基于HPLC-Q-TOF-MS及化學(xué)模式識別方法對陳皮的化學(xué)成分快速鑒別及產(chǎn)地判別研究

黃 芳，周 熙，羅輝泰，謝淑桐，張春華，謝夢婷，鄧 欣，吳惠勤

基于HPLC-Q-TOF-MS及化學(xué)模式識別方法對陳皮的化學(xué)成分快速鑒別及產(chǎn)地判別研究

黃 芳，周 熙，羅輝泰，謝淑桐，張春華，謝夢婷，鄧 欣，吳惠勤*

廣東省科學(xué)院測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學(xué)測量與應(yīng)急檢測技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070

研究不同產(chǎn)地陳皮化學(xué)成分的差異，結(jié)合化學(xué)模式識別方法對陳皮的產(chǎn)地進(jìn)行判別分析。采用Agilent SB-C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm）色譜柱分離，以乙腈-0.1%甲酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧離子源，在正離子模式下采集數(shù)據(jù)。對色譜圖中各色譜峰進(jìn)行精確質(zhì)量數(shù)識別，利用二級質(zhì)譜裂解規(guī)律、PCDL數(shù)據(jù)庫及對照品對化學(xué)成分進(jìn)行定性分析。結(jié)合主成分分析、聚類分析、判別分析等多元統(tǒng)計(jì)方法分析了新會陳皮與其他不同產(chǎn)地陳皮的差異成分，并利用這些分析方法鑒別了未知產(chǎn)地陳皮的來源。從不同產(chǎn)地陳皮中鑒定出了29個共有化學(xué)成分，主要為多甲氧基黃酮及黃酮苷類化合物。建立9個差異化學(xué)成分的判別模型，實(shí)現(xiàn)了新會陳皮的準(zhǔn)確判別，準(zhǔn)確率達(dá)94.4%?？勺鳛殛惼ぎa(chǎn)地鑒別和質(zhì)量控制的有效方法，為道地藥材新會陳皮的判別提供參考。

陳皮；高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）；化學(xué)模式識別方法；主成分分析；產(chǎn)地鑒別；甜橙黃酮；辛弗林；羥基-四甲氧基黃酮；柚皮苷；枸橘苷；檸檬苦素；橘皮素；六甲氧基黃酮；羥基六甲氧基黃酮

陳皮為蕓香科植物橘Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。陳皮功效考證是以橘柚之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，又名橘皮、紅皮、柑皮等。陳皮在廣西、福建、貴州、湖南、江西、四川、重慶、云南都有生產(chǎn)[2]。有廣泛的臨床用途，具有調(diào)節(jié)胃腸平滑肌運(yùn)動，控制消化液分泌、利膽保肝、祛痰平喘、松弛子宮平滑肌等多種藥理作用[3]，在《中國藥典》2020年版收載的1606個成方藥劑中，含陳皮的就有197個，可見其應(yīng)用的重要和廣泛。

陳皮藥材中以“廣陳皮”的質(zhì)量為優(yōu)，“廣陳皮”中又以新會陳皮為道地藥材[4]，在臨床應(yīng)用與藥效功能方面與其他陳皮有顯著差別[5]，其市場價格也遠(yuǎn)高于一般陳皮。但是產(chǎn)量有限，容易造成市場供不應(yīng)求，因此有不少商家利用陳皮在外觀上的相似性，以次充好、以假亂真，嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的利益。目前，對于陳皮產(chǎn)地的鑒別主要還是經(jīng)驗(yàn)鑒別，是靠經(jīng)驗(yàn)豐富的工作人員根據(jù)顏色、形狀、氣味等差異對不同陳皮進(jìn)行鑒別，容易受主觀條件及客觀環(huán)境因素的影響，準(zhǔn)確度很難把控?！吨袊幍洹?020年版把陳皮藥材分為“陳皮”和“廣陳皮”，陳皮以橙皮苷作為質(zhì)量評價指標(biāo)，廣陳皮以橙皮苷、川陳皮素和橘皮素3個成分作為質(zhì)量評價指標(biāo)，但其他產(chǎn)地的陳皮中川陳皮素和橘皮素的含量也不低[2]，利用單一成分顯然不能準(zhǔn)確評價藥材質(zhì)量。

中藥產(chǎn)地鑒別是道地藥材質(zhì)量研究的重要方向。多元統(tǒng)計(jì)分析方法的應(yīng)用以及主成分分析與偏最小二乘法-判別分析的化學(xué)模式識別方法已被廣泛應(yīng)用于不同產(chǎn)地中藥材特征化學(xué)成分的分析[6]。結(jié)合判別分析方法可對未知產(chǎn)地中藥材進(jìn)行產(chǎn)地判別[7-8]。胡繼藤等[9]采用GC-MS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法鑒別不同產(chǎn)地不同種源陳皮。然而，陳皮的主要化學(xué)成分為黃酮、檸檬苦素及生物堿等難揮發(fā)性化合物[10]。童超英等[11]采用在線提取-高效液相色譜-二極管陣列-四極桿飛行時間質(zhì)譜法提取和分離鑒定陳皮中24種黃酮類化合物。張珂等[12]用UHPLC-IT-TOF-MS從陳皮提取物中初步鑒定了61個化學(xué)成分。因此，利用液相色譜-高分辨質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法能更好地實(shí)現(xiàn)陳皮產(chǎn)地的鑒別。

本研究采用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法鑒定了新會、廣西和湖南不同產(chǎn)地陳皮中的難揮發(fā)性化學(xué)成分，并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行分析，找出新會陳皮與其他陳皮之間的差異成分。針對這些成分建立模型，對未知來源陳皮產(chǎn)地進(jìn)行判別分析，推測其產(chǎn)地來源的真實(shí)性。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法可用于判定陳皮的摻假現(xiàn)象，有效的保證陳皮產(chǎn)地的真實(shí)性。同時，為陳皮質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供了支持。

1 材料與儀器

1.1 材料

所收集的36批次原產(chǎn)地藥材中，產(chǎn)自新會的標(biāo)記為XH1～12（編號S1～S12）；產(chǎn)自廣西的標(biāo)識為GX1～12（編號S13～S24）；產(chǎn)自湖南的標(biāo)識為HN1～12（編號S25～S36）。另外18批來自民間收藏的宣稱新會陳皮。以“XC”標(biāo)記為XC1～18（編號S37～S54）。經(jīng)廣東藥科大學(xué)肖雪教授鑒定為蕓香科植物橘Blanco及其栽培變種的干燥成熟果皮。

橙皮苷（批號110721-201818，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.2%）、新橙皮苷（批號111829-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.5%）、檸檬苦素（批號111699-200501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.5%）、川陳皮素（批號110878-201602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.7%）和橘皮素（批號110722-201106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%），柚皮苷（批號110722-201105，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%），均購自中國食品藥品檢定研究院。辛弗林（批號JS90035，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），購自上海金穗生物科技有限公司。水為二次蒸餾水，甲醇、乙醇、乙腈為色譜純試劑（德國Merck公司），甲酸和乙酸銨（阿拉丁試劑）。

1.2 儀器

Agilent1290 HPLC-6540-Q-TOF-MS配有雙噴射流電噴霧離子源（美國安捷倫公司）配置Aglient自帶數(shù)據(jù)處理軟件；KQ2200型臺式機(jī)械超聲波清洗器（東莞市超聲波設(shè)備有限公司），賽多利斯TP-114電子天平（美國Sartorious公司）。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

陳皮樣品經(jīng)粉碎，過50目篩，取樣1.0 g（精確至1.0 mg），置于25 mL具塞試管中，加入70%甲醇溶液25 mL，中間振搖3次，超聲處理40 min，取出放冷至室溫，定容至25 mL，過0.22 μm濾膜，待測。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱辛弗林、新橙皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、柚皮苷、川陳皮素和桔皮素共7種對照品各5.0 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，分別得到對照品儲備液；用70%的甲醇溶液稀釋得到10 mg/L的混合對照品溶液。

2.3 液相色譜條件

色譜柱：Aglient Poroshell 120 SB C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm），流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，100% B；5～12 min，0～25% A；12～20 min，25%～35% A；20～30 min，35%～45% A；30～40 min，45%～55% A；40～45 min：55%～65% A；45～50 min，65%～100% A；50～52 min，100% A；53～60 min，100% B。體積流量0.3 mL/min；柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

2.4 質(zhì)譜條件

離子源為Agilent雙噴Jet Stream源（Dual Jet Stream ESI），正離子模式采集，干燥氣（N2）溫度350 ℃，霧化氣（N2）壓力276 kPa，干燥氣（N2）溫度325 ℃，體積流量8 L/min，鞘氣溫度350 ℃，體積流量11 L/min，毛細(xì)管電壓3000 V，毛細(xì)管出口電壓（Fragmentor）110 V，錐孔電壓（skimmer）65 V，八極桿電壓750 V，采集模式為Auto MS/MS，掃描范圍/70～1100；參比離子正離子為/121.050 9、922.009 8。

2.5 數(shù)據(jù)處理

樣品經(jīng)液相色譜-高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜測定，正離子自動二級模式采集數(shù)據(jù)，得到一級及自動二級總離子流色譜圖，根據(jù)圖中每個峰的精確質(zhì)量數(shù)及同位素分布推測分子式，結(jié)合二級質(zhì)譜及文獻(xiàn)資料鑒定出化學(xué)成分，并采用對照品進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）、聚類分析及判別分析，研究不同產(chǎn)地陳皮的分類及判別方法。

3 結(jié)果與分析

3.1 陳皮化學(xué)成分的鑒定

按“2.3”“2.4”項(xiàng)中的方法，分別在正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示在負(fù)離子模式得到的總離子流圖色譜圖峰數(shù)目很少，正離子模式下得到總離子色譜圖峰數(shù)目多且豐度高，各峰分離理想。可見正離子模式得到的數(shù)據(jù)更有代表性，因此重點(diǎn)研究正離子模式下色譜峰的化學(xué)成分信息。將總離子流色譜圖中各個峰（圖1），推測其可能的分子式。再根據(jù)其二級質(zhì)譜圖，研究其可能的質(zhì)譜裂解規(guī)律，結(jié)合參考文獻(xiàn)及Chemspider、PubChem等數(shù)據(jù)庫，推斷化合物的可能結(jié)構(gòu)式，鑒定其化學(xué)成分。最終鑒定出29個主要化學(xué)成分，結(jié)果見表1。

圖1 新會陳皮的HPLC-Q-TOF-MS總離子流色譜圖

從鑒定出的化學(xué)成分中發(fā)現(xiàn)，陳皮的主要成分為多甲氧基黃酮類，其主要裂解過程為其母核脫去甲氧基或中性丟失水分子的過程，以下20號峰為例，準(zhǔn)分子離子峰[M＋H]+的精確質(zhì)量數(shù)為403.138 5，推斷其分子式為C21H22O8，二級碎片離子（圖2-A），主要有373.091 8、388.115 0、355.080 9、327.085 8等，質(zhì)譜裂解規(guī)律為準(zhǔn)分子離子峰403.138 5中性丟失1個甲氧基，形成373.091 8[M＋H－OCH3]+碎片離子，再丟失1分子水，形成355.091 8 [M＋H－OCH3－H2O]+碎片離子，該離子繼續(xù)失去2個甲基，得到327.085 8 [M＋H－OCH3－H2O－2CH3]+碎片離子；準(zhǔn)分子離子峰403.138 5失去一個甲基，形成388.115 3 [M＋H－CH3]+的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)報道，推斷20號峰為川陳皮素或其同分異構(gòu)體。通過對照品驗(yàn)證為川陳皮素。其質(zhì)譜裂解機(jī)制如圖2-B所示，從總離子流圖中還可見另外2個15號和25號峰的精確質(zhì)量數(shù)與此峰相同，其相同碎裂電壓下的二級碎片離子相同豐度不同，可推測為川陳皮素的同分異構(gòu)體，均屬于六甲氧基黃酮。

表1 不同產(chǎn)地陳皮化學(xué)成分及相對含量

Table 1 Constituents and relative contents in Citri Reticulatae Pericarpium from different habitats

序號tR/min[M+H]+ (m/z)誤差（×10-6）二級碎片離子 (m/z)分子式化合物名稱相對含量/% 實(shí)驗(yàn)值理論值新會廣西湖南 13.06168.101 3168.101 9?3.57135.068 4, 107.049 5, 91.054 8, 77.039 1C9H13NO2辛弗林2.642.782.70 29.49268.103 7268.104 0?1.12135.0597 , 119.033 3, 94.038 1C10H13N5O4腺苷1.450.220.29 311.23359.111 2359.112 5?1.39329.065 8, 301.070 0, 163.074 7, 138.997 5C19H18O7羥基-四甲氧基黃酮2.791.950.71 413.51625.175 6625.176 3?1.12571.146 5, 487.121 3, 409.180 9C28H32O16香葉木素-6,8-二-C-葡萄糖苷[金圣草(黃)素-6,8-二-C-葡萄糖苷]1.861.751.67 514.18611.196 1611.197 0?1.47303.085 7, 449.143 1, 345.096 1C28H34O15新橙皮苷0.260.320.24 615.71581.191 8581.186 5 9.12273.075 6, 419.133 4, 435.128 3, 401.122 2, 129.054 1, 315.085 9, 545.164 6C27H32O14柚皮苷0.391.261.24 716.39611.196 1611.197 0?1.47303.085 7, 449.143 1, 345.096 1C28H34O15橙皮苷2.252.812.65 819.87595.201 5595.202 1?1.01287.091 1, 433.148 3, 449.143 2, 415.137 3, 129.054 8C28H34O14枸橘苷0.331.731.21 922.23725.229 5725.228 7 1.10419.133 1, 389.085 5, 349.890 3C33H40O18柚皮黃素-3-Ｏ-(3-羥基-3-甲基戊二酸)-葡萄糖苷0.283.21 2.34 1023.15359.111 8359.112 5?1.95329.065 8, 301.070 0, 163.074 7, 138.997 5C19H18O7羥基-四甲氧基黃酮0.270.21 0.35 1124.96375.143 4375.143 8?1.07191.069 9, 357.131 9, 211.059 9, 150.031 3C20H22O75-羥基-2-(3-羥基-4,5-二甲氧基苯基)-7,8-二甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮0.230.22 0.23 1225.49389.122 3389.123 1?2.06374.100 5, 359.076 7, 341.065 7, 374.098 9C20H20O8羥基-五甲氧基黃酮0.390.23 0.31 1326.23359.111 6359.112 5?2.51329.066 7, 301.068 5, 255.063 8, 153.018 0C19H18O7羥基-四甲氧基黃酮0.290.26 0.22 1426.70373.128 2373.128 2 0.00343.081 1, 358.103 7, 315.085 3, 181.012 9C20H20O7異橙黃酮7.345.46 5.88 1527.77403.138 2403.138 7?1.24388.115 9, 373.093 2, 342.110 8, 327.088 4, 165.053 7C21H22O8六甲氧基黃酮0.281.03 0.97 1629.24373.128 7373.128 2 1.34373.128 1, 343.080 7, 312.098 6, 329.101 3, 357.096 4C20H20O7甜橙黃酮8.529.65 7.88 1729.91375.142 8375.107 4?2.67359.065 2, 211.059 7, 168.041 2, 150.031 4C20H22O75-羥基-2-(3-羥基-4,5-二甲氧基苯基)-7,8-二甲氧基- 4H-1-苯并吡喃-4-酮（異構(gòu)體）0.510.23 0.67 1830.37471.200 2471.201 3?2.33425.194 0, 367.189 2, 161.059 1C26H30O8檸檬苦素 0.280.24 0.36 1930.38343.117 8343.117 6 0.58313.071 5, 285.076 2, 181.013 6, 153.018 6, 133.065 0C19H18O6四甲氧基黃酮 7.324.60 6.15 2032.05403.139 2403.138 7 1.24388.114 2, 373.093 1, 355.081 3, 327.088 5, 211.023 4C21H22O8川陳皮素23.2021.0721.06 2133.12343.117 1343.117 6?1.46327.086 5, 299.091 0, 282.088 4C19H18O6四甲氧基黃酮 4.64 6.14 5.14 2233.86433.149 2433.149 3?0.23403.101 1, 385.090 2, 418.124 3C22H24O9七甲氧基黃酮 6.3513.5712.45 2335.33419.133 4419.133 7?0.72404.110 0, 389.087 2, 361.091 2, 346.068 0, 328.057 0, 165.054 4C21H22O9羥基-六甲氧基黃酮（梔子黃素A） 0.43 2.92 1.94 2435.94373.128 5373.128 2 0.80358.104 7, 344.084 8, 343.081 2, 325.069 8, 297.074 9C20H20O7橘皮素（桔皮素）五甲氧基黃酮23.3014.2718.53 2538.21403.138 3403.138 7?0.99373.094 1, 330.074 4, 211.024 3, 183.029 1C21H22O8六甲氧基黃酮 0.29 0.73 0.83 2638.68389.120 3389.123 1?7.20359.077 5, 341.066 1, 197.008 3, 169.013 2C20H20O8羥基-五甲氧基黃酮 3.12 0.90 2.33 2740.35329.101 3329.102 0?2.13314.078 3, 268.072 5, 299.054 7, 136.015 1C18H16O6羥基-三甲氧基黃酮 0.41 0.26 0.31 2840.96419.133 4419.133 7?0.72404.110 0, 389.087 2, 371.075 2, 343.084 2, 311.054 3, 151.074 9C21H22O9羥基-六甲氧基黃酮（梔子黃素A或異構(gòu)體） 0.25 1.69 1.09 2942.63359.111 7359.112 5?2.23329.066 2, 286.046 5, 211.023 3, 183.029 4C19H18O7羥基-四甲氧基黃酮 0.32 0.32 0.25

圖3中9號峰準(zhǔn)分子離子峰[M＋H]+的精確質(zhì)量數(shù)為725.228 7，推斷其分子式為C33H40O18，二級碎片離子，主要有419.133 1、389.085 5、349.890 3，質(zhì)譜裂解規(guī)律為準(zhǔn)分子離子峰725.228 7失去一個葡萄糖基和3-羥基-3-甲基戊二酸基團(tuán)，形成419.133 1[M＋H－162－146]+的碎片離子，然后再進(jìn)一步丟失2個甲基，形成389.085 5[M+H－162－146－30.0467]+的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)信息可推測該化合物為柚皮黃素-3--(3-羥基-3-甲基戊二酸)-葡萄糖苷。

陳皮大部分化學(xué)成分為多甲氧基黃酮類，其相對含量占95.8%（表1）。研究表明，多甲氧基黃酮具有多種生物活性，如抗炎、抗癌、抗動脈粥樣硬化、調(diào)血脂、降血糖、保護(hù)記憶等[13]，羥基化的多甲氧基黃酮具有比多甲氧基黃酮更好的溶解性和滲透性[14]。黃酮苷類化合物是陳皮中另一種主要的黃酮類化合物，如橙皮苷、新橙皮苷和柚皮苷等。其二級質(zhì)譜中的碎片離子多體現(xiàn)為[M＋H－162]+和[M＋H－146]+，或[M＋H－162－146]+，為分子離子分別脫去葡萄糖基或鼠李糖基的過程。目前，《中國藥典》中陳皮以橙皮苷作為質(zhì)量評價指標(biāo)，廣陳皮以橙皮苷、川陳皮素和桔皮素3個成分作為質(zhì)量評價指標(biāo)。然而，陳皮藥效為其所有多甲氧基黃酮及黃酮苷共同發(fā)揮作用[15]，僅以1～3個化合物作為評價指標(biāo)不能真正反映藥材質(zhì)量。需要制定多個多甲氧基黃酮及黃酮苷共同定量分析的質(zhì)量評價方法。

圖2 20號峰(川陳皮素) 的二級質(zhì)譜圖(A) 及裂解機(jī)制圖(B)

圖3 9號峰的二級質(zhì)譜(A)及裂解機(jī)制圖(B)

3.2 不同產(chǎn)地陳皮差異成分分析

3.2.1 PCA PCA是一種無監(jiān)督的降維數(shù)據(jù)處理方法，能夠真實(shí)的反映原始數(shù)據(jù)的分組情況。本研究采用SIMCA 14.1軟件，以采集的36批次陳皮樣品數(shù)據(jù)為數(shù)據(jù)矩陣，對3個不同產(chǎn)地的陳皮數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖4-A。質(zhì)控樣本較集中，表明采集方法穩(wěn)定可靠；新會陳皮分布集中，聚為一類，與湖南、廣西的陳皮區(qū)分明顯；湖南陳皮和廣西陳皮聚為一類，但湖南陳皮分布較集中，差異性較?。粡V西陳皮分散大，差異大。

3.2.2 OPLS-DA OPLS-DA表明新會陳皮可與湖南陳皮和廣西陳皮明顯區(qū)分，存在組間差異，為更好地觀察組間差異，本研究采用有監(jiān)督的OPLS-DA分析方法，篩選新會陳皮與湖南陳皮和廣西陳皮的差異性化學(xué)成分。由OPLS-DA結(jié)果可知，新會陳皮可明顯區(qū)分其他2產(chǎn)區(qū)的陳皮（圖4-B），且2（cum）＝0.821，2（cum）＝0.984，2（cum）＝0.963，表明模型的解釋度和預(yù)測度良好。采用變量重要性投影值（VIP）大于1，且coefficients plot中置信區(qū)間不過原點(diǎn)，并結(jié)合檢驗(yàn)（＜0.05）結(jié)果，篩選新會陳皮與其他2個產(chǎn)地陳皮的化學(xué)成分。從中篩選出18個成分，見圖4-C所示，并鑒定了其中9個差異成分，包括甜橙黃酮、辛弗林、羥基-四甲氧基黃酮、柚皮苷、枸橘苷、檸檬苦素、橘皮素、六甲氧基黃酮、羥基六甲氧基黃酮。這些成分在區(qū)分不同產(chǎn)地陳皮藥材間起到重要作用，可作為陳皮道地藥材的指標(biāo)成分（圖4-B）。

A-PCA score plot B-OPLS-DA score plot C-VIP value D-S-plot chart

3.2.3 聚類分析 以相對含量較高的川陳皮素為參照，各差異成分的色譜峰相對于參照峰的相對峰面積為變量，組成36×12階原始數(shù)據(jù)矩陣。采用IBM SPSS 20.0軟件進(jìn)行聚類分析，聚類方法采用組間連接法，測區(qū)間為Euclidean距離，數(shù)據(jù)無標(biāo)準(zhǔn)化，得到樣品平均鏈接（組間）的譜系圖（圖5）。結(jié)果表明，在歐式距離為10時，36批藥材樣品可聚為3類，XH1～XH12聚為一類，GX3、GX4和GX6 聚為一類，HN1～HN12、GX1、GX2、GX5、GX7～GX12聚為一類，可見采用聚類分析新會陳皮分類效果顯著，而廣西和湖南的分類不明顯。這與PCA分析和OPLS-DA分析結(jié)果一致。

3.2.4 產(chǎn)地判別分析 以川陳皮素為參照，各差異峰相對于參照峰的相對峰面積為變量，采用IBM SPSS 20.0軟件對上述原始數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行判別分析。選擇Fisher、未標(biāo)準(zhǔn)化為函數(shù)系數(shù)參數(shù)，先驗(yàn)概率選擇根據(jù)組大小計(jì)算。36批陳皮樣品典型判別函數(shù)1和典型判別函數(shù)2的得分作散點(diǎn)圖如圖6所示，圖中顯示湖南、廣西和廣東新會陳皮明顯聚為3類。其中，新會陳皮與廣西和湖南陳皮區(qū)別明顯，與前面結(jié)果一致。采用判別分析驗(yàn)證3個產(chǎn)地判別的準(zhǔn)確性，初始驗(yàn)證中36個陳皮樣品全部被正確歸類，總體正確率為100%；交叉驗(yàn)證中2個廣西陳皮樣品被歸為新會，其他34個樣品按產(chǎn)地被正確歸類，交叉驗(yàn)證總體正確率為94.4%，方法的準(zhǔn)確度較好。

圖5 不同產(chǎn)地陳皮樣品聚類分析結(jié)果

3.2.5 陳皮產(chǎn)地鑒別方法適用性驗(yàn)證 采用“3.2.4”項(xiàng)建立的判別函數(shù)，對18個來自民間收藏的新會陳皮樣品進(jìn)行獨(dú)立樣本測試，結(jié)果如表2所示，18個樣品中17個判定為新會陳皮，準(zhǔn)確度為94.4%，其中一個判定為湖南陳皮。

圖6 不同產(chǎn)地陳皮樣品判別分析散點(diǎn)圖

表2 不同產(chǎn)地陳皮樣品判別分析預(yù)測結(jié)果

Table 2 Discriminant analysis results of Citri Reticulatae Pericarpium from different habitats

分類產(chǎn)地樣品個數(shù)準(zhǔn)確預(yù)測個數(shù)準(zhǔn)確度/% 訓(xùn)練集新會121294.4 廣西1210 湖南1212 獨(dú)立測試集新會181794.4

4 討論

本研究考察了不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇和純甲醇）和不同超聲提取時間（30、40、50 min）對陳皮提取成分的影響，結(jié)果顯示，70%甲醇提取液總離子流圖的色譜峰較多，基線噪音較低，不同超聲時間無明顯差異，因此選擇70%甲醇超聲提取40 min做為提取方法。

為了分離陳皮中所含的多種黃酮類物質(zhì)及黃酮類同分異構(gòu)體，研究對比了3種不同色譜柱（Agilent Poroshell 120 EC-C18（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；Agilent Poroshell 120 PFP （100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；Aglient Poroshell 120 SB C18（150 mm×3.0 mm，2.7 μm），結(jié)果顯示采用Aglient Poroshell 120 SB C18色譜柱分離理想，更有利于多羥基化合物的分離。

本研究采用HPLC-Q-TOF-MS分析了不同產(chǎn)地陳皮中的難揮發(fā)性化學(xué)成分，從中鑒定出了29個主要化學(xué)成分，主要包括多甲氧基黃酮及黃酮苷2類化合物。PCA、OPLS-DA分析與聚類分析結(jié)果表明，廣西與湖南陳皮化學(xué)成分差異不明顯，但與新會陳皮存在顯著差異。甜橙黃酮、辛弗林、羥基-四甲氧基黃酮、柚皮苷、枸橘苷、檸檬苦素、橘皮素、六甲氧基黃酮、羥基六甲氧基黃酮等成分可作為新會陳皮的道地藥材與其他產(chǎn)地的差異標(biāo)志性成分。利用差異成分建立的新會陳皮產(chǎn)地鑒別模型可準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)新會陳皮的鑒別，準(zhǔn)確度大于94.4%。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Chemical constituents and habitats identification ofby HPLC-Q-TOF-MS and chemical pattern recognition

HUANG Fang, ZHOU Xi, LUO Hui-tai, XIE Shu-tong, ZHANG Chun-hua, XIE Meng-ting, DENG Xin, WU Hui-qin

Guangdong Engineering Research Center for Quality and Safety of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Key Laboratory of Chemical Measurement and Emergency Test Technology, Institute of Analysis, Guangdong Academy of Sciences (China National Analytical Center, Guangzhou), Guangzhou 510070, China

To analyze the differential chemical constituents in Chenpi () from different habitats. Then, habitats ofwere discriminated by chemical pattern recognition methods.The chromatographic separation was performed on an Agilent SB-C18column(150 mm×3.0 mm, 2.7 μm) with the mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid for gradient elution. The chromatographic effluent was detected and analyzed by UPLC-Q-TOF/MS in positive modes. Constituents were identified by PCDL database, fragmentation regularities, and comparing to standard samples. Then, Habitats difference analysis was carried out by principal component analysis, hierarchical cluster analysis and discriminant analysis.A total of 29 constituents were identified, mainly included polymethoxyflavones and flavonoid glycoside.from XinHui was accurate discriminated by the created discriminant model with an accuracy of 94.4%.This study provide an effectively method for the habitats distinctions of, which is benefit to the identification of geo-authentic herbs for XinHui.

HPLC-Q-TOF-MS; chemical pattern recognition; principal component analysis; habitats identification;sinensetin; synephrine; hydroxy-tetramethoxyflavone; naringin; poncirin; limonin; tangeretin; hexamethoxyflavone; hydroxy-hexamethoxyflavone

R286.2

A

0253 - 2670(2022)20 - 6361 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.007

2022-03-09

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202102020530）

黃 芳 (1975—)，女，碩士，主要從事分析化學(xué)及藥物分析研究工作。Tel: (020)88321850 E-mail: 13642741616@139.com

吳惠勤 (1961—)，男，研究員，研究方向?yàn)橛袡C(jī)質(zhì)譜分析及應(yīng)用。Tel: (020)87686536 E-mail: 13802959756@139.com

[責(zé)任編輯 時圣明]