植物乳桿菌真空冷凍干燥工藝的優(yōu)化

宮俊峰，張國(guó)柱，趙玉明，彭曉光，麻杰，王慕華

1. 山西維爾生物乳制品有限公司（太原 030006）；2. 山西省生物研究院有限公司醫(yī)藥生物技術(shù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（太原 030006）

植物乳桿菌存在于人類腸道中，起重要的生理作用，是目前開發(fā)研究較為深入的一種常見益生菌[1-2]，具有提高免疫[3]、改善人體腸道菌群平衡[4]、抑制病原體的繁殖[5]及抗癌[6]等功能，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品及保健品等領(lǐng)域[7]。降低溫度、水分、壓力、含氧量等不利條件的影響，提高菌體存活率，一直是產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用過(guò)程中急需解決的問(wèn)題[8]。目前，通常采用的制備菌粉的方法有氣流干燥法、冷凍干燥法和噴霧干燥法[9]。真空冷凍干燥法[10]通過(guò)快速凍結(jié)需要干燥的物料，在較低的溫度下升華水分，達(dá)到干燥目的[11-12]，被認(rèn)為是最為溫和的脫水技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于各類益生菌菌粉的制備。但受各種因素影響，在凍干過(guò)程中細(xì)胞仍然會(huì)受到各種損害，降低細(xì)胞存活率，甚至引起菌體死亡。凍干保護(hù)劑可以改善菌體凍干時(shí)的環(huán)境[13-15]，合適的凍干條件可以減少冷凍干燥過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的損害，盡可能保持微生物原有的各種生理生化特性和生物活性[16-17]，研究采用真空冷凍干燥方法制備植物乳桿菌菌粉，通過(guò)對(duì)凍干保護(hù)劑配方的優(yōu)化和凍干條件的研究，考察不同工藝對(duì)菌體存活率的影響，從而獲得較好的植物乳桿菌真空冷凍干燥工藝，以期為凍干益生菌的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：植物乳桿菌SX68，山西省生物研究院有限公司分離、保藏。

平板活菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基：MRS肉湯[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母提取物5 g/L，K2HPO43 g/L，檸檬酸氫二胺4 g/L，乙酸鈉5 g/L，葡萄糖30 g/L，吐溫80 1 mL/L，MgSO4·7H2O 0.58 g/L，MnSO4·4H2O 0.25 g/L，pH 6.4，試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BJ-2CD超凈工作臺(tái)（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；YXQ-70A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；FE28-standard pH計(jì)（瑞士梅特勒-托利多公司）；MTV-1漩渦振蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；H1850R冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；Minispin plus高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司）；DK-8D電熱恒溫水浴槽（常州諾基儀器有限公司）；UV-1500紫外分光光度計(jì)（上海美析儀器有限公司）；C-32厭氧培養(yǎng)盒（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社）。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌高密度培養(yǎng)

植物乳桿菌經(jīng)斜面活化后，接種于10 L種子罐，于35 ℃培養(yǎng)16 h，按接種量20 mL/L接種于100 L發(fā)酵罐中。培養(yǎng)條件：起始pH 6.5，培養(yǎng)溫度35 ℃，溶氧控制在100 mL/L以下，攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，罐壓0.03 MPa，發(fā)酵培養(yǎng)20 h。

1.3.2 植物乳桿菌發(fā)酵液濃縮

發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液通過(guò)運(yùn)輸管道打入管式離心機(jī)中，按10 000 r/min連續(xù)離心20 min制備菌泥。

1.3.3 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化

在100 mL無(wú)菌水中添加2.5 g脯氨酸、3 g水溶性海藻糖的基礎(chǔ)上，選取對(duì)凍干后菌株存活率影響較大的保護(hù)劑脫脂乳粉、低聚果糖、乳糖和半乳糖作為不同因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳凍干保護(hù)劑配方。

1.3.4 凍干條件優(yōu)化

在確定最佳凍干保護(hù)劑的基礎(chǔ)上，以預(yù)凍溫度、預(yù)凍時(shí)間、菌泥比例、凍干鋪平厚度作為不同因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化凍干條件。

1.3.5 植物乳桿菌凍干粉制備

在最優(yōu)凍干保護(hù)劑配方、最佳凍干條件下，真空度保持0.2 mbar，做凍干曲線，制備益生菌凍干粉。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物乳桿菌高密度培養(yǎng)

100 L發(fā)酵罐在裝液量70 L的情況下，嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，發(fā)酵20 h，發(fā)酵液稀釋20倍，以正常發(fā)酵5罐計(jì)，菌體平均A600可達(dá)0.46，平板活菌計(jì)數(shù)平均活菌量可達(dá)8.32×1010CFU/mL。

2.2 植物乳桿菌菌泥制備

發(fā)酵結(jié)束后，菌液經(jīng)管式離心機(jī)以10 000 r/min連續(xù)離心20 min制備菌泥，70 L發(fā)酵液最終離心可得菌泥700 g。平板活菌計(jì)數(shù)活菌量可達(dá)9.18×1011CFU/g，菌體存活率為11.03%。

2.3 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化

不同類型的保護(hù)劑保護(hù)機(jī)制不同，單一類型的凍干保護(hù)劑往往不能達(dá)到很好的保護(hù)效果，因此需要將多種類型的保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配從而得到復(fù)合凍干保護(hù)劑，從多個(gè)方面對(duì)菌株進(jìn)行保護(hù)。較常使用的保護(hù)劑有糖類（海藻糖、乳糖、半乳糖、低聚果糖等）、氨基酸類（脯氨酸、丙氨酸、L-絲氨酸、甘氨酸等）和復(fù)合物（脫脂乳粉、明膠），它們以不同的方式保護(hù)菌體免遭外界侵害。在前期工作的基礎(chǔ)上，50 g菌泥加100 mL無(wú)菌水，固定脯氨酸、水溶性海藻糖的添加量，將為細(xì)胞提供機(jī)械保護(hù)和阻止冰晶生長(zhǎng)的半滲透類保護(hù)劑低聚果糖、乳糖、半乳糖，和可以在細(xì)菌壁外表面形成保護(hù)殼、阻止細(xì)胞與冰晶和氧氣接觸從而減少菌株損傷的不滲透類保護(hù)劑脫脂乳粉作為不同因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，確定最佳凍干保護(hù)劑配方。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

表1 凍干保護(hù)劑配方正交試驗(yàn)

從表1可見：不同因素對(duì)凍干后菌體密度影響大小依次為低聚果糖＞脫脂乳粉＞半乳糖＞乳糖，其最佳添加量為100 mL無(wú)菌水中低聚果糖5 g，脫脂乳粉12.5 g，半乳糖4.5 g，乳糖3 g。最佳保護(hù)劑配方為低聚果糖5 g/100 mL、脫脂乳粉12.5 g/100 mL、半乳糖4.5g/100 mL、乳糖3 g/100 mL、脯氨酸2.5 g/100 mL、水溶性海藻糖3 g/100 mL。用此保護(hù)劑制備菌粉，平板活菌計(jì)數(shù)活菌量可達(dá)4.67×1011CFU/g。凍干前菌泥的質(zhì)量為700 g，活菌量為9.18×1011CFU/g；凍干后菌粉質(zhì)量為1 127 g，活菌量為4.67×1011CFU/g；菌體存活率為81.90%。

2.4 凍干條件優(yōu)化

預(yù)凍溫度和預(yù)凍時(shí)間對(duì)菌體的冷凍干燥非常重要，若預(yù)凍溫度較高、時(shí)間過(guò)短，樣品無(wú)法完全冷凍，真空升華過(guò)程中融化并且膨脹發(fā)泡，影響最終的菌粉狀態(tài)；若預(yù)凍溫度過(guò)低、預(yù)凍時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，不僅會(huì)增加能耗，浪費(fèi)資源，而且會(huì)加重菌體損傷，降低菌株的凍干存活率。凍干時(shí)菌體和凍干保護(hù)劑在凍干盤中的厚度直接影響凍干時(shí)間。因此，在確定最佳凍干保護(hù)劑的基礎(chǔ)上，以預(yù)凍溫度、預(yù)凍時(shí)間、菌泥與水的比例、凍干鋪平厚度作為不同因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，優(yōu)化凍干條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 凍干條件正交試驗(yàn)

從表2可見：不同凍干條件對(duì)凍干粉活菌數(shù)影響大小依次為菌泥比例＞預(yù)凍溫度＞預(yù)凍時(shí)間＞凍干厚度，其最佳凍干條件為菌泥比例50 g/100 mL，預(yù)凍溫度-45 ℃，預(yù)凍時(shí)間4 h，凍干厚度1.0 cm。確定最優(yōu)凍干條件：菌泥比例50 g/100 mL、預(yù)凍溫度-45 ℃、預(yù)凍時(shí)間4 h、凍干厚度1.0 cm、真空度0.2 mbar。在此條件下，平板活菌計(jì)數(shù)活菌量可達(dá)5.06×1011CFU/g，菌體存活率為88.74%。

2.5 植物乳桿菌菌粉制備

在最優(yōu)凍干保護(hù)劑配方、最佳凍干條件下，真空度保持0.2 mbar，做凍干曲線，制備益生菌凍干粉。益生菌凍干粉制備曲線如圖1所示。

圖1 益生菌粉凍干曲線

從圖1可見：-45 ℃預(yù)凍4 h后，開始凍干粉制備。起始溫度-35 ℃，2 h后升溫至-25 ℃，5 h后升溫至-20 ℃，然后-20，-15，-10，-5和0 ℃各保持10 h，升溫至25 ℃、2 h，最終升溫至35 ℃、6 h結(jié)束真空冷凍干燥。在此條件下，凍干總時(shí)長(zhǎng)69 h，凍干粉活菌數(shù)均可達(dá)到5×1011CFU/g以上。

3 結(jié)論

目前所見的關(guān)于真空冷凍干燥技術(shù)的報(bào)道大多集中在凍干保護(hù)劑的優(yōu)化上，關(guān)于凍干條件的優(yōu)化很少見。研究通過(guò)正交試驗(yàn)，最終優(yōu)化后的植物乳桿菌凍干保護(hù)劑為低聚果糖5 g/100 mL、脫脂乳粉12.5 g/100 mL、半乳糖4.5 g/100 mL、乳糖3 g/100 mL、脯氨酸2.5 g/100 mL、水溶性海藻糖3 g/100 mL；最優(yōu)凍干條件為菌泥比例50 g/100 mL、預(yù)凍溫度-45 ℃、預(yù)凍時(shí)間4 h、凍干厚度1.0 cm、真空度0.2 mbar。在此條件下，植物乳桿菌的凍干存活率為88.74%，優(yōu)化凍干條件后植物乳桿菌存活率提高了6.84%，植物乳桿菌凍干存活率較現(xiàn)有報(bào)道都高[18]。該試驗(yàn)建立了植物乳桿菌凍干粉的制備工藝，可為益生菌凍干粉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。