芋艿蛋白提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化及其抗氧化性研究

楊明朗，吳姝潔，董祺祺，趙燕昊，蔣玉蓉*，陸國權(quán)

1. 浙江農(nóng)林大學現(xiàn)代農(nóng)學院（杭州 311300）；2. 桐廬縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心（杭州 311599）

芋艿[Colocasiaesculenta（L.）Schott]，又稱芋頭、毛芋、芋魁等，屬天南星科多年生宿根性草本植物[1]，原產(chǎn)于印度、馬來群島及中國，現(xiàn)在熱帶及亞熱帶地區(qū)廣泛分布。芋艿富含淀粉、蛋白質(zhì)以及生物活性大分子，具有美容養(yǎng)顏、潤腸滋脾、消癆解毒等作用[2]。芋艿蛋白具有易吸收、降血壓等優(yōu)點，其組分中有一種黏液蛋白，被人體吸收后能產(chǎn)生免疫球蛋白[3]。研究者對國內(nèi)30余種芋艿品種的蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，芋艿的蛋白質(zhì)含量平均為9.30%，含有18種氨基酸，包括8種人體必需氨基酸，且氨基酸含量與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，氨基酸評分（amino acid ascore，ASS）為0.79[4]。國內(nèi)外對芋艿的研究多集中于種植栽培、淀粉及多糖的粗加工，對芋艿蛋白分離提取及性質(zhì)方面的研究甚少。國外對芋艿蛋白質(zhì)的研究開始于1982年，Huang等[5]和Kaushal等[6]測定了芋艿蛋白質(zhì)含量，結(jié)果分別為1.1%～2.5%。常銀子等[7]采用正交試驗優(yōu)化酶法提取芋艿蛋白質(zhì)工藝，其得率為0.52%。黃友如等[8]通過優(yōu)化堿溶酸沉法制備芋艿分離蛋白，其得率約1.33%。上述兩種提取方法得率均較低。奉化芋艿是浙江省主要芋艿品種之一，個大皮薄，糯滑可口，粗蛋白含量可達14.10%，富含鈣、磷、鎂、鐵及VC等多種成分，營養(yǎng)價值豐富，因其獨特品質(zhì)受到消費者的青睞[9]。此次研究以奉化芋艿為材料，采用響應(yīng)面法對芋艿蛋白的木瓜蛋白酶法提取工藝進行優(yōu)化，并對芋艿蛋白質(zhì)的體外抗氧化活性進行評價；同時比較8個芋艿推廣品種間蛋白含量差異，為芋艿蛋白的開發(fā)和高蛋白芋艿品種篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮奉化芋艿（購于寧波奉化）；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、抗壞血酸（合肥千盛生物科技有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸、無水乙醇（分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司）；木瓜蛋白酶（酶活力10萬 U/g，南寧龐博生物工程有限公司）；DPPH粉末（1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼，福州飛凈生物有限公司）。

Biosafer-10C臺式冷凍干燥機（南京賽飛生物科技有限公司）；HH-6恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司）；紫外可見分光光度計（北京普斯通用儀器有限責任公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理

取新鮮無損的成熟奉化芋艿，削皮并將表面洗凈，切片后放入冷凍干燥機凍干72 h，轉(zhuǎn)入恒溫鼓風干燥箱烘干3～5 h，磨成粉末，過0.150 mm（100目）孔徑篩，得到芋艿干粉，用密封袋保存于4 ℃恒溫冰箱。

1.2.2 蛋白標準曲線的繪制

蛋白標準曲線的繪制參考劉玉明等[10]的方法。稱取100 mg牛血清蛋白，將其充分溶解于蒸餾水并定容至100 mL，配制成1 mg/mL牛血清蛋白標準溶液。稱取0.1 g考馬斯亮藍G-250粉末，溶于50 mL 95%乙醇溶液，并加入100 mL 85%磷酸，加水稀釋至1 L，配制成考馬斯亮藍溶液，用棕色瓶保存。用移液槍分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL標準蛋白溶液于試管，并加蒸餾水定容至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，混勻并靜置5 min，在波長595 nm處測定吸光度A，以蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標（X），以吸光度A為縱坐標（Y）繪制標準曲線：Y=0.137 3X+0.000 5，R2=0.997 2。

1.2.3 芋艿蛋白質(zhì)提取酶法提取

稱取1 g芋艿干粉，按照1∶20 g/mL的料液比加入蒸餾水溶于離心管，用0.1 mol/L的NaOH和HCl溶液將溶液的pH調(diào)到4～8，加入一定量木瓜蛋白酶（0.25%～ 2.5%），于恒溫水浴鍋（30～70 ℃）加熱（0.5～2.5 h）。待反應(yīng)結(jié)束后，將離心管迅速放入95 ℃水浴鍋水浴5 min，常溫下冷卻后以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心20 min，取上清液測定蛋白質(zhì)得率。用0.5 mol/L的NaOH和HCl溶液將蛋白提取液調(diào)至等電點（pH 2.8，由1.2.7可知），于4 ℃恒溫冰箱靜置24 h，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，去上清液取沉淀，將沉淀冷凍干燥48 h后得到芋艿蛋白質(zhì)粉。

1.2.4 芋艿蛋白質(zhì)得率的測定

取1 mL蛋白提取液于試管，加入5 mL考馬斯亮藍溶液，靜置5 min后在波長595 nm處測定其吸光度，將吸光度代入蛋白標準曲線的回歸方程，得到蛋白提取液的蛋白質(zhì)量濃度，按照式（1）計算出芋艿蛋白質(zhì)得率。

式中：Y為蛋白質(zhì)得率；C為蛋白提取液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為芋艿干粉質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素試驗

固定各因素水平：料液比1∶20 g/mL，pH 7，酶用量2.0%，反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時間2 h。分別考察pH（4，5，6，7和8）、酶用量（0.25%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）、反應(yīng)溫度（30，40，50，60和70 ℃）和反應(yīng)時間（30，60，90，120和150 min）4個因素對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響。

1.2.6 響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素水平的結(jié)果，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件，以pH、酶用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間為自變量，以芋艿蛋白得率為響應(yīng)值進行四因素三水平的試驗設(shè)計，優(yōu)化提取工藝。相關(guān)試驗因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平

1.2.7 芋艿蛋白質(zhì)等電點測定

量取芋艿蛋白提取液分裝至離心管，每個離心管10 mL提取液，用0.5 mol/L的鹽酸和0.5 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH分別為2.0，2.2，2.4，2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8和4.0，將離心管置于4 ℃恒溫冰箱箱沉淀24 h后，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 min，去除離心管中的沉淀，取上清液，采用考馬斯亮藍法在波長595 nm處測定吸光度，吸光度最低時的pH為芋艿蛋白質(zhì)的等電點。

1.2.8 芋艿蛋白質(zhì)抗氧化活性測定

將芋艿蛋白質(zhì)粉分別配制成質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的蛋白溶液。VC可以清除自由基、促進細胞再生，具有很強的抗氧化活性，常被用來作為抗氧化性試驗的對照。配制對應(yīng)濃度的VC溶液，比較芋艿蛋白與VC的抗氧化活性。

分別量取2 mL不同質(zhì)量濃度芋艿蛋白溶液于棕色試管，加入2 mL現(xiàn)配制的0.2 mmol/L的DPPH溶液，充分振蕩混勻，在避光的條件下靜置30 min后，在波長517 nm處測定其吸光度，按照式（2）計算DPPH清除率，VC溶液測定方法同上。

式中：A0為蒸餾水與DPPH混合溶液的吸光度；A1為樣品與DPPH混合溶液的吸光度；A2為樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度。

分別量取2 mL不同質(zhì)量濃度的芋艿蛋白溶液于試管，加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和6 mmol/L的雙氧水，搖勻并靜置100 min；加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，靜置20 min后在波長510 nm處測定其吸光度，按照式（3）計算羥自由基清除率。

式中：A0為蒸餾水替換樣品溶液的吸光度；A1為樣品溶液與混合液的吸光度；A2為蒸餾水替換雙氧水溶液的吸光度。

1.2.9 不同品種間蛋白質(zhì)含量差異的研究

在優(yōu)化提取工藝條件下對海南芋艿、馬山芋艿、靖江香沙芋、雞爪芋等共8種不同品種芋艿進行蛋白質(zhì)提取，測定其得率，研究其品種間差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復(fù)3次，取平均值；響應(yīng)面設(shè)計采用Design-Expert. V8.0.6軟件；統(tǒng)計學分析采用Excel 2016軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響

隨著酶用量的增加，芋艿蛋白質(zhì)得率逐漸增大，酶用量2.0%時達最大值3.66%，酶用量繼續(xù)增加時，蛋白得率略微下降（圖1）。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：當芋艿干粉濃度固定時，酶用量的增加使底物與木瓜蛋白酶的接觸面積和接觸概率增大，從而提高芋艿蛋白質(zhì)得率；酶用量繼續(xù)增加時，酶濃度處于過飽和狀態(tài)，酶與底物發(fā)生競爭，導(dǎo)致部分酶分子不能和底物接觸，從而影響蛋白質(zhì)得率[11]。綜合上述試驗現(xiàn)象，確定最佳酶用量為2%。

圖1 酶用量對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響

2.1.2 pH對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響

隨著pH逐漸增大，芋艿蛋白質(zhì)得率隨之增大，pH 7時達最大值3.04%，當pH繼續(xù)增大時，蛋白質(zhì)得率開始下降（圖2）。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：酶分子是特殊的蛋白分子，由1個或若干個活性部位組成酶的活性部位只有保持一定空間構(gòu)象才能存在，其催化功能才能實現(xiàn)[12]。pH較低時，木瓜蛋白酶的空間構(gòu)象受到破壞，活性較低；pH達到適宜條件后，酶具有較高的催化水解活性，從而提高蛋白質(zhì)得率。綜合上述試驗現(xiàn)象，確定最佳pH為7。

圖2 pH對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響

2.1.3 反應(yīng)時間對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響

隨著反應(yīng)時間的增加，芋艿蛋白質(zhì)得率隨之增加，反應(yīng)時間60 min時達最大值3.37%，反應(yīng)時間繼續(xù)增加時，蛋白得率下降（圖3）。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：酶與底物隨時間推移逐漸反應(yīng)完全，在60 min時反應(yīng)基本完成；反應(yīng)時間繼續(xù)增加時，蛋白質(zhì)可能會出現(xiàn)凝聚沉淀現(xiàn)象，在離心時與殘渣一同被去除，從而影響蛋白質(zhì)得率[13]。故確定最佳反應(yīng)時間為60 min。

圖3 反應(yīng)時間對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響

2.1.4 反應(yīng)溫度對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響

隨著反應(yīng)溫度的上升，芋艿蛋白質(zhì)得率隨之增加，反應(yīng)溫度50 ℃時達最大值3.74%，當溫度繼續(xù)上升時，蛋白得率下降（圖4）。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：反應(yīng)溫度低于酶反應(yīng)最適溫度時，隨著溫度的上升，酶的反應(yīng)速度提高，從而提高蛋白質(zhì)得率；過高的溫度可能會導(dǎo)致酶的活性降低及蛋白質(zhì)的變性[14]，使蛋白質(zhì)得率降低。所以確定最佳反應(yīng)溫度為50 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果

分析單因素試驗的結(jié)果，綜合考慮試驗要求，決定以酶用量2%、pH 7、反應(yīng)時間60 min、反應(yīng)溫度50 ℃為中心點，設(shè)計四因素三水平中心組合試驗。響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面模型的分析

利用Design-Expert. V8.0.6.1軟件分析表2數(shù)據(jù)的響應(yīng)面回歸參數(shù)，以芋艿蛋白質(zhì)得率為響應(yīng)值，得到回歸方程：Y=-10.611 08+7.785 33A+0.263 83B- 0.011 067C+0.254 25D-0.6AB-2.333 33×10-3AC-0.1AD+4.75×10-3BC+0.014 750BD+6×10-4CD- 1.644 67A2-0.091 167B2-4.526 85×10-4C2-3.749 17× 10-3D2。模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析

由表3可知，該回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬差不顯著（P＞0.05），說明其他未知干擾因子對試驗結(jié)果影響較小，模型與實際情況擬合較好。模型決定系數(shù)R2=0.976 8，模型校正系數(shù)Radj2=0.953 6，說明模型能解釋95.36%響應(yīng)值的變化，試驗值與預(yù)測值在試驗范圍內(nèi)的一致性較高，可用于對芋艿蛋白質(zhì)的得率進行結(jié)果分析和預(yù)測。在模型中，一次項A（酶用量）、B（pH）、C（反應(yīng)時間）對芋艿蛋白質(zhì)得率影響極顯著（P＜0.01），D（反應(yīng)溫度）對蛋白質(zhì)得率影響不顯著（P＞0.05）；交互項中，BC、BD、CD對蛋白質(zhì)得率影響極顯著，其余對蛋白質(zhì)得率影響不顯著；二次項均為極顯著。根據(jù)4個單因素F值判斷，影響芋艿蛋白質(zhì)得率因素的順序為反應(yīng)時間＞pH＞酶用量＞反應(yīng)溫度。

2.2.3 響應(yīng)面各因素交互作用分析

為更直觀地反映pH與反應(yīng)時間（BC）、pH與反應(yīng)溫度（BD）、反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度（CD）3個兩因素交互作用對蛋白質(zhì)得率的影響規(guī)律，分別將模型中其他兩個因素水平固定為0，繪制相應(yīng)的等高線圖及三維曲面圖。通過觀察等高線圖橢圓的曲線水平及三維曲面圖坡度情況，反映兩因素交互作用的顯著性。橢圓形程度越高，表明交互作用越顯著；響應(yīng)面圖的坡面越陡，表示交互作用的影響程度越深。結(jié)果如圖5～圖7所示。

圖5表示在固定酶用量2.0%、反應(yīng)溫度50 ℃時，pH與反應(yīng)時間交互作用對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響。pH一定時，蛋白質(zhì)得率隨反應(yīng)時間先上升后下降；當反應(yīng)時間一定時，pH為7可以得到較高的蛋白質(zhì)得率。由響應(yīng)面圖中可知，坡面在反應(yīng)時間一側(cè)更為陡峭，等高線相對密集，表明反應(yīng)時間對蛋白質(zhì)得率的影響大于pH。

圖5 pH與反應(yīng)時間交互作用等高線和響應(yīng)面圖

圖6表示在固定酶用量2.0%、反應(yīng)時間60 min時，pH與反應(yīng)溫度交互作用對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響。在pH一定時，蛋白質(zhì)得率隨反應(yīng)溫度先上升后下降；當反應(yīng)溫度一定時，pH為7可以得到較高的蛋白質(zhì)得率。由響應(yīng)面圖中可知，坡面在pH一側(cè)更為陡峭，等高線相對密集，表明pH對蛋白質(zhì)得率的影響大于反應(yīng)溫度。

圖6 pH與反應(yīng)溫度交互作用等高線和響應(yīng)面圖

圖7表示在固定酶用量2.0%、pH 7時，反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度交互作用對芋艿蛋白質(zhì)得率的影響。在反應(yīng)時間一定時，蛋白質(zhì)得率隨反應(yīng)溫度先上升后下降；當反應(yīng)溫度一定時，反應(yīng)時間60 min可以得到較高的蛋白質(zhì)得率。由響應(yīng)面圖中可知，坡面在反應(yīng)時間一側(cè)更為陡峭，等高線相對密集，表明反應(yīng)時間對蛋白質(zhì)得率的影響大于反應(yīng)溫度。

圖7 反應(yīng)時間與反應(yīng)溫度交互作用等高線和響應(yīng)面圖

2.2.4 工藝驗證試驗

利用Design-Expert. V8.0.6軟件對回歸模型的參數(shù)進行優(yōu)化，確定芋艿蛋白質(zhì)得率的最佳工藝條件：酶用量2.08%、pH 6、反應(yīng)時間44.72 min、反應(yīng)溫度46.51 ℃。預(yù)測的蛋白質(zhì)得率為3.788%。為證明響應(yīng)面優(yōu)化工藝的可靠性，進行驗證試驗，結(jié)合實際操作合理性，將工藝參數(shù)確定為酶用量2.1%、pH 6、反應(yīng)時間45 min、反應(yīng)溫度46.5 ℃。進行3次重復(fù)試驗取平均數(shù)，芋艿蛋白質(zhì)得率為3.78%，與預(yù)測值偏差0.3%，說明優(yōu)化后的提取參數(shù)條件可靠，可用于實際生產(chǎn)操作。

2.3 芋艿蛋白質(zhì)等電點

當?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點時，蛋白質(zhì)分子所攜帶的正負電荷數(shù)相同，電荷作用力抵消[15]，蛋白質(zhì)顆粒容易發(fā)生碰撞，并因失去電荷和脫水而析出。如圖9所示，當pH在2.8附近，芋艿蛋白上清液的吸光度最低。說明在pH 2.8時溶液中含有的蛋白質(zhì)含量最少，為該芋艿蛋白的等電點。

圖9 芋艿蛋白質(zhì)等電點

2.4 芋艿蛋白質(zhì)抗氧化活性

抗氧化劑能使DPPH溶液發(fā)生自由基清除現(xiàn)象，作用表現(xiàn)為溶液紫色削弱或消失，同時在波長517 nm處吸光度變小，表示抗氧化作用較強[16]。如圖10所示：在0.2～0.6 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度上升，芋艿蛋白溶液對DPPH的清除率迅速增大；在0.6～1.0 mg/mL質(zhì)量濃度范圍時，蛋白質(zhì)對DPPH的清除率上升緩慢并趨于穩(wěn)定。利用prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，得出芋艿蛋白質(zhì)對DPPH·的IC50=0.398 7 mg/mL，其IC50值小于10 mg/mL，這表明芋艿蛋白質(zhì)具有較為良好的抗氧化活性[16]。而VC溶液對DPPH的清除能力穩(wěn)定在95%～95.5%的范圍內(nèi)，且波動很小，說明芋艿蛋白質(zhì)對DPPH自由基的清除能力小于VC。

圖10 芋艿蛋白質(zhì)與VC對DPPH自由基的清除能力

羥基是極其活躍的自由基，可與活細胞內(nèi)的分子進行反應(yīng)，致細胞分子組織的過氧化，從而引發(fā)疾病，而游離的氨基酸可以較快地與·OH結(jié)合，從而達到清除作用[17]。如圖11所示，在0.2～1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，芋艿蛋白對羥自由基的清除能力逐漸增強。利用prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，芋艿蛋白質(zhì)對·OH的IC50為0.496 3 mg/mL，表明芋艿蛋白對羥自由基具有良好的清除能力。

圖11 芋艿蛋白質(zhì)與VC對羥自由基的清除能力

2.5 芋艿蛋白質(zhì)含量的品種間差異

采用最佳工藝條件，對不同芋艿品種蛋白質(zhì)得率測定，結(jié)果如表4所示。芋艿蛋白質(zhì)得率在不同品種間具有較大差異，變異幅度在1.58%～3.96%，平均得率為3.13%，變異系數(shù)為26.2%。說明不同品種的蛋白質(zhì)含量有較大差異，通過合適的育種途徑，可以篩選到高蛋白的芋艿品種。

表4 不同種芋艿蛋白質(zhì)得率

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面分析法對酶法提取芋艿蛋白質(zhì)的工藝進行優(yōu)化，最佳提取工藝條件為酶用量2.1%，pH 6，反應(yīng)時間45 min，反應(yīng)溫度46.5 ℃。在此條件下，芋艿蛋白質(zhì)得率為3.78%，與預(yù)測值3.79%擬合程度極高，相較于同類研究[8-9]提取工藝得率分別提高6.2倍和1.8倍。同時，抗氧化性的分析表明，芋艿的蛋白質(zhì)對DPPH·和·OH均具備較強的清除能力，其IC50分別為0.398 7和0.496 3 mg/mL。此外，不同品種的芋艿之間蛋白質(zhì)含量差異明顯，其中雞爪芋的蛋白質(zhì)含量最高，得率達3.96%，而海南芋艿得率最低，為1.58%。試驗結(jié)果為高蛋白芋艿品種的選育提供理論基礎(chǔ)。