磁場(chǎng)作用下對(duì)血漿速凍品質(zhì)的實(shí)驗(yàn)研究

蘭 慧 劉 斌 賈 權(quán) 韓馨儀 劉泳杉 余 輝

(1 天津商業(yè)大學(xué) 天津市制冷技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300134；2 天津大學(xué)精密與儀器學(xué)院 天津 300072)

20世紀(jì)以來(lái)，我國(guó)低溫行業(yè)迅速發(fā)展，低溫技術(shù)不斷更新推動(dòng)了器官移植、血漿、紅細(xì)胞、植物蛋白等生物材料的保存。在各類生物材料的保存中，血漿因其廣泛適用性，成為低溫生物行業(yè)中貯藏的一種重要生物材料。血漿是血液中的非細(xì)胞成分，含有多種成分，主要包括水分、糖類、無(wú)機(jī)物、非蛋白含氮化合物、蛋白質(zhì)等。臨床中所用血漿多為血站提供，血站主要為臨床提供新鮮冰凍血漿。新鮮冰凍血漿是目前臨床常用的一種成分血，包含正常量的全部凝血因子，在治療和預(yù)防出血、凝血疾病及大劑量輸血所致的凝血功能障礙方面具有重要作用。對(duì)于新鮮冰凍血漿的質(zhì)量控制，基本是基于凝血因子Ⅷ(FVIII)活性的檢測(cè)，如歐盟委員會(huì)指南要求新鮮冰凍血漿的平均FVIII水平高于0.7 IU/mL，我國(guó)同樣要求75%受檢血漿中FVIII高于0.7 IU/mL。然而由于醫(yī)療機(jī)構(gòu)因速凍工藝降溫速率較慢、融化后不能及時(shí)輸注導(dǎo)致FVIII活性下降從而影響治療效果。為保證新鮮冰凍血漿的質(zhì)量，對(duì)新鮮冰凍血漿的速凍方式進(jìn)行改良優(yōu)化是十分必要的。本文通過(guò)結(jié)合磁場(chǎng)輔助凍結(jié)以達(dá)到進(jìn)一步提高速凍的目的。

目前，磁場(chǎng)輔助和速凍工藝相結(jié)合的研究正在不斷發(fā)展，其探索空間與應(yīng)用前景廣闊。在速凍過(guò)程中添加磁場(chǎng)可以加速傳熱傳質(zhì)速度，提高凍結(jié)速率，改變被測(cè)樣品中水的表面張力[1-2]、氫鍵以及過(guò)冷度[3-6]，形成較小冰晶[7-8]，減少冰晶對(duì)血漿完整結(jié)構(gòu)的損傷，從而達(dá)到提高品質(zhì)的目的。從微觀角度分析，磁場(chǎng)輔助凍結(jié)可以產(chǎn)生較小的冰晶從而抑制組織結(jié)構(gòu)的變化損害，達(dá)到更高品質(zhì)的保存[9-10]。N. Owada等[11-12]與新鮮食品樣品相比，振蕩磁場(chǎng)(小于1 mT和50 Hz)可以縮短總冷凍時(shí)間，且在冷凍解凍的雞肉和金槍魚(yú)肉中未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷。Lin Peiyi等[13]展示了具有磁場(chǎng)的冷凍方案對(duì)于人類胚胎干細(xì)胞保存的有效方法。Y. S. Choi等[14]發(fā)現(xiàn)，磁場(chǎng)輔助冷凍降低了牛排中冰晶的大小，改善了感官特性。S. C. Kim等[15]發(fā)現(xiàn)電磁冷凍顯著減少了牛肉、豬肉和雞肉的總冷凍時(shí)間和滴水損失。

本文主要以血漿物性參數(shù)為基礎(chǔ)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究并對(duì)磁場(chǎng)輔助速凍工藝的血漿凍結(jié)進(jìn)行研究分析，以豬血漿為研究對(duì)象，對(duì)豬血漿分別在0、20、40、60、80、100 Gs下的兩個(gè)測(cè)點(diǎn)溫度進(jìn)行對(duì)比，觀察交流磁場(chǎng)AC(f=50 Hz)、直流磁場(chǎng)DC下的血漿凍結(jié)速率變化，在顯微鏡下觀察DC下不同的血漿分子凍結(jié)過(guò)程，分析確定最優(yōu)磁場(chǎng)強(qiáng)度，以提高血漿凍結(jié)速率。速凍實(shí)驗(yàn)后，對(duì)0～100 Gs下的冰晶形態(tài)與大小進(jìn)行分析討論，對(duì)FVIII活性濃度進(jìn)行測(cè)量[16]，與實(shí)驗(yàn)新鮮冰凍血漿成分活性濃度進(jìn)行對(duì)比，分析確定不同磁場(chǎng)輔助速凍后的品質(zhì)效果。

1 實(shí)驗(yàn)儀器、材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)原理如圖1所示。實(shí)驗(yàn)臺(tái)由溫度測(cè)量設(shè)備、血漿觀察設(shè)備、數(shù)據(jù)記錄設(shè)備、速凍設(shè)備、磁場(chǎng)相關(guān)設(shè)備以及血漿品質(zhì)檢測(cè)相關(guān)設(shè)備構(gòu)成，溫度測(cè)量設(shè)備為Pt100熱電阻，傳感器探頭為鉑熱電阻；實(shí)驗(yàn)使用觀察血漿凍結(jié)結(jié)構(gòu)的顯微鏡型號(hào)為奧林巴斯BX43；數(shù)據(jù)記錄設(shè)備為橫河公司無(wú)紙記錄儀，型號(hào)為GP20；速凍設(shè)備為中科都菱超低溫保存箱，型號(hào)為MDF-86H458，溫度范圍為-86～-40 ℃；磁場(chǎng)相關(guān)設(shè)備使用力田專利技術(shù)設(shè)計(jì)的HM-150型亥姆霍茲磁場(chǎng)線圈，磁場(chǎng)線圈通過(guò)調(diào)節(jié)電源的電流電壓來(lái)改變磁場(chǎng)大小。血漿品質(zhì)檢測(cè)相關(guān)設(shè)備選取為德國(guó)生產(chǎn)Sigma3-18k高速冷凍離心機(jī)。

圖1 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)原理Fig.1 Principle of experimental device

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

因?yàn)閷?shí)驗(yàn)用人血漿存在諸多限制因素，故本實(shí)驗(yàn)使用血漿為從健康成年豬屠宰后所收集的豬全血，豬血漿由豬全血通過(guò)離心機(jī)分離提取得到，豬全血采自天津二商迎賓肉類食品有限公司，為了保證實(shí)驗(yàn)血漿的一致性，選擇同一頭豬提取血漿。按照19∶1的比例在醫(yī)用藥瓶中加入抗凝劑檸檬酸鈉[17]，隨后倒入豬全血進(jìn)行輕微搖晃，使抗凝劑與豬全血充分融合。將全血靜置30 min以上，放入離心杯中，離心機(jī)速度設(shè)置為2 000 r(離心速度選擇原則不宜過(guò)大為了預(yù)防血細(xì)胞的破裂)，離心時(shí)間為10 min。離心結(jié)束后，得到分層的全血，上層顏色為淡黃色，下層為深紅色。提取上層透明狀液體即為血漿。將提取的血漿靜置一段時(shí)間后，放入12個(gè)血漿瓶中，每瓶分別放入100 mL血漿進(jìn)行磁場(chǎng)輔助凍結(jié)實(shí)驗(yàn)，分成6組，對(duì)每組不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下(0、20、40、60、80、100 Gs)的血漿分別用于溫度實(shí)驗(yàn)研究和血漿品質(zhì)檢測(cè)。血漿相關(guān)參數(shù)如表1所示。

表1 血漿相關(guān)參數(shù)Tab.1 Plasma related parameters

1.3 血漿凍結(jié)實(shí)驗(yàn)

由于傳感器所測(cè)溫度在實(shí)驗(yàn)中可能與真實(shí)溫度存在偏差，故在實(shí)驗(yàn)測(cè)溫前需進(jìn)行溫度標(biāo)定。取一組熱電阻放入血漿瓶測(cè)量血漿速凍過(guò)程中的溫度變化。每瓶血漿取2個(gè)測(cè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)量，測(cè)溫點(diǎn)位置如圖2所示。在標(biāo)定前，分別設(shè)置-35、-25、-15、-5、0、15、25 ℃幾組溫度，將防凍液放入低溫恒溫槽中，待溫度分別達(dá)到所設(shè)置溫度后，讀取無(wú)紙記錄儀上傳感器顯示的示數(shù)，進(jìn)行曲線擬合，將實(shí)際溫度設(shè)為y，傳感器記錄溫度設(shè)為x，最終得到兩組熱電阻擬合曲線，分別為y=0.995 61x-2.433 57，y=1.008 35x-2.585 19。

圖2 測(cè)溫點(diǎn)位置Fig.2 Position of the temperature point

溫度標(biāo)定之后，調(diào)節(jié)磁場(chǎng)強(qiáng)度，首先校對(duì)特斯拉計(jì)，使特斯拉計(jì)傳感頭處于空氣時(shí)所顯示的磁場(chǎng)強(qiáng)度示數(shù)為0，量程開(kāi)關(guān)檔位撥至200 mT。將直流電源的正負(fù)極與磁場(chǎng)發(fā)生器接通，放置在低溫保存箱中，連接穩(wěn)定后，將特斯拉計(jì)傳感頭置于磁場(chǎng)中心位置，不斷轉(zhuǎn)動(dòng)特斯拉計(jì)直至特斯拉計(jì)所顯示的示數(shù)為該電流電壓下的最大磁場(chǎng)示數(shù)。進(jìn)行血漿凍結(jié)實(shí)驗(yàn)時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)直流電壓示數(shù)將相應(yīng)的磁場(chǎng)強(qiáng)度分別調(diào)至0、20、40、60、80、100 Gs。然后調(diào)節(jié)速凍機(jī)箱內(nèi)溫度并穩(wěn)定在-50 ℃，調(diào)好后放入待測(cè)血漿樣品，置于磁場(chǎng)發(fā)生器中，使其均勻受到磁場(chǎng)作用，待血漿溫度降至-50 ℃時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用無(wú)紙記錄儀記錄不同工況下的溫度變化，應(yīng)用圖像采集系統(tǒng)記錄血漿降溫過(guò)程，應(yīng)用顯微鏡觀察血漿凍結(jié)情況。

1.4 血漿品質(zhì)指標(biāo)檢測(cè)

使用試劑盒檢測(cè)豬血漿FVII活性，試劑盒由武漢純度生物實(shí)驗(yàn)提供。檢測(cè)方法由ATPP進(jìn)行改進(jìn)并分析[18]。FVII試劑盒可通過(guò)OD值對(duì)比來(lái)測(cè)定血漿中FVII的缺乏程度。實(shí)驗(yàn)通過(guò)FVII顯色程度，測(cè)定部分酶的活酶時(shí)間，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線與對(duì)應(yīng)濃度計(jì)算FVII活性濃度。與新鮮冰凍血漿FVII活性進(jìn)行對(duì)比，分析血漿品質(zhì)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論分析

2.1 不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下的血漿速凍溫度變化

實(shí)驗(yàn)使用血漿瓶放置豬血漿進(jìn)行凍結(jié)實(shí)驗(yàn)，由于血漿瓶?jī)?nèi)空間較窄，瓶身各點(diǎn)溫度差異不顯著，因此只選取測(cè)溫點(diǎn)1進(jìn)行血漿速凍溫度實(shí)驗(yàn)分析。

在不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下(f=50 Hz AC、DC)血漿速凍降溫變化如圖3所示，血漿凍結(jié)相變時(shí)間如圖4所示。分析圖3可知，在DC磁場(chǎng)下降溫速率的大小順序依次為：20 Gs<40 Gs<60 Gs=80 Gs=100 Gs。其中未施加磁場(chǎng)的血漿降溫速率介于40～60 Gs之間，100 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下的降溫與其他磁場(chǎng)強(qiáng)度相比降溫略緩慢。

圖3 0～100 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下血漿中心凍結(jié)溫度變化Fig.3 Variation of plasma central freezing temperature at magnetic field strength of 0-100 Gs

分析出現(xiàn)該現(xiàn)象可能的原因是：低于40 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)于血漿的傳熱傳質(zhì)過(guò)程幾乎無(wú)影響，不能有效提高過(guò)冷度，相變時(shí)間延長(zhǎng)(圖4)，從而導(dǎo)致血漿降溫速率延緩。40～60 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下可顯著提高過(guò)冷度，冷卻速度較快，可以提高血漿降溫速率，大于60 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下，降溫速率略低于60 Gs，由于溫差不斷縮小，不同的磁場(chǎng)強(qiáng)度不再影響凍結(jié)。在AC磁場(chǎng)下血漿降溫曲線差異性不顯著。可能是由于較低AC磁場(chǎng)強(qiáng)度下對(duì)血漿速凍過(guò)程不起作用。(注：由于后續(xù)對(duì)血漿在進(jìn)行AC磁場(chǎng)下凍結(jié)溫度測(cè)定后發(fā)現(xiàn)溫度變化在AC磁場(chǎng)作用下變化并不顯著，因此，在后續(xù)結(jié)果分析中，如無(wú)特殊情況說(shuō)明，選取實(shí)驗(yàn)差異性分析數(shù)據(jù)均為DC磁場(chǎng)下測(cè)量所得。)

圖4 0～100 Gs磁場(chǎng)下血漿凍結(jié)相變時(shí)間Fig.4 Plasma freezing phase change time under 0～100 Gs magnetic field

2.2 磁場(chǎng)作用下冰晶結(jié)構(gòu)圖像分析

實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同磁場(chǎng)強(qiáng)度作用顯微鏡下血漿分子凍結(jié)過(guò)程，通過(guò)觀察血漿中水分凍結(jié)以及冰晶大小與形態(tài)分布情況，從微觀層面探究磁場(chǎng)對(duì)血漿凍結(jié)的影響，在顯微鏡拍攝過(guò)程中，拍攝圖片較多且未凍結(jié)時(shí)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不清晰，所以0～100 Gs下的血漿水分子形態(tài)對(duì)比選取凍結(jié)溫度為-50 ℃時(shí)的圖片進(jìn)行比對(duì)并標(biāo)定標(biāo)尺，標(biāo)尺尺寸為10 μm。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置降溫速率為2 ℃/min，初始溫度為25 ℃，目標(biāo)凍結(jié)溫度為-50 ℃，拍攝間隔為10 s。DC磁場(chǎng)不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下血漿凍結(jié)對(duì)比如圖5所示，圖中橢圓或圓圈部分為顯微鏡可見(jiàn)部分最大尺寸冰晶結(jié)構(gòu)，通過(guò)觀察0～100 Gs下的冰晶分子結(jié)構(gòu)可得：0 Gs時(shí)，血漿分子凍結(jié)后的冰晶直徑較大，冰晶形狀多呈橢圓形或菱形，由于更大冰晶，在冰晶間隔中，會(huì)擠壓血漿其他物質(zhì)，從而造成血漿冰晶結(jié)構(gòu)的不完整性。在20、40 Gs時(shí)，血漿冰晶體積減小，出現(xiàn)更小冰晶;在60、80 Gs時(shí)，相比之前細(xì)小冰晶增加，且結(jié)構(gòu)更加精細(xì)，說(shuō)明該磁場(chǎng)強(qiáng)度下效果作用顯著。雖然在100 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下凍結(jié)血漿結(jié)構(gòu)也可以看出磁場(chǎng)作用下結(jié)果，但小冰晶數(shù)量相比之前并不顯著，相比于60、80 Gs，數(shù)量減少。同時(shí)，在相變過(guò)程中，施加磁場(chǎng)的冰晶數(shù)量明顯多于未加磁場(chǎng)的數(shù)量。

圖5 DC磁場(chǎng)不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下血漿凍結(jié)對(duì)比Fig.5 Comparison of plasma freezing under different magnetic field strengths of DC magnetic fields

血漿中冰晶在磁場(chǎng)作用下主要發(fā)生形態(tài)和大小兩種變化，通過(guò)顯微鏡觀察，記錄冰晶結(jié)構(gòu)變化。通過(guò)公式對(duì)磁場(chǎng)作用下冰晶結(jié)構(gòu)進(jìn)行量化以便準(zhǔn)確分析磁場(chǎng)作用對(duì)血漿品質(zhì)的影響。冰晶尺寸計(jì)算式如下：

當(dāng)量直徑：

(1)

d圓=dc

(2)

冰晶面積：

(3)

(4)

式中：da為橢圓冰晶長(zhǎng)軸，μm；db為橢圓冰晶短軸，μm；dc為圓冰晶直徑，μm。

不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下血漿冰晶尺寸參數(shù)如表2所示，各磁場(chǎng)強(qiáng)度下的冰晶尺寸參數(shù)計(jì)算驗(yàn)證了上述結(jié)論。

表2 各磁場(chǎng)強(qiáng)度下血漿冰晶尺寸參數(shù)Tab.2 Size parameters of plasma ice crystals under different magnetic field intensities

以磁場(chǎng)強(qiáng)度0 Gs和60 Gs凍結(jié)最大冰晶尺寸為例(圖6)，磁場(chǎng)強(qiáng)度為0 Gs時(shí)，冰晶呈現(xiàn)明顯的橢圓形，凍結(jié)最大冰晶尺寸最大，相比于60 Gs時(shí)，當(dāng)量直徑提升58%，冰晶面積S增加2.5倍。磁場(chǎng)作用下，0～60 Gs冰晶尺寸呈減小趨勢(shì)，60 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下冰晶當(dāng)量直徑最小，面積最小，形狀規(guī)則。80～100 Gs形狀較規(guī)則呈圓形，冰晶尺寸比60 Gs時(shí)呈增加趨勢(shì)，但與未施加磁場(chǎng)相比冰晶尺寸減小。

圖6 0 Gs和60 Gs凍結(jié)最大冰晶尺寸Fig.6 Maximum ice crystal size of 0 Gs and 60 Gs freezing

2.3 輔助磁場(chǎng)下各磁場(chǎng)強(qiáng)度血漿FVIII活性檢測(cè)

對(duì)于豬血漿FVIII的測(cè)定，與蛋白含量的測(cè)定步驟相似，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)的血漿OD值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出FVIII活性濃度，最后再乘以測(cè)量前稀釋血漿倍數(shù)。0～100 Gs下速凍血漿實(shí)際FVIII活性濃度與新鮮豬血漿FVIII活性濃度對(duì)比如圖所示。

對(duì)照組(未施加磁場(chǎng)且未進(jìn)行速凍)血漿FVII活性濃度最高，F(xiàn)VIII活性濃度為1.267 IU/mL。血漿凍結(jié)后，在20 Gs磁場(chǎng)作用下，活性降低26.46%，在60 Gs下的血漿活性濃度數(shù)值最大，距離原始FVIII活性濃度最接近，速凍保存后的血漿品質(zhì)效果最優(yōu)。說(shuō)明磁場(chǎng)輔助速凍會(huì)影響血漿活性，且不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下的速凍會(huì)對(duì)血漿品質(zhì)產(chǎn)生不同影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得不同磁場(chǎng)強(qiáng)度下的冰凍血漿品質(zhì)優(yōu)劣順序?yàn)椋?0 Gs>80 Gs>100 Gs>20 Gs>40 Gs。

圖7 0～100 Gs磁場(chǎng)作用后豬血漿FVIII活性濃度對(duì)比Fig.7 Comparison of plasma coagulation FVIII in pigs exposed to 0～100 Gs magnetic field

3 結(jié)論

本文在原有凍結(jié)方式基礎(chǔ)上施加磁場(chǎng)輔助凍結(jié)，研究0～100 Gs磁場(chǎng)下血漿瓶?jī)?nèi)不同測(cè)點(diǎn)血漿凍結(jié)過(guò)程的降溫曲線，實(shí)驗(yàn)分析0～100 Gs血漿凍結(jié)的分子結(jié)構(gòu)變化，得到如下結(jié)論：

1)不同磁場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)血漿凍結(jié)速率的影響：低于40 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度導(dǎo)致血漿降溫速率延緩；在40～60 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下可顯著提高血漿降溫速率；在大于60 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下，不同的磁場(chǎng)強(qiáng)度不再影響凍結(jié)。在AC磁場(chǎng)下血漿降溫曲線差異性不顯著。

2)磁場(chǎng)影響主要體現(xiàn)在血漿凍結(jié)過(guò)程中的相變階段，磁場(chǎng)的存在使更多的分子簇很快達(dá)到最小臨界半徑尺寸，從而使結(jié)晶更容易發(fā)生，更快誘發(fā)相變。血漿在60 Gs磁場(chǎng)強(qiáng)度下凍結(jié)時(shí)，產(chǎn)生的冰晶更加細(xì)小且形狀規(guī)則，說(shuō)明磁場(chǎng)會(huì)影響成核冰晶的大小和形狀。

3)添加磁場(chǎng)輔助凍結(jié)下的血漿FVIII活性濃度均出現(xiàn)不同程度的降低，其中在20 Gs下最大降低3.56%，在60、80 Gs磁場(chǎng)作用下的活性濃度相對(duì)其他磁場(chǎng)強(qiáng)度更高，速凍保存后的血漿品質(zhì)更好。