細(xì)菌對(duì)消毒劑耐藥的機(jī)制及交叉耐藥研究進(jìn)展

毛鑫亮 許兆軍 朱夢(mèng)雅

1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬寧波市第二醫(yī)院，浙江寧波 315000；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院，浙江寧波 315000

抗生素的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用，使得很多以往被認(rèn)為是致命性的感染相關(guān)性疾病得到了治愈，從而提高了人類的預(yù)期壽命。如今，由于醫(yī)療衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)等多個(gè)領(lǐng)域?qū)咕幬锏臑E用和不合理使用，導(dǎo)致多種耐藥菌出現(xiàn)和播散，導(dǎo)致了感染相關(guān)性疾病的發(fā)病率和死亡率再次增加。然而，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象并不局限于抗菌藥物。從Chaplin首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道細(xì)菌存在消毒劑耐藥性，到Qac、SMR 等消毒劑耐藥基因的證實(shí)與發(fā)現(xiàn)，越來越多的研究者開始認(rèn)識(shí)到，與抗生素耐藥一樣，消毒劑對(duì)細(xì)菌存在耐藥現(xiàn)象。這種耐藥現(xiàn)象在雙胍類、醛類、季銨鹽類、酚類、碘類、醇類等多種消毒劑上均有所發(fā)現(xiàn)。本文基于國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者的相關(guān)研究報(bào)道，歸納闡述消毒劑導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的機(jī)制及交叉耐藥現(xiàn)象，為進(jìn)一步的科學(xué)研究提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 消毒劑耐藥的定義

目前存在多個(gè)關(guān)于細(xì)菌對(duì)消毒劑耐藥的描述與定義。普遍認(rèn)為當(dāng)常規(guī)濃度的消毒劑對(duì)細(xì)菌失去了本應(yīng)具有的殺菌、抑菌能力時(shí)，即認(rèn)為消毒劑產(chǎn)生了耐藥。亦有研究提出通過與標(biāo)準(zhǔn)菌株比較最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）或最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）來判斷細(xì)菌是否對(duì)消毒劑存在耐藥性。

2 消毒劑耐藥的判定與檢測(cè)方法

抗生素的耐藥性可通過采用MIC 聯(lián)合輔助紙片擴(kuò)散法進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行耐藥分析。對(duì)于消毒劑，目前國(guó)內(nèi)外尚無統(tǒng)一的耐藥定義標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)細(xì)菌對(duì)消毒劑敏感性的監(jiān)測(cè)也無一致性評(píng)價(jià)方法。國(guó)內(nèi)學(xué)者多采用MIC 或MBC 對(duì)比法來判斷耐藥性。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，國(guó)外學(xué)者多采用基因檢測(cè)來判斷細(xì)菌對(duì)消毒劑的耐藥性，目前發(fā)現(xiàn)的消毒劑抗性基因很少，如Qac、SMR 基因序列。國(guó)內(nèi)多通過采用PCR 擴(kuò)增檢測(cè)體系對(duì)國(guó)外報(bào)道的消毒劑耐藥基因進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)來進(jìn)行耐藥分析。

3 消毒劑耐藥產(chǎn)生的原因和機(jī)制

3.1 耐藥產(chǎn)生的原因

醫(yī)院工作中需要廣泛使用消毒和滅菌等手段來預(yù)防和控制醫(yī)院感染。與抗生素濫用導(dǎo)致的耐藥一樣，消毒劑也發(fā)生了類似的耐藥現(xiàn)象。消毒方法不規(guī)范、有效濃度偏低或過高、作用時(shí)間不夠、不注意使用有效期、長(zhǎng)期使用單一消毒劑等問題，均可導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)消毒劑產(chǎn)生耐藥。

3.2 耐藥機(jī)制

消毒劑與抗生素均具有殺滅或抑制微生物的作用，在作用機(jī)制和耐藥機(jī)制上存在相似性。目前細(xì)菌對(duì)消毒劑耐藥的機(jī)制可分為固有耐藥（包括生物膜、細(xì)菌外部細(xì)胞層、主動(dòng)外排系統(tǒng)、藥物降解酶等）、誘導(dǎo)性耐藥（包括生理適應(yīng)、基因突變等）和獲得性耐藥（包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等）。通過以上一系列機(jī)制，消毒劑或被膜阻攔在外，或被酶滅活、修飾或排出，或細(xì)菌激活自身DNA 損傷誘導(dǎo)反應(yīng)來修復(fù)和適應(yīng)消毒劑的作用。

3.2.1 固有耐藥 ①生物膜：是微生物及其分泌物積累形成的聚集體。它們作為一個(gè)屏障，為微生物生命活動(dòng)創(chuàng)造穩(wěn)定的內(nèi)部環(huán)境。生物膜通過限制消毒劑擴(kuò)散的作用達(dá)到對(duì)消毒劑耐藥的效果。例如Akinbobola等發(fā)現(xiàn)在濃度為2000mg/kg的過氧乙酸處理下，內(nèi)鏡腔內(nèi)積聚的銅綠假單胞菌生物膜可存活96min，導(dǎo)致消毒劑失去效力。與單細(xì)胞細(xì)菌比較，生物膜在多種細(xì)菌中可起到協(xié)同作用，多種細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌株可以保護(hù)其他菌株免受消毒劑的侵害；與協(xié)同作用相反，某種病原體生物膜的形成也可能會(huì)受到其他細(xì)菌的抑制，Gutiérrez-Almada 等發(fā)現(xiàn)部分海洋細(xì)菌產(chǎn)生抑制了一種或多種菌株生物膜形成的物質(zhì)。②細(xì)菌外部細(xì)胞層：無論是細(xì)胞壁還是細(xì)胞膜，它們都起著屏障保護(hù)的作用，阻止消毒劑的滲透。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜滲透性的下降會(huì)降低或阻止消毒劑進(jìn)入細(xì)菌。革蘭陰性菌因其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，從而不易被消毒劑滲透破壞。③主動(dòng)外排系統(tǒng)：目前已知有大量的膜蛋白參與了細(xì)菌對(duì)有害物質(zhì)的外排，這些膜蛋白組成了主動(dòng)外排系統(tǒng)。外排系統(tǒng)可能是細(xì)菌面對(duì)殺菌藥物威脅反應(yīng)最快和最有效的耐藥機(jī)制。多個(gè)外排泵可共同，或與其他耐藥機(jī)制協(xié)同抵抗消毒劑的破壞。主動(dòng)外排系統(tǒng)可分為5個(gè)膜蛋白家族，分別是耐藥瘤細(xì)胞分裂家族（resistance-nodulation-division family，RND）、主要易化子超家族（major facilitator superfamily，MFS）、多重藥物及毒物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion family，MATE）、小多重耐藥家族（small multidrug resistance family，SMR）、ATP 結(jié)合盒家族（ATP binding cassette transporters，ABC）。其中，RND 最常見于革蘭陰性菌，如RND 家族中的TriABC 被發(fā)現(xiàn)于銅綠假單胞菌，是針對(duì)三氯生（triclosan，TCS）和十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的特異性外排泵；家族中的甲基二乙醇胺[N-Ethyl-1-(3,4-methylenedioxyphenyl)-2-propylamine;methylenedioxyethylamphetamine，MDEA]可在葡萄球菌表達(dá)呈現(xiàn)，參與了季銨鹽類消毒劑外排。④藥物降解酶：細(xì)菌和殺菌劑的相互作用可使細(xì)菌產(chǎn)生具有降解殺菌劑作用的酶，這種抗性機(jī)制包括抗重金屬和抗甲醛等。此類耐藥基因可位于細(xì)菌不同部位，染色體內(nèi)的基因與其固有性耐藥相關(guān)，亦可由誘導(dǎo)產(chǎn)生，質(zhì)粒內(nèi)的基因可通過傳遞而傳播。

3.2.2 誘導(dǎo)性耐藥 ①生理適應(yīng)性耐藥：低濃度消毒劑的長(zhǎng)期作用，可使細(xì)菌耐受性發(fā)生相應(yīng)的變化。但這種耐藥性常發(fā)生在消毒劑濃度遠(yuǎn)低于正常使用濃度時(shí)，而且其耐藥性是可逆的，往往隨著作用條件的去除而消失。②基因突變或耐藥基因表達(dá)增加：消毒劑及其他因素環(huán)境亦可提高細(xì)菌基因突變的發(fā)生率。其突變可發(fā)生在耐藥基因上，也可發(fā)生于控制耐藥基因的調(diào)控基因片段。③選擇壓力：嚴(yán)格意義上來講，選擇壓力并不是細(xì)菌個(gè)體層面上出現(xiàn)的誘導(dǎo)性耐藥。面對(duì)藥物選擇作用，細(xì)菌個(gè)體發(fā)生優(yōu)勝劣汰，從而導(dǎo)致細(xì)菌群落對(duì)消毒劑的耐藥性整體增強(qiáng)。同時(shí)，消毒劑的使用不當(dāng)或?yàn)E用均會(huì)加劇細(xì)菌耐藥性的發(fā)生。

3.2.3 獲得性耐藥 消毒劑耐藥基因的存在與表達(dá)決定了細(xì)菌對(duì)消毒劑的耐藥性。而這些耐藥基因按位置不同可分為兩類，分別由染色體和質(zhì)粒介導(dǎo)。受體細(xì)菌通過各種途徑獲得其他細(xì)菌的耐藥基因引起的消毒劑耐藥即為獲得性耐藥，其中，質(zhì)粒傳遞是其主要途徑。Qac 基因家族在消毒劑耐藥質(zhì)粒的相關(guān)研究中較為常見，其又分為QacA、QacB、QacC、QacD、QacE、QacF、QacG、QacH、QacJ、QacZ 和Sugar（p）等多個(gè)亞型，表達(dá)多種化合物外排泵。QacA 或QacB 耐藥基因常見于葡萄球菌，最新研究發(fā)現(xiàn)攜帶QacA 的結(jié)合質(zhì)?？梢詮母锾m陽(yáng)性菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移到革蘭陰性菌大腸桿菌C600 中，從而導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)相應(yīng)消毒劑的敏感性顯著降低。

其他途徑可見于轉(zhuǎn)座子和整合子。轉(zhuǎn)座子內(nèi)的基因片段，可通過質(zhì)粒傳遞或染色體呈現(xiàn)，或直接在菌株間轉(zhuǎn)移。整合子-基因盒系統(tǒng)可位于染色體，亦可出現(xiàn)在轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒中，前者導(dǎo)致了子代的耐藥遺傳，后者引起細(xì)菌間的耐藥傳播。另外，耐藥基因還可通過噬菌體從一種細(xì)菌轉(zhuǎn)移到另一種細(xì)菌而發(fā)生耐藥性傳播。

4 消毒劑的交叉耐藥的定義與機(jī)制

國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物交叉耐藥的定義并沒有統(tǒng)一，交叉耐藥在國(guó)內(nèi)一般泛指廣義的交叉耐藥，包含了國(guó)外學(xué)者的狹義交叉耐藥與共耐藥。狹義的交叉耐藥，是指屬于同一類的不同抗生素或抗菌藥物因?yàn)榫哂邢嗤哪退帣C(jī)制而出現(xiàn)類似的耐藥；共耐藥是因?yàn)橥豢梢苿?dòng)基因元件（mobile genetic elements，MGES）如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等攜帶對(duì)不同類抗菌藥物的耐藥基因，其發(fā)生突變或傳播時(shí)，不同作用機(jī)制的不同類藥物同時(shí)表現(xiàn)為耐藥；另外，即使抗菌藥物及消毒劑不屬于同一類，其各類耐藥機(jī)制也可能存在共通性。本文交叉耐藥為廣義交叉耐藥。

外排泵是引起交叉耐藥的常見機(jī)制。一種外排泵能排多個(gè)不同類型的抗菌化合物，這致使細(xì)菌在各類抗菌化合物之間產(chǎn)生交叉耐藥。目前發(fā)現(xiàn)了多種同時(shí)引起消毒劑和抗生素耐藥的外排泵系統(tǒng)。染色體上和質(zhì)粒都可能存在這類耐藥基因。以金黃色葡萄球菌為例，其染色體基因編碼的家族外排泵NorA，在外排喹諾酮類抗生素的同時(shí)，也能外排季銨鹽類消毒劑。其質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因Qac，各亞型可以編碼產(chǎn)生不同外排系統(tǒng)家族的外排蛋白。研究發(fā)現(xiàn)相較非耐藥菌株，頭孢西丁、環(huán)丙沙星和四環(huán)素等耐藥菌株的Qac 基因明顯增高，可能與多種耐藥基因位于同一個(gè)質(zhì)粒上產(chǎn)生共耐藥相關(guān)。

另外，由于菌株或者群落具有特殊的屏障結(jié)構(gòu)，如生物膜、外膜蛋白為細(xì)菌提供了額外的保護(hù)，或細(xì)胞壁和細(xì)胞膜發(fā)生了結(jié)構(gòu)功能上的改變導(dǎo)致通透性下降，這些非特異性抗藥都是產(chǎn)生交叉耐藥的重要原因。相較于游離菌，有生物膜存在的細(xì)菌，其耐藥基因的表達(dá)會(huì)明顯升高。

同時(shí)，國(guó)內(nèi)外對(duì)消毒劑與抗生素耐藥性的關(guān)聯(lián)性方面亦存在不同看法及報(bào)道。Roedel 等對(duì)食品生產(chǎn)設(shè)備中分離得到的單核細(xì)胞增生李斯特菌株進(jìn)行消毒劑和抗生素敏感性的檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)兩者耐藥性方面存在關(guān)聯(lián)性。

5 小結(jié)與展望

細(xì)菌具有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，可以隨著環(huán)境變化及抗生素、消毒劑的廣泛運(yùn)用，通過上述系列機(jī)制不斷發(fā)生進(jìn)化。而這種進(jìn)化使得細(xì)菌對(duì)抗生素及消毒劑產(chǎn)生了耐藥及交叉耐藥，導(dǎo)致臨床工作所面臨的挑戰(zhàn)更具復(fù)雜性。現(xiàn)今普遍認(rèn)為，消毒劑的濫用、處理不當(dāng)以及用量不足等是導(dǎo)致上訴耐藥現(xiàn)象的主要原因。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)消毒劑種類的研究有限，所選細(xì)菌的代表性不夠強(qiáng)，其耐藥產(chǎn)生的機(jī)制尚未研究透徹，對(duì)消毒劑耐藥性的判定也未統(tǒng)一建立。上述問題都將成為進(jìn)一步研究及標(biāo)準(zhǔn)建立的重點(diǎn)。目前研究的消毒劑種類多集中在物體表面消毒劑，此類消毒劑可通過浸泡、擦拭、噴灑等多種方式作用于家庭或醫(yī)療場(chǎng)地等公共環(huán)境物體表面。其理化性質(zhì)及藥物濃度對(duì)人體存在危害性，如何選擇合適的皮膚或創(chuàng)面醫(yī)用消毒劑作為研究用藥對(duì)象，將更具臨床意義。加強(qiáng)細(xì)菌對(duì)消毒劑耐藥性機(jī)制及交叉耐藥的研究，如通過進(jìn)一步的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究比較抗生素耐藥菌株與非耐藥菌株對(duì)特定消毒劑耐藥性的差別，了解消毒劑與抗生素耐藥相關(guān)程度。隨著研究的深入及數(shù)據(jù)的支持，與抗生素耐藥檢測(cè)與判讀一樣，消毒劑耐藥性的檢測(cè)與判定也將建立起統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)方案，進(jìn)而為消毒劑及抗生素的臨床合理選擇提供更全面的思路與依據(jù)，同時(shí)還可以為新型消毒劑的研發(fā)提供相應(yīng)理論支持。