抗結(jié)核藥物性肝損傷中肝細(xì)胞死亡方式研究新進(jìn)展

郭雨晴,張怡潔,潘韻芝,吳妹英,劉 佳,楊薇

郭雨晴,張怡潔,潘韻芝,吳妹英,劉佳,楊薇,蘇州大學(xué)附屬傳染病醫(yī)院藥劑科 江蘇省蘇州市 215131

0 引言

結(jié)核病(tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的慢性傳染病.我國結(jié)核病患者總量居世界第三位,是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家.藥物治療是結(jié)核病最主要的治療手段,而抗結(jié)核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury,ATB-DILI)是臨床治療中最常見的不良反應(yīng),也是我國藥物性肝損傷(drug-induced liver injury,DILI)的常見原因之一.ATB-DILI是指在抗結(jié)核藥物使用過程中,由于藥物及其代謝產(chǎn)物引起的肝細(xì)胞毒性損害或肝臟對藥物及其代謝產(chǎn)物的超敏反應(yīng)所致的病理過程.輕者表現(xiàn)為一過性的轉(zhuǎn)氨酶升高,重者可致肝衰竭,甚至危及生命.部分患者不得不中止抗結(jié)核治療,從而影響結(jié)核病的治療效果.在肝臟中,抗結(jié)核藥物可通過誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)和激活死亡受體(death receptor,DR)等方式誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡或壞死.除凋亡和壞死外,ATB-DILI的發(fā)病過程中也伴隨著自噬、焦亡和鐵死亡.然而不同藥物引起的肝細(xì)胞死亡方式不同,需要阻斷的死亡通路也不同,因此急需要研究抗結(jié)核藥物性肝損傷中肝細(xì)胞死亡方式并尋找針對死亡通路的治療性藥物.

1 細(xì)胞壞死與ATB-DILI

異煙肼(isoniazid,INH)和利福平(rifampicin,RFP)等一線抗結(jié)核藥物在肝臟代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生一系列代謝產(chǎn)物,這些產(chǎn)物可與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境紊亂,最終造成肝細(xì)胞死亡.抗結(jié)核藥物性肝損傷可分為肝細(xì)胞性、膽汁淤積型和混合型肝損傷.臨床上,異煙肼引起的肝損傷主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)氨酶水平升高,提示存在肝細(xì)胞的直接死亡,而利福平的毒性作用表現(xiàn)為膽紅素和血清堿性磷酸酶水平升高,提示利福平誘導(dǎo)的肝損傷以膽汁淤積性肝損傷為主.

1.1 抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的肝細(xì)胞直接壞死 異煙肼通過N-乙?；D(zhuǎn)移酶2(N-acetyltransferase2,NAT2)的乙?；饔蒙梢阴．悷熾?進(jìn)而水解為異煙酸和乙酰肼.乙酰肼進(jìn)一步乙?；蔁o毒的二乙酰肼.除此之外,異煙肼還可直接水解為異煙酸和肼,后者也可繼續(xù)乙?；癁橐阴ｋ?異煙肼的代謝產(chǎn)物肼及乙酰肼具有明顯的細(xì)胞毒性,可與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)共價(jià)結(jié)合,引起肝細(xì)胞壞死.同時(shí)藥物在代謝過程中產(chǎn)生大量自由基,細(xì)胞內(nèi)自由基的積累導(dǎo)致肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化和嚴(yán)重的斑片狀壞死.因此,異煙肼導(dǎo)致的肝損傷多為急性肝細(xì)胞損傷,病理上表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性和壞死(包括橋接樣壞死和多小葉性壞死).肝損害多發(fā)生于給藥6 wk內(nèi),少部分患者在用藥1年后仍然發(fā)生肝損傷.

目前利福平的肝損害機(jī)制尚不完全清楚.利福平在肝臟中的主要代謝物是去乙酰利福平,與異煙肼相比,利福平的直接肝毒性較低.但是利福平是孕烷X受體(pregnane X receptor,PXR)的激動(dòng)劑,PXR是重要的核受體,在肝臟中表達(dá)較高,可誘導(dǎo)肝臟中多種代謝酶的表達(dá),加重配伍藥物的肝毒性.研究表明,利福平與異煙肼聯(lián)用,不僅肝損害發(fā)生率增高,程度加重且發(fā)生時(shí)間更早,肝損傷在給藥10 d之內(nèi)便可發(fā)生.

此外,原卟啉IX(protoporphyrin IX,PPIX)的毒性作用近年來也受到明顯關(guān)注.PPIX是血紅素生物合成的重要中間體,具有一定的肝臟毒性,因此PPIX的體內(nèi)表達(dá)受到多方面的調(diào)控.氨基乙酰丙酸合成酶1(deltaaminolevulinate synthase 1,ALAS1)是PPIX的合成限速酶,亞鐵螯合酶(ferrochelatase,FECH)是PPIX的代謝限速酶.在生理?xiàng)l件下,肝內(nèi)PPIX的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)運(yùn)速度很快,在肝臟中的濃度很低,一旦PPIX動(dòng)態(tài)平衡被破壞,肝臟會(huì)受到顯著損傷甚至導(dǎo)致急性肝功能衰竭.有研究表明,異煙肼/利福平聯(lián)用后一方面通過抑制FECH降低PPIX的代謝,另一方面通過上調(diào)ALAS1增加PPIX的表達(dá),引起肝臟內(nèi)PPIX的積累,導(dǎo)致肝毒性明顯增強(qiáng),最終引起肝損傷.

1.2 抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)引起膽汁淤積型壞死 膽汁在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞形成,分泌到排列成網(wǎng)狀的小膽管或肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間的膽小管中.肝細(xì)胞是一種高度極化的上皮細(xì)胞,它的基側(cè)膜面向肝竇,頂端膜形成毛細(xì)膽管腔,基側(cè)膜和頂端膜上分布有不同的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)體,具有促進(jìn)膽汁酸鹽及其他化合物的吸收和分泌的作用.研究表明,利福平通過多種方式抑制膽汁分泌,持續(xù)的膽汁淤積可引起肝臟大面積壞死、肝纖維化、甚至導(dǎo)致肝功能衰竭.

利福平誘導(dǎo)的膽汁淤積可能與肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制有關(guān).肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白多分布在肝細(xì)胞的小管膜上,將膽汁酸和膽紅素輸送到膽道以減輕膽汁酸、膽紅素和有毒物質(zhì)在肝臟中的積聚.利福平可以引起膽鹽輸出泵蛋白(bile salt export pump,BSEP)、多藥耐藥相關(guān)蛋白2(multidrug resistance associated protein 2,MRP2)、多藥耐藥蛋白1(multidrug resistant transporter 1,MDR1)、Na?；撬峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽(sodium taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(organic aniontransporting polypeptides,OATPS)、有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白β(organic solute transporterβ,OSTβ)等膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的mRNA和蛋白水平的表達(dá)下降,引起毒性物質(zhì)在肝細(xì)胞中累積.這種調(diào)控可能是利福平通過抑制轉(zhuǎn)錄因子NRF2實(shí)現(xiàn)的.敲除NRF2后,BSEP、MDR1、MRP2、NTCP、OATPS和OSTβ的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均有不同程度的下降,引起膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)的失衡和有毒物質(zhì)在肝臟中的積累,導(dǎo)致肝損傷.

異煙肼也可誘導(dǎo)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)的失調(diào).SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的組蛋白去乙?；?參與脂質(zhì)、葡萄糖和膽汁酸的代謝.SIRT1可調(diào)控FXR的轉(zhuǎn)錄從而控制FXR的激活.研究表明,異煙肼可以通過抑制SIRT1進(jìn)而抑制FXR信號通路,引起MRP2和BSEP的表達(dá)降低引起膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào)最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷.

2 氧化應(yīng)激與ATB-DILI

在抗結(jié)核藥物代謝過程中肝細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量自由基,誘導(dǎo)細(xì)胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)增加,同時(shí)消耗大量的還原性物質(zhì),導(dǎo)致超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,D6PD)等抗氧化物酶的活性和含量降低,引起顯著的氧化應(yīng)激狀態(tài).氧化應(yīng)激被認(rèn)為是抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)引起肝損傷的核心機(jī)制之一.目前,與氧化應(yīng)激有關(guān)的細(xì)胞死亡主要包括凋亡、鐵死亡和自噬.

2.1 細(xì)胞凋亡與ATB-DILI 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的自主性死亡.與細(xì)胞壞死不同,細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)過程,它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用,具有明顯的形態(tài)學(xué)特征: 細(xì)胞體積變小,胞質(zhì)濃縮,核染色質(zhì)固縮于邊緣,DNA降解,最后形成多個(gè)凋亡小體而被吞噬.研究表明異煙肼主要通過改變線粒體膜電位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.在細(xì)胞模型中,經(jīng)異煙肼處理后線粒體膜電位明顯降低,抗凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)以特異性的劑量依賴方式下調(diào),同時(shí)促凋亡蛋白(BCL2-associated X,Bax)的表達(dá)上調(diào),Bcl-2/Bax的比例明顯下降,最終引起細(xì)胞凋亡.異煙肼還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體轉(zhuǎn)移到胞漿,激活半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase)-9和Caspase-3引起線粒體功能障礙進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.在異煙肼和利福平誘導(dǎo)的小鼠模型中,肝細(xì)胞的大量凋亡引起小鼠肝臟炎癥細(xì)胞浸潤增加,引起肝星狀細(xì)胞的活化最終導(dǎo)致小鼠肝臟纖維化.在異煙肼誘導(dǎo)的斑馬魚模型中,斑馬魚的肝臟體積明顯縮小,凋亡相關(guān)因子(Bax、Cyt、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、p53和Cyt)以及Nrf2信號通路相關(guān)分子(Nrf2、Ho-1、Nqo1、Gclm和Gclc)的mRNA水平顯著上調(diào),進(jìn)一步說明異煙肼可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡引起肝損傷.

利福平也可以通過多種方式誘導(dǎo)氧化應(yīng)激進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡.研究表明,利福平可在上皮來源的多種細(xì)胞(腎、肝、肺)中積聚,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生上皮樣形態(tài)向成纖維細(xì)胞樣改變.在上皮細(xì)胞中可見線粒體向核周區(qū)域的顯著聚集,線粒體呈圓形,嵴的大小和數(shù)量減小,出現(xiàn)單一或環(huán)狀嵴的線粒體,部分線粒體甚至發(fā)生斷裂,引起線粒體功能障礙,誘導(dǎo)ROS的過度產(chǎn)生和內(nèi)部細(xì)胞色素C從線粒體的釋放,最終引起細(xì)胞凋亡.利福平處理人正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞可以激活 PERK-ATF4-CHOP信號通路,引起ERS,誘導(dǎo)凋亡.經(jīng)異煙肼和利福平處理后,小鼠肝臟細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)變,引起脂肪變性和肝細(xì)胞凋亡.這些研究表明凋亡有可能成為治療ATB-DILI的重要靶點(diǎn).

2.2 鐵死亡與ATB-DILI 鐵死亡(Ferroptosis)是近年來新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式,在形態(tài)、生化特征和調(diào)控機(jī)制上與其他死亡方式明顯不同.在形態(tài)學(xué)上,鐵死亡表現(xiàn)為細(xì)胞膜起泡但不破裂、線粒體膜密度增加、線粒體嵴減少或消失、細(xì)胞核正常且不發(fā)生染色質(zhì)凝聚;其生化特性表現(xiàn)為鐵離子和ROS水平異常升高、半胱氨酸攝取減少、花生四烯酸介導(dǎo)因子釋放增多等.鐵死亡是鐵離子依賴性的脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致的程序性細(xì)胞死亡新方式,該過程中鐵離子發(fā)生胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和聚集,細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽耗竭,GPX4功能失活,喪失對脂質(zhì)過氧化物的清除功能,最終導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞死亡.

脂質(zhì)過氧化在鐵死亡中具有重要作用,以亞油酸(linoleic acid,LA)和花生四烯酸(arachidonic acid,AA)為代表的多不飽和脂肪酸的積累是引起細(xì)胞鐵死亡的重要原因.長鏈脂酰輔酶A合成酶4(acyl-coa synthetase longchain family member 4,ACSL4)和磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)參與脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生.

ACSL4是長鏈脂酰COA合成酶(long-chain acyl-CoA synthetase,ACSLs)家族的一員,在體內(nèi)催化合成脂酰 COA,作為脂肪酸分解代謝的第1步反應(yīng).已發(fā)現(xiàn)ACSL4是鐵死亡通路中關(guān)鍵基因,ACSL4能將花生四烯酸和腎上腺酸分別合成為花生四烯酰COA和腎上腺酰COA,以參與膜磷脂合成.在鐵死亡誘導(dǎo)劑RSL3等處理下,膜上的長鏈多不飽和脂肪酸容易被氧化,從而引發(fā)細(xì)胞鐵死亡.研究證實(shí)敲除ACSL4后,細(xì)胞對鐵死亡的激動(dòng)劑Erastin表現(xiàn)出很高的抗性.ACSL4通過參與易被氧化的膜磷脂而成為鐵死亡發(fā)生的必需分子.溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶(lysophosphatidylcholine acyltransferases,LPCATs)是一組調(diào)節(jié)磷脂代謝的關(guān)鍵酶,通過脫酰基-再?；饔?介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)磷脂的合成和重構(gòu).在磷脂重塑酶中,LPCAT3 在脂質(zhì)代謝中的作用是研究最為深入的.LPCAT3在肝、腸和脂肪組織等代謝組織中高表達(dá),參與極低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)分泌和脂肪合成等脂代謝調(diào)節(jié)活動(dòng).LPCAT3催化合成花生四烯酸磷脂酰膽堿和亞油?；字Ｄ憠A,與 LPCAT1不同,LPCAT3催化多不飽和磷脂的生成.同時(shí)ACSL4和LPCAT3共同作用可以促進(jìn)含有花生四烯酸的細(xì)胞膜磷脂酰乙醇胺(PE-AA)的合成誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡.

在抗結(jié)核藥物代謝過程中,肝細(xì)胞消耗大量谷胱甘肽(glutathione,GSH),導(dǎo)致氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化,符合鐵死亡的相關(guān)指征.鑒于此,筆者課題組使用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)ATB-DILI的小鼠肝細(xì)胞中存在線粒體萎縮變小,線粒體脊減少,膜密度增高,而細(xì)胞核形態(tài)正常,缺乏染色質(zhì)凝集等鐵死亡的形態(tài)學(xué)特征.同時(shí),肝細(xì)胞中線粒體膜電位、ROS、脂質(zhì)過氧化水平和鐵離子濃度升高.分子水平上,鐵死亡相關(guān)分子ACSL4的表達(dá)升高,而GPX4表達(dá)顯著降低.筆者課題組進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)方法檢測了ATB-DILI患者的肝臟活檢組織中GPX4和ACSL4的表達(dá).結(jié)果顯示,GPX4在ATB-DILI區(qū)域的表達(dá)相對較低,而ACSL4的表達(dá)相對較高.這一系列結(jié)果表明,在抗結(jié)核藥物性肝損傷中存在鐵死亡.此外,筆者課題組發(fā)現(xiàn),在ATB-DILI模型中,補(bǔ)充外源性鐵顯著增加細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平和肝損傷程度,而谷胱甘肽的補(bǔ)充會(huì)逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果.340例接受異煙肼和利福平聯(lián)合治療的結(jié)核病患者的回顧性分析結(jié)果顯示,服用鐵補(bǔ)劑患者的肝損傷幾率提高近三倍,比服用谷胱甘肽保肝組的肝損傷幾率高出七倍,進(jìn)一步說明額外補(bǔ)充鐵會(huì)顯著增強(qiáng)抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化以及鐵死亡,進(jìn)而引起肝損傷.表明鐵死亡有可能成為治療ATB-DILI的重要靶點(diǎn).

2.3 自噬與ATB-DILI 自噬是真核生物通過吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內(nèi)容物的過程,借此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新.自噬發(fā)生需要經(jīng)過以下幾個(gè)階段: (1)自噬前體形成;(2)自噬前體延長包裹自噬的底物,自噬泡形成;(3)自噬泡與溶酶體融合完成底物降解.眾多研究表明,細(xì)胞在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,來源于線粒體的ROS是自噬的主要誘導(dǎo)者,ROS能通過介導(dǎo)自噬形成過程中的各個(gè)信號通路誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生.mTOR是控制細(xì)胞自噬的關(guān)鍵蛋白,能感受細(xì)胞的多種變化信號從而加強(qiáng)或降低自噬的發(fā)生.在自噬誘導(dǎo)階段中,ROS能通過調(diào)控mTOR而誘導(dǎo)自噬發(fā)生.細(xì)胞自噬與許多病理過程密切相關(guān),如藥物性肝損傷、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、病原微生物感染等.

抗結(jié)核藥物性肝損傷中自噬相關(guān)研究較少.有研究發(fā)現(xiàn)異煙肼處理后細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ(microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ,LC3-Ⅱ)表達(dá)上調(diào)、GFP-LC3和單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine,MDC)的熒光強(qiáng)度升高,說明異煙肼可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞自噬.進(jìn)一步的研究揭示,在分子水平上,異煙肼可以降低mTOR的蛋白磷酸化水平進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞自噬相關(guān)通路.在異煙肼處理后的斑馬魚模型中,自噬相關(guān)因子(Beclin-1、LC3、Atg3和Atg12)的表達(dá)水平顯著提高.自噬相關(guān)通路表明自噬有可能成為治療ATDILI的重要靶點(diǎn).

4 結(jié)語

ATB-DILI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前對其機(jī)制研究較為匱乏.抗結(jié)核藥物在代謝過程中產(chǎn)生的毒物直接引起細(xì)胞壞死,同時(shí)產(chǎn)生大量自由基,消耗細(xì)胞內(nèi)的還原性物質(zhì),導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,引起線粒體功能障礙,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、鐵死亡、自噬等程序性死亡.在ATB-DILI中不只有一種細(xì)胞死亡方式,其必然是多靶點(diǎn)誘導(dǎo)的多種細(xì)胞死亡共同作用的結(jié)果,針對肝細(xì)胞的不同損傷機(jī)制,在臨床上要關(guān)注不同藥物的綜合使用: (1)通過還原型谷胱甘肽、甘草甜素、苦參素、五味子等藥物抗氧化、清除自由基;(2)通過水飛薊素,異甘草酸鎂、復(fù)方甘草酸苷、甘草酸二銨等藥物保護(hù)肝細(xì)胞生物膜;(3)通過熊去氧膽酸等藥物促進(jìn)肝臟分泌和排泄膽汁酸鹽.此外,隨著技術(shù)進(jìn)步和理論創(chuàng)新,近年來發(fā)現(xiàn)了諸多新的細(xì)胞死亡方式,其在ATB-DILI中的作用和機(jī)制有待進(jìn)一步研究,以期尋找新的診斷標(biāo)志物和治療藥物靶點(diǎn).