嚼片偏韌性強(qiáng)，VC咀嚼片偏脆硬，且二者的咀嚼性無(wú)顯著差異，黏性較小，不易粘牙，通過(guò)咀嚼性、硬度等指標(biāo)數(shù)據(jù)化，對(duì)于片劑的性質(zhì)判定更加直觀。

表5 性能測(cè)試表（x±S，n=10）

2.6 抗氧化性測(cè)定

2.6.1 DPPH自由基清除率

DPPH是一種比較穩(wěn)定的脂性自由基，呈紫色，加入抗氧化劑以后，紫色褪去，其褪色程度與其接受的電子數(shù)呈定量關(guān)系[20]。由圖8可以看出，質(zhì)量濃度小于6 μg/mL時(shí)，VC咀嚼片的清除率高于花色苷咀嚼片和花色苷，大于6 μg/mL時(shí)，花色苷清除率較高，在10 μg/mL時(shí)，花色苷咀嚼片的抗氧化性顯著高于VC咀嚼片，表明花色苷咀嚼片具有較好的抗氧化性。

圖8 不同質(zhì)量濃度下三種抗氧化劑對(duì)DPPH自由基清除率的影響

2.6.2 ABTS自由基清除率

ABTS法是一種被廣泛用于檢測(cè)物質(zhì)體外抗氧化能力的方法[21]。由圖9可以看出，VC清除ABTS自由基的能力較差，花色苷與花色苷咀嚼片的清除ABTS自由基的能力顯著高于VC咀嚼片（P＜0.05），花色苷咀嚼片與花色苷的清除ABTS自由基的能力相比，隨著質(zhì)量濃度增大，二者無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明輔料的添加和制劑過(guò)程并不影響花色苷的抗氧化性。

圖9 在不同質(zhì)量濃度下三種抗氧化劑ABTS自由基清除率的對(duì)比

3 結(jié)論

以黑果腺肋花楸果粉為主料，制備黑果腺肋花楸花色苷咀嚼片，其最佳配方為果粉34%、β-環(huán)糊精11%、甘露醇16%、檸檬酸3%、花色苷20%，在此工藝條件下咀嚼片具有較好的口感。并通過(guò)質(zhì)構(gòu)儀對(duì)最佳工藝下的咀嚼片進(jìn)行測(cè)定，與市面上的VC咀嚼片作為對(duì)照，結(jié)果顯示其具有較為適宜的硬度和咀嚼性。此外，對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究，其抗氧化性優(yōu)于同樣高濃度的VC咀嚼片，略低于花色苷，表明其具有較好的抗氧化性能。