關(guān)節(jié)腔注射劑青藤堿納米晶自穩(wěn)定Pickering乳液的制備及藥效學(xué)研究

張?bào)揸?，?霄，白皓天，李婭蘭，孫淑慧，張倩倩，楊 婧，王 銳, 3*

·藥劑與工藝·

關(guān)節(jié)腔注射劑青藤堿納米晶自穩(wěn)定Pickering乳液的制備及藥效學(xué)研究

張?bào)揸?，梁 霄1，白皓天1，李婭蘭1，孫淑慧1，張倩倩1，楊 婧2，王 銳1, 3*

1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040

通過制備青藤堿納米晶自穩(wěn)定Pickering乳液（sinomenine nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions，Sin- NSSPE）關(guān)節(jié)腔注射劑，在關(guān)節(jié)腔內(nèi)形成藥物貯庫，緩慢釋放以提高生物利用度，降低藥物毒副作用，以青藤堿納米晶（sinomenine nanocrystal，Sin-NCs）自身為穩(wěn)定劑制備Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射劑，用藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)考察其對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的治療效果。通過藥物質(zhì)量濃度、油水相比例和水相pH值等因素對Sin-NSSPE進(jìn)行優(yōu)化，運(yùn)用福氏佐劑關(guān)節(jié)炎方法建立RA大鼠模型，以關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、脾指數(shù)、酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）、組織病理學(xué)檢查、Western blotting法作為指標(biāo)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示Sin-NSSPE的粒徑均勻，載藥量良好，Sin-NCs的平均粒徑為（121.49±18.26）nm、Sin-NSSPE的粒徑為（1 159.60±160.15）nm、載藥量4.92 mg/mL；藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與青藤堿ig組相比，Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組能有效降低關(guān)節(jié)腫脹度和炎癥指數(shù)，改善滑膜組織的病變、抑制關(guān)節(jié)炎癥。青藤堿關(guān)節(jié)腔注射組和Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組均能明顯改善大鼠關(guān)節(jié)腫脹，降低滑膜組織中炎癥因子白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達(dá)（＜0.05、0.01），且Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組治療效果優(yōu)于青藤堿關(guān)節(jié)注射組，同時(shí)劑型穩(wěn)定性提高并形成藥物貯庫，使藥效更加平穩(wěn)。制備的Sin-NSSPE性質(zhì)穩(wěn)定，Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射對大鼠RA有良好的療效。

青藤堿；納米晶自穩(wěn)定Pickering乳液；關(guān)節(jié)腔注射；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；貯庫效應(yīng)；巨噬細(xì)胞釋藥

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、侵襲性自身免疫疾病，以對稱性、破壞性的關(guān)節(jié)滑膜病變?yōu)橹饕卣鳎±硇愿淖儽憩F(xiàn)為滑膜炎，急性期滑膜腫脹、滲出、中性粒細(xì)胞浸潤[1]，慢性期滑膜增生肥厚，形成血管翳，同時(shí)會導(dǎo)致關(guān)節(jié)變形、關(guān)節(jié)破壞和功能性障礙，RA的發(fā)生是由很多因素導(dǎo)致[2-3]，包括免疫因素、遺傳因素、環(huán)境因素等，并且對疾病機(jī)制還在不斷地發(fā)展和研究之中。現(xiàn)階段非甾體抗炎藥是治療RA的一線藥物，例如阿司匹林腸溶劑、吲哚美辛栓劑等，但具有復(fù)雜的體內(nèi)代謝過程，使藥物無法直接到達(dá)RA局部，降低了藥物治療效果，因此可直達(dá)病變部位、快速起效、毒副作用小、生物利用度高的劑型是RA藥物研究的新方向。青藤堿是從防己科防己屬植物青藤(Thunb.) Rehd. et Wils.中提取出的生物堿單體，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[4]，被廣泛應(yīng)用于臨床治療RA和神經(jīng)痛，研究表明[5-6]，青藤堿對運(yùn)動系統(tǒng)炎癥、消化系統(tǒng)炎癥、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥等疾病具有明確的治療作用。其主要以口服和注射制劑應(yīng)用于臨床，但存在著藥物溶解度低、生物半衰期較短和生物利用度低等問題[5]，且服用劑量大，易引起胃腸道不良反應(yīng)、肝腎損傷和嚴(yán)重的心臟毒性，所以臨床用藥對給藥劑量小、包封率和載藥量高、生物半衰期長的制劑有著迫切的需求。

Pickering乳液是以二氧化硅、纖維素納米晶等固體顆粒作為穩(wěn)定劑，固體顆粒在油-水相之間的乳化層形成乳化膜來穩(wěn)定乳滴，進(jìn)而阻止乳滴的聚集，而藥物納米晶自穩(wěn)定Pickering乳液（nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions，NSSPE）則是以難溶藥物固體顆粒自身作為穩(wěn)定劑的乳液。NSSPE藥物輸送系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)具有小粒徑、分散均勻度高、藥物分散度高，可提高腸胃膜的通透性，促進(jìn)藥物吸收，提高其生物利用度、延長生物半衰期、降低不良反應(yīng)和毒性反應(yīng)[7-9]，同時(shí)藥物固體顆粒作為穩(wěn)定劑，以油、水和藥物為3相，從而避免表面活性劑和異相穩(wěn)定劑的藥物毒性，降低Pickering乳液的不良反應(yīng)，同時(shí)難溶性藥物即溶解于油相，也被乳化層所吸附，發(fā)揮藥物貯庫效應(yīng)提高載藥量。NSSPE自身可通過注射、透皮吸收等多種途徑給藥的獨(dú)特優(yōu)勢，使其在臨床應(yīng)用中有著廣闊的前景。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ASP200S型石蠟包埋機(jī)、RM2235型切片機(jī)、HI1220型烤片臺、HI1220型水浴缸、G1150 H型加熱石蠟包埋系統(tǒng)、DM3000型顯微鏡，德國Leica公司；Nano-ZS90型粒徑分析儀，馬爾文儀器有限公司；IID型超聲細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；FA30D型小型高速剪切機(jī)，上海弗魯克科技發(fā)展有限公司；APV-1000型高壓均質(zhì)儀，北京漢默泰克流體技術(shù)有限公司；DF-101Z型磁力攪拌器，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Waters H-Class e2695型超高效液相色譜儀，沃特世科技（上海）有限公司；TD5型離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SPARK 10M型酶標(biāo)儀，TECAN公司；DYCZ-2DN型電泳儀、WD-9405F型脫色搖床、WD-9423B型化學(xué)發(fā)光分析儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 藥品和試劑

青藤堿原料藥（批號DT0110522A，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），購自陜西大田生物科技有限公司；泊洛沙姆（批號C13279022）、氧化鋯（批號C13665082）購自上海麥克林生化科技有限公司；中鏈脂肪酸甘油三酯（批號G107437）、聚乙二醇硬脂酸酯（批號P139716）、聚乙二醇400（批號P103735），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；普朗尼克F127（F127，批號P822479）購自上海麥克林生化科技有限公司；青藤堿對照品（批號B20995，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M1944 CS，批號S23148）購自上海源葉生物科技有限公司；弗氏完全佐劑（批號SLCC73365），購自美國Sigma公司；滅活卡介苗佐劑（批號R19017）購自上海瑞楚生物科技有限公司；蘇木精-伊紅染料（批號ZM52036），購自上海紫銘試劑廠；白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1，批號SP10178）ELISA試劑盒、IL-6（批號SP10234）ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批號SP240246）ELISA試劑盒，武漢賽培生物科技有限公司；ECL超敏化學(xué)發(fā)光液試劑盒，批號GC10AA0055，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA試劑盒（批號20220415），購自Bio-Swamp Life Science Lab；β-actin抗體（批號F200050）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（批號F300508）購自Abways Technology公司；IL-1β抗體（批號#85m5763）、IL-6抗體（批號#86m6953）、TNF-α抗體（批號#84g4358）購自Affinity BiOSciences公司。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠，平均體質(zhì)量205.40 g，6周齡，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SYXK（黑）2022-006，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理和使用委員會批準(zhǔn)，編號為2022032701。

2 方法和結(jié)果

2.1 青藤堿納米晶（sinomenine nanocrystal，Sin-NCs）和Sin-NSSPE的制備

2.1.1 Sin-NCs 采用介質(zhì)研磨法[10-11]制備Sin- NCs，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)考察得到制備方法如下：稱取青藤堿原料藥0.2 g及穩(wěn)定劑F127 40 mg，置于100 mL燒杯中，加入50 mL超純水、磁力轉(zhuǎn)子及氧化鋯（粒徑在0.4～0.6 mm），置于磁力攪拌器研磨24 h，濾過除去氧化鋯，將溶液在超聲波細(xì)胞破碎儀中超聲（1200 W，工作5 s，間歇5 s）30 min，即得Sin-NCs混懸液。

2.1.2 Sin-NSSPE 將按照“2.1.1”項(xiàng)下方法制備的Sin-NCs混懸液與10 mL中鏈脂肪酸甘油三酯混合，加入1.0 mL Labrafil M1944 CS和100 mL純水，使用高壓剪切機(jī)15 000 r/min剪切3 min，100 MPa下循環(huán)均質(zhì)10次，超聲細(xì)胞破碎儀在油水相界面處探頭超聲10 min，即得Sin-NSSPE。

2.1.3 空白NSSPE 在“2.1.2”項(xiàng)方法下，不加入Sin-NCs制備NSSPE，即得到空白NSSPE。

2.2 青藤堿含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈-水-乙二胺（30∶70∶0.25）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長262 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取減壓干燥至恒定質(zhì)量的青藤堿對照品10 mg，置于100 mL量瓶中，振搖得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密移取Sin-NSSPE 100 μL，甲醇定容至10 mL量瓶，得到供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的配制 將空白NSSPE經(jīng)過“2.2.3”項(xiàng)方法處理，得到陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性考察 取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖（圖1），結(jié)果表明此色譜條件下，陰性對照溶液在青藤堿的保留時(shí)間內(nèi)未出現(xiàn)色譜峰，表明其他成分對青藤堿的檢測無干擾。

圖1 青藤堿對照品溶液(A)、Sin-NSSPE供試品溶液(B)和陰性對照溶液(C)的HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 取一定量的青藤堿對照品，使用甲醇稀釋為質(zhì)量濃度5.2、2.6、1.04、0.52、0.104、0.052、0.031 2 μg/mL的系列對照品溶液，進(jìn)樣并記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標(biāo)（），以進(jìn)樣質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，求得回歸方程＝7 897.1＋2 033.3，2＝0.999 9，結(jié)果表明，青藤堿在0.031 2～5.20 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.6”項(xiàng)下高、中、低質(zhì)量濃度（0.031 2、0.520 0、5.20 μg/mL）的對照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。計(jì)算得高、中、低質(zhì)量濃度的對照品溶液中青藤堿峰面積的RSD依次為1.14%、2.072%、2.52%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算得Sin-NSSPE中青風(fēng)藤質(zhì)量濃度的RSD為1.42%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、14 h進(jìn)樣分析，計(jì)算得青藤堿峰面積的RSD為1.98%，結(jié)果表明供試品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取Sin-NSSPE和對照品溶液各0.5 mL，混勻，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算青藤堿加樣回收率，結(jié)果得到青藤堿的平均加樣回收率為99.17%，RSD為1.17%。

2.3 Sin-NSSPE乳化指數(shù)和粒徑分布測定

將新配制的Sin-NSSPE在30 ℃條件下靜置，分別于0、14 d觀察乳液的絮凝、分層等不穩(wěn)定狀態(tài)，記錄乳液層高度，測得0 d樣品總高度（0）和放置h后乳液層高度（H），計(jì)算乳化指數(shù)（creaming index，CI）。當(dāng)乳液明顯出現(xiàn)絮凝、分層、沉淀等現(xiàn)象時(shí)，乳化指數(shù)為0。

CI＝H/0

在試管中加入2 mL新配置的Sin-NSSPE，并加入到40 mL純化水中（稀釋20倍），用激光粒度測定儀檢測Sin-NSSPE粒徑和粒徑分布。

2.4 Sin-NSSPE處方工藝的單因素考察

2.4.1 不同油相種類對青藤堿溶解度的影響 取肉豆蔻酸異丙酯、單油酸甘油酯、辛酸/葵酸甘油一酯二酯、油酸乙酯、中鏈脂肪酸甘油三酯各3 mL，加入過量青藤堿原料藥，超聲處理2 h，離心（轉(zhuǎn)速4000 r/min，離心半徑為6.3 cm）30 min，取上清液置于10 mL量瓶中，定容。以聚乙二醇硬脂酸酯和聚乙二醇400作為乳化劑和助乳化劑，并按照1∶1比例得到混合乳劑。設(shè)定油相和混合乳劑1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例進(jìn)行混合，在磁力攪拌（溫度37 ℃）的條件下緩慢滴加蒸餾水，觀察各體系溶液狀態(tài)（顏色、澄清度等）的變化。記錄溶液由澄清-渾濁-澄清所需的蒸餾水體積，繪制混合乳化劑-油相-水的偽三元相圖和3D圖，結(jié)果見圖2、3，可見青藤堿在中鏈脂肪酸甘油三酯中具有良好的溶解度，以中鏈脂肪酸甘油三酯為油相制備Sin-NSSPE。

圖2 不同油相比例的偽三元相圖

圖3 不同油相比例的3D映射圖

2.4.2 水相pH值對Sin-NSSPE的影響 調(diào)節(jié)青藤堿粗混懸液pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0，制得不同pH值的Sin-NCs。在不同pH值的Sin-NCs中加入中鏈脂肪酸甘油三酯制備Sin-NSSPE，測定粒徑分布和ζ電位。當(dāng)pH值為4時(shí)，Sin-NSSPE粒徑為1 159.60 nm，ζ電位為?32.36 mV，且隨著pH值的升高，粒徑不斷增大，ζ電位絕對值減小。原因可能是隨著pH值的增加，青藤堿之間相互聚集增加，導(dǎo)致粒徑增大。因此選擇水相pH值為4，粒徑最小且均勻。結(jié)果見表1。

2.4.3 青藤堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)對Sin-NSSPE的影響 稱取適量的青藤堿原料藥，設(shè)定青藤堿粗混懸液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～2.0%，制備Sin-NCs（pH 4），并加入5.5 mL中鏈脂肪酸三酰甘油，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制得不同青藤堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Sin-NSSPE，以CI進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果如圖4所示，青藤堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.1%～0.5%時(shí)，粒徑下降趨勢明顯，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～2.0%時(shí)，粒徑并無明顯的變化，放置后出現(xiàn)藥物沉淀，是因?yàn)榇藭r(shí)油水相載藥層已達(dá)到飽和，導(dǎo)致藥物析出降低了載藥量。當(dāng)青藤堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.5%時(shí)，CI出現(xiàn)明顯下降，而青藤堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，CI無明顯變化。因此選擇青藤堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，該質(zhì)量濃度下粒徑適宜，乳液穩(wěn)定性最好，并且可以避免藥物飽和析出提高載藥量。

表1 不同pH值條件下Sin-NSSPE的粒徑和ζ電位(, n = 3)

Table 1 Particle size and ζ potential of Sin-NSSPE under different pH conditions(, n = 3)

pH值粒徑/nmζ電位/mV 41 159.60±160.15?32.36±1.08 51 316.93±98.46?30.72±1.39 61 549.26±183.61?28.13±1.26 71 873.52±106.72?26.23±0.74

2.4.4 油相比例對Sin-NSSPE構(gòu)建的影響 以油相占總體積的比例為考察因素進(jìn)行單因素考察，稱取青藤堿原料藥制備Sin-NCs（pH 4），加入不同比例的甘油三酯，使油相占比分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5，參照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備Sin-NSSPE（含藥量0.5%），通過CI進(jìn)行評價(jià)。

圖4 青藤堿不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)Sin-NSSPE粒徑變化(A)和CI時(shí)間變化(B)

結(jié)果（圖5）表明，測得不同油相比例Sin-NSSPE的CI分別為19.72%、38.67%、44.39%、52.16%、62.75%，放置30 min后分別為5.12%、9.17%、32.55%、40.16%、17.25%。CI隨著放置時(shí)間的增加呈現(xiàn)降低趨勢，當(dāng)油相比例為0.4時(shí)，CI變化平穩(wěn)，乳液狀態(tài)最穩(wěn)定，說明油相比例過高時(shí)，破壞了乳液的整體穩(wěn)定性，因此制備Sin-NSSPE油相比例為0.4時(shí)最佳。

2.5 最佳工藝確定和驗(yàn)證

期望以青藤堿溶解度處于最大值，Sin-NSSPE的粒徑和ζ電位處于最小值，乳液穩(wěn)定性良好為優(yōu)化指標(biāo)，最終確定Sin-NSSPE最佳的工藝條件是選擇中鏈脂肪酸甘油三酯為油相，水和中鏈脂肪酸甘油三酯的質(zhì)量比為6∶4，同時(shí)設(shè)定水相pH值4和藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%。在該條件下青藤堿在中鏈脂肪酸甘油三酯中溶解性能最佳，粒徑為1 159.6 nm，ζ電位為?26.2 mV，乳液穩(wěn)定性良好，說明單因素考察工藝優(yōu)化是合理的。

圖5 不同油相比例的CI隨時(shí)間變化(A) 和3D曲面映射圖(B)

對最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)行3次重復(fù)測定，平均粒徑為（1 086.70±66.30）nm（＝3），ζ電位為（?25.4±0.3）mV（＝3），表明所得結(jié)果合理。

2.6 Sin-NCs和Sin-NSSPE質(zhì)量評價(jià)

2.6.1 Sin-NCs粒徑和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI） 制備3批不同批次的Sin-NCs，分別取Sin-NSs適量，加水稀釋50倍，采用激光粒度儀測定粒徑和PDI，取平均值，結(jié)果見圖6。粒徑為（121.49±18.26）nm，PDI為0.154±0.016（＝3），表明SIN-NSs粒徑均一，穩(wěn)定性良好。

2.6.2 Sin-NSSPE與青藤堿普通乳液穩(wěn)定性比較 稱取0.2 g的青藤堿原料藥加入5 mL中鏈脂肪酸甘油三酯，1.0 mL Labrafil M1944 CS，0.5 mL聚山梨酯-80，加入50 mL純化水?dāng)嚢瑁褂酶邏杭羟袡C(jī)15 000 r/min剪切3 min，100 MPa下循環(huán)均質(zhì)3 min，即得青藤堿普通乳液。

圖6 SIN-NCs粒徑分布

將新制備的Sin-NSSPE和青藤堿普通乳液在常溫常壓下密封保存，靜置30 d。分別于0、15、30 d取出，測定乳液CI。結(jié)果（表2）表明，Sin-NSSPE以乳劑形態(tài)存在時(shí)間更長，穩(wěn)定性良好。

表2 Sin-NSSPE和青藤堿普通乳液的CI比較(, n = 3)

Table 2 Comparison of CI of Sin-NSSPE and sinomenine ordinary milk (, n = 3)

放置時(shí)間/dCI/% Sin-NSSPE青藤堿普通乳液 065.15±2.5459.15±1.87 1562.49±1.2551.49±2.15 3060.12±2.3648.72±1.13

2.6.3 Sin-NSSPE初步穩(wěn)定性考察 將Sin-NSSPE室溫靜置30 d，分別于0、15、30 d取出，加入甲醇超聲破乳并稀釋定容后離心，吸取上清液加甲醇稀釋得到樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，測定青藤堿質(zhì)量濃度。通過粒徑等指標(biāo)的變化，初步考察Sin-NSSPE的常溫放置穩(wěn)定性。粒徑、青藤堿質(zhì)量濃度和ζ電位與0 d相比，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果（表3）表明，30 d內(nèi)Sin-NSSPE常溫常壓下穩(wěn)定性良好。

2.7 Sin-NSSPE藥效實(shí)驗(yàn)

2.7.1 佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立 SD健康大鼠25只，隨機(jī)選取5只大鼠于右后足底sc 0.1 mL生理鹽水，剩余大鼠通過弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA，10 mg/mL）誘導(dǎo)法建立RA模型。當(dāng)大鼠足部出現(xiàn)急性炎癥腫脹，全身性多發(fā)性的關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為前肢或?qū)?cè)肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結(jié)節(jié)出現(xiàn)，表明造模成功。

表3 Sin-NSSPE室溫靜置后的粒徑、藥物質(zhì)量濃度、ζ電位(, n = 3)

Table 3 Particle size, drug concentration and ζ potential of Sin-NSSPE after standing at room temperature (, n = 3)

放置時(shí)間/d粒徑/μm青藤堿質(zhì)量濃度/(mg·mL?1)ζ電位/mV 01.58±0.314.92±0.31?29.60±2.21 152.21±0.194.84±0.42?27.79±1.76 302.45±0.254.68±0.26?26.42±1.83

2.7.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥方案 注射生理鹽水的SD大鼠設(shè)為對照組，而注射CFA的大鼠分為4組，即模型組、青藤堿混懸液ig組、青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射組和Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組。模型組在造膜后不給藥；ig組在造膜3 d后ig青藤堿混懸液，給藥劑量為18 mg/kg，連續(xù)給藥28 d；青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射組和Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組，于造膜3 d后在大鼠右后踝關(guān)節(jié)腔分別注射50 μL青藤堿混懸液和Sin-NSSPPE，給藥劑量為1.2 mg/只，每周給藥1次，連續(xù)4周。

2.7.3 Sin-NSSPE對大鼠體質(zhì)量及關(guān)節(jié)腫脹度的影響 將造膜當(dāng)天定為第1天，每隔7 d測量大鼠體質(zhì)量。結(jié)果（表4）表明，各組大鼠體質(zhì)量之間并無顯著性差異。

參考文獻(xiàn)方法[12]每隔7 d對大鼠的足容積進(jìn)行測定，按照公式計(jì)算關(guān)節(jié)腫脹度。結(jié)果（表5）表明，與對照組比較，模型組關(guān)節(jié)腫脹度持續(xù)升高，關(guān)節(jié)活動嚴(yán)重受限，具有RA患者相似的病理學(xué)特征，表明造模成功。給藥組均可顯著降低大鼠關(guān)節(jié)腫脹度（＜0.01）。7 d后，Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度低于青藤堿混懸液ig組和青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射組，表明Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組治療RA具有更顯著的效果。

表4 Sin-NSSPE對大鼠體質(zhì)量的影響(, n = 5)

Table 4 Effects of Sin-NSSPE on body weight of rats (, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)體質(zhì)量/g 1 d7 d14 d21 d28 d 對照0205.15±5.31218.35±8.69225.69±7.15232.39±5.16236.23±6.79 模型0202.39±6.02215.49±9.15219.42±7.65238.51±6.21246.15±5.15 青藤堿混懸液ig3.8208.59±6.23217.56±7.19227.83±8.61234.86±4.54241.37±3.39 青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射1.2201.32±5.72213.55±8.53225.45±6.39239.12±5.34249.43±5.79 Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射1.2209.54±4.95221.41±9.23232.72±6.47239.72±3.92247.78±6.24

表5 Sin-NSSPE對SD大鼠關(guān)節(jié)腫脹度的影響(, n = 5)

Table 5 Effect of Sin-NSSPE on joint swelling of SD rats(, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)關(guān)節(jié)腫脹度/% 1 d7 d14 d21 d28 d 對照01.59±1.202.14±1.141.86±1.392.35±1.552.08±1.99 模型01.83±1.6756.18±6.71**62.52±8.61**65.42±7.13**58.71±7.90** 青藤堿混懸液ig3.81.64±1.1652.57±7.75##46.59±8.34##48.16±9.25##42.55±6.06## 青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射1.22.15±1.3650.72±7.96##42.28±5.32##41.26±6.59##32.13±7.81## Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射1.22.61±1.1048.29±6.56##37.67±7.35##35.74±7.34##22.59±7.61##

與對照組比較：**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01；下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group; same as below tables

關(guān)節(jié)腫脹度＝(造模后每周足容積－初始足容積)/初始足容積

2.7.4 Sin-NSSPE對關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)（arthritis index，AI）評分的影響 根據(jù)參考文獻(xiàn)方法[13]，采用關(guān)節(jié)炎評分及計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（表6）對大鼠進(jìn)行AI評分（右后足）。結(jié)果如表7所示，與對照組相比，模型組AI評分顯著增高（＜0.01），表明模型成功；與模型組相比，各實(shí)驗(yàn)組大鼠AI評分呈現(xiàn)下降趨勢（＜0.05、0.01），其中Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組可更顯著降低AI評分（＜0.01），并抑制RA病情的進(jìn)一步發(fā)展。

2.7.5 Sin-NSSPE對大鼠脾指數(shù)的影響 ip水合氯醛（7%，5 mL/kg）麻醉大鼠，立即取出脾臟洗凈后，濾紙吸干，稱定脾的質(zhì)量，計(jì)算大鼠的脾指數(shù)，結(jié)果見表8。與對照組比較，造模會刺激大鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞大量增殖，導(dǎo)致脾質(zhì)量增加和脾損傷（＜0.01），而青藤堿混懸液ig組和青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射組可顯著改善脾組織損傷程度（＜0.01）。而Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組的脾損傷程度最輕，趨近于對照組，表明Sin-NSSPE治療作用良好且可顯著改善大鼠脾損傷。

表6 AI評分評價(jià)

Table 6 AI index evaluation

評分癥狀 0關(guān)節(jié)正常，無腫脹 1足趾關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)輕度腫脹 2踝關(guān)節(jié)至跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)輕度腫脹 3踝關(guān)節(jié)至跖關(guān)節(jié)或掌關(guān)節(jié)中度腫脹 4全足嚴(yán)重腫脹，關(guān)節(jié)僵直變形

表7 Sin-NSSPE對SD大鼠關(guān)節(jié)炎癥的影響(, n = 5)

Table 7 Effect of Sin-NSSPE on joint inflammation in SD rats(, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)AI評分 1 d7 d14 d21 d28 d 對照000000 模型002.45±0.57**2.85±0.26**3.45±0.56**3.65±0.43** 青藤堿混懸液ig3.802.35±0.71#2.57±0.42#2.52±0.32##2.32±0.25## 青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射1.202.31±0.44#2.16±0.33#2.19±0.65##1.87±0.37## Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射1.202.32±0.55#2.05±0.28##2.08±0.41##1.46±0.29##

表8 Sin-NSSPE對SD大鼠脾指數(shù)以及血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響(, n = 5)

Table 8 Effect of Sin-NSSPE on spleen index, and IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of SD rats(, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)脾指數(shù)/(mg·g?1)血清細(xì)胞因子水平/(ng·L?1) IL-1βIL-6TNF-α 對照02.13±0.6713.95±2.1614.52±3.6295.82±11.62 模型03.57±0.54**28.16±3.63**19.97±5.43**231.90±10.59** 青藤堿混懸液ig3.8 3.06±0.23##21.35±2.56##17.56±4.21##152.73±15.99## 青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射1.2 2.68±0.52##19.53±2.50##16.43±5.12##141.09±9.65## Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射1.2 2.46±0.38##16.36±3.32##15.19±3.55##113.67±14.83##

2.7.6 大鼠血清中指標(biāo)檢測 取大鼠血清，依照ELISA試劑盒說明書，檢測大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α表達(dá)水平，結(jié)果如表8所示。與對照組相比，模型組IL-1、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平顯著升高 （＜0.01），表明造模成功；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組中IL-1、IL-6和TNF-α表達(dá)水平明顯下降（＜0.01），而Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組大鼠血清中IL-1、IL-6和TNF-α含量更趨近于對照組。

2.7.7 踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)觀察 取各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織，在4%中性多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理變化。如圖7所示，對照組滑膜組織形態(tài)完整，未見滑膜組織水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，而模型組滑膜組織明顯增生，且滑膜細(xì)胞發(fā)生病理性改變，淋巴細(xì)胞發(fā)生浸潤并伴隨著血管翳的生成。與ig組和青藤堿關(guān)節(jié)腔注射組相比，Sin- NSSPE注射組能降低組織水腫及炎癥，抑制炎癥細(xì)胞的浸潤和血管翳的生成，與對照組水平相近。表明關(guān)節(jié)腔注射Sin-NSSPE對RA具有顯著療效，可使大鼠關(guān)節(jié)恢復(fù)正常的活動功能。

圖7 Sin-NSSPE治療28 d后SD大鼠關(guān)節(jié)滑膜的組織學(xué)分析

2.7.8 Western blotting檢測滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá) 加入RIPA裂解液后，將滑膜組織進(jìn)行研磨，冰上裂解30 min，10 000 r/min離心（離心半徑為6.3 cm）30 min提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白含量。蛋白變性后上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳（電壓80～110 V）2 h，轉(zhuǎn)膜（電流320 mA）3 h，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入TNF-α、IL-1β和IL-6一抗，4 ℃下培養(yǎng)12 h，TBST洗膜3次，加入二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）室溫下孵育2 h，TBST洗膜后在ECL顯影液中成像，Image J軟件獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

如圖8和表9所示，將內(nèi)參蛋白的表達(dá)量設(shè)為1，與模型組相比，Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組顯著降低IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)（＜0.05、0.01），表明關(guān)節(jié)腔注射Sin-NSSPE可通過下調(diào)標(biāo)志性蛋白的表達(dá)從而抑制RA。

圖8 滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和β-actin蛋白表達(dá)水平

表9 Sin-NSSPE對滑膜組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)分析(, n = 5)

Table 9 Analysis of expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in synovial tissue by Sin-NSSPE(, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)蛋白相對表達(dá)量 TNF-αIL-1βIL-6β-actin 對照00.78±0.020.63±0.040.65±0.011.00 模型01.31±0.03**1.14±0.01**1.22±0.03**1.00 青藤堿混懸液ig3.8 1.25±0.051.09±0.041.26±0.051.00 青藤堿混懸液關(guān)節(jié)腔注射1.2 1.08±0.02#0.87±0.01#1.18±0.041.00 Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射1.2 0.96±0.06##0.71±0.02##1.02±0.04#1.00

3 討論

從青藤中提取出的青藤堿具有多種藥理作用，它對RA、腫瘤、心血管系統(tǒng)疾病等均具有較好的療效[14-15]。但青藤堿口服給藥方式具有藥物利用度低、口服劑量大、不良反應(yīng)增加等缺點(diǎn)，這限制了其對局部RA的治療效果。而關(guān)節(jié)腔注射給藥是指在關(guān)節(jié)腔直接給藥，使藥物積蓄在關(guān)節(jié)內(nèi)，以恒定、接近恒定或需要的速度釋藥，在局部或者是全身維持藥物有效濃度從而產(chǎn)生治療效果，能避免口服給藥引起的血藥濃度峰谷和半衰期短等問題。本研究改變了傳統(tǒng)給藥方式，通過關(guān)節(jié)腔注射給藥的方式，使藥物迅速、高效的富集在病灶部位，從而提高了青藤堿的用藥安全性，達(dá)到減毒增效的治療目的。

本研究成功制備新的青藤堿劑型，Sin-NSSPE劑型使藥物利用度得到增加，究其原因，相比于青藤堿原料藥，藥物在Sin-NCs和Sin-NSSPE中以納米形態(tài)存在，更有利于藥物的吸收，從而增加了藥物利用度，同時(shí)相較于Sin-NCs，藥物溶解于Sin- NSSPE油相中形成藥物貯庫效應(yīng)，有更高的載藥量的同時(shí)緩慢釋放藥物，提高了藥物利用率。而相比于傳統(tǒng)口服給藥方式，關(guān)節(jié)注射給藥使藥物在關(guān)節(jié)腔內(nèi)緩慢釋放并增加駐留時(shí)間，獲得了藥物利用度和治療效果的提高。而粒徑是影響駐留時(shí)間的關(guān)鍵因素，同時(shí)研究表明，關(guān)節(jié)腔內(nèi)藥物粒徑小于250 nm，藥物會直接在關(guān)節(jié)腔內(nèi)逃逸，而過大的粒徑會在關(guān)節(jié)腔內(nèi)摩擦病理組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)腔內(nèi)炎癥進(jìn)一步惡化[16-17]，而粒徑在1～4 μm時(shí)會被關(guān)節(jié)內(nèi)的巨噬細(xì)胞所吞噬，藥物可通過巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的控制釋放達(dá)到持續(xù)釋放的目的。所以在巨噬細(xì)胞釋藥和貯庫效應(yīng)的雙重作用下，Sin-NSSPE可提高治療效果，因此，在劑型制備過程中，對油相比例、水相pH值和青藤堿質(zhì)量濃度進(jìn)行單因素考察，以期實(shí)現(xiàn)最小粒徑和藥物貯庫效應(yīng)，最佳工藝確定在水相pH值為4時(shí)粒徑最小且均勻，中鏈脂肪酸甘油三酯比例為0.5和青藤堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí)，乳液穩(wěn)定性和載藥量最好。

本研究通過SD大鼠進(jìn)行CFA造膜，評價(jià)和比較Sin-NSSPE注射組和其他給藥組的抗炎效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，與青藤堿的ig組和關(guān)節(jié)腔注射組相比，Sin-NSSPE關(guān)節(jié)腔注射組藥效指標(biāo)存在顯著性差異，Sin-NSSPE注射組可顯著降低大鼠關(guān)節(jié)腫脹度和AI水平，并改善脾組織損傷程度，顯著性下調(diào)大鼠滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表達(dá)，同時(shí)有效緩解大鼠關(guān)節(jié)的組織水腫、關(guān)節(jié)炎癥和滑膜組織增生，控制了新血管的生成和炎癥細(xì)胞的浸潤，表明關(guān)節(jié)腔注射Sin-NSSPE可有效改善RA的病癥，提高治療效果，但對于注射Sin-NSSPE的安全性和體內(nèi)藥物代謝仍需進(jìn)一步的研究。

Sin-NSSPE的制備驗(yàn)證新劑型的可行性，推動青藤堿新劑型的發(fā)展，為臨床用藥提供更多選擇，與其他納米乳劑相比，Pickering乳液劑避免了異種顆粒作為穩(wěn)定劑從而降低了不良反應(yīng)，同時(shí)在關(guān)節(jié)腔內(nèi)形成藥物貯庫效應(yīng)，緩慢釋放藥物以提高了藥物療效，因此對于青藤堿來說，NSSPE是一種潛在的給藥系統(tǒng)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and pharmacodynamics of sinomenine nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions injected into articular cavity

ZHANG Jun-hao1, LIANG Xiao1, BAI Hao-tian1, LI Ya-lan1, SUN Shu-hui1, ZHANG Qian-qian1, YANG Jing2, WANG Rui1, 3

1. School of Pharmacy, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China 2. College of Basic Medicine, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China 3. Key Laboratory of Basic and Applied Research of Northern Medicine, Ministry of Education, Harbin 150040, China

Sinomenine nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions (Sin-NSSPE) injection was prepared for joint cavity, and a drug depot was formed in the joint cavity, which was slowly released to improve the bioavailability and reduce the toxic and side effects of the drug. Sin-NSSPE injection was prepared with sinomenine nanocrystalline (Sin-NCs) itself as a stabilizer, and the therapeutic effect on rheumatoid arthritis (RA) was investigated by pharmacodynamic experiments.Sin-NSSPE was optimized by factors such as drug concentration, oil-water ratio and pH of water phase, and RA model was established in SD rats with Freund’s adjuvant arthritis method. Toe swelling, arthritis index, spleen index, histopathological examination and Western blotting method were used as indicators for detection.The results showed that Pickering emulsion had uniform particle size and good drug loading, the average particle size of Sin-NCs was (121.49 ± 18.26) nm, the particle size of Sin-NSSPE was (1 159.60 ± 160.15) nm, and the drug loading was 4.92 mg/mL. Pharmacodynamics experiments showed that, compared with the intragastric administration of sinomenine, Sin-NSSSPE joint cavity injection group can effectively reduce joint swelling and inflammation index, improve synovial tissue lesions and inhibit joint inflammation. Both the sinomenine intra-articular injection group and the Sin- NSSPE intra-articular injection group could significantly improve the toe swelling of rats, reduce the expression of inflammatory factors and relieve the RA condition. However, the experimental results showed that Sin-NSSPE had a better therapeutic effect, and the stability of the dosage form was improved, which formed a drug reservoir, making the drug effect more stable.The above results indicated that the prepared Sin-NSSPE had stable properties, and intra-articular injection of Sin-NSSPE had a good therapeutic effect on RA in rats.

sinomenine; submicron Pickering nanoemulsion; joint cavity injection; rheumatoid arthritis; reservoir effect; macrophage drug release

R283.6

A

0253 - 2670(2022)20 - 6412 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.013

2022-05-13

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074271）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81603418）；黑龍江省屬本科高校中央支持地方高校改革發(fā)展項(xiàng)目（2020YQ05）

張?bào)揸唬T士研究生，研究方向?yàn)樾滤幖靶聞┬脱芯俊el: 17745127916 E-mail: 1175389015@qq.com

王 銳，教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)樾滤幖靶聞┬脱芯俊el: (0451)87266893 E-mail: wrdx@sina.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]