酒精對(duì)人臍靜脈間充質(zhì)干細(xì)胞治療腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松癥大鼠的影響＊

呂航 李小冬 劉宏鵬 王順 宿慧

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是骨密度及骨質(zhì)量降低，骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞的一種疾病[1]。酒精對(duì)骨密度和骨量存在較大影響[2]；酒精能對(duì)骨組織的異常代謝進(jìn)行誘導(dǎo)，對(duì)成骨-破骨平衡進(jìn)行破壞[3]。但目前尚未清楚酒精作用在哪個(gè)階段來(lái)影響B(tài)MSCs抑成骨/促成脂分化的能力。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，酒精性骨質(zhì)疏松癥，以腎虛血瘀為主要病機(jī)，以補(bǔ)腎活血法主之[4]。人臍靜脈間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical vein mesenchymal stem cells，hUV-MSCs）來(lái)源豐富，具有減輕和消除炎癥、修復(fù)組織損傷等多種生物學(xué)功能，已越來(lái)越多地應(yīng)用于器官損傷的治療[5]。以往研究顯示酒精對(duì)腎虛血瘀型OP的治療有消極作用[6]，但關(guān)于酒精對(duì)hUV-MSCs治療腎虛血瘀型OP分子機(jī)制方面的研究少見(jiàn)?；诖吮狙芯繉⑼ㄟ^(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康4周齡SD雄性大鼠40只，大鼠重量240～260 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（黑）2019-0004。

1.2 試劑、設(shè)備與細(xì)胞株

試劑：75%醫(yī)用酒精（生產(chǎn)廠家：山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：魯衛(wèi)消證字2015第1603號(hào)，配置為20%濃度）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京博奧派克生物科技有限公司。

儀器：酶標(biāo)儀（生產(chǎn)廠家：上海賽默科技生物發(fā)展有限公司，型號(hào)：DP-6100）；-80 ℃超低溫冰箱（生產(chǎn)廠家：日本SANYO三洋電機(jī)，型號(hào)：MDF-C8V）；光學(xué)顯微鏡（生產(chǎn)廠家：日本奧林巴斯，型號(hào)：STT-300）；熒光顯微鏡（生產(chǎn)廠家：日本奧林巴斯，型號(hào)：LF50）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（生產(chǎn)廠家：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)：H2050R）。

細(xì)胞株：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞hUV-MSCs，購(gòu)自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物造模及分組

采用酒精腹腔注射法制備腎虛血瘀型OP大鼠模型，造模成功后將SD大鼠隨機(jī)分為酒精組、治療組和對(duì)照組，每組10只。酒精組尾靜脈注射酒精 [20%，10 ml/（kg·次），1次 /周 ]，對(duì)照組在酒精組基礎(chǔ)上尾靜脈注射hUV-MSCs（1次/周，107個(gè)細(xì)胞/次），治療組停止酒精注射但尾靜脈注射注射 hUV-MSCs（1次 /周，107個(gè)細(xì)胞 /次）；取SD大鼠10只腹腔注射法生理鹽水作為假手術(shù)組，尾靜脈注射生理鹽水 [10 ml/（kg·次），1次 /周 ]。四組均連續(xù)治療8周。

1.4 觀察指標(biāo)

處死大鼠后，取大鼠腰椎骨進(jìn)行以下檢測(cè)：（1）采用HE染色對(duì)大鼠骨組織的病理?yè)p傷情況進(jìn)行檢測(cè)，觀察骨小梁面積變化。（2）采用TUNEL染色檢測(cè)觀察骨組織細(xì)胞凋亡情況，熒光顯微鏡觀察FITC標(biāo)記的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞并拍照。（3）采用醫(yī)學(xué)顯微CT檢測(cè)骨組織的骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume fraction，BVF）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）和骨小梁分離距離（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）。（4）采用 ELISA 檢測(cè)血清ALP和TRAP水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組骨組織病理?yè)p傷的比較

假手術(shù)組、酒精組、對(duì)照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積分別為（71.25±3.64）%、（38.19±2.57）%、（52.10±2.76）%、（56.31±2.90）%，四組大鼠骨組織骨小梁面積比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=206.5，P＜0.05）。酒精組、對(duì)照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積均小于假手術(shù)組（P＜0.05），治療組與對(duì)照組大鼠骨組織骨小梁面積均大于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨組織骨小梁面積大于對(duì)照組（P＜0.05）。四組大鼠骨組織病理學(xué)HE染色情況，見(jiàn)圖1。

圖1 四組大鼠骨組織病理學(xué)HE染色情況（×100）

2.2 四組骨組織細(xì)胞凋亡情況比較

假手術(shù)組、酒精組、對(duì)照組、治療組大鼠骨組織 TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為（5.16±1.08）、（36.29±2.43）、（27.18±2.05）、（24.71±2.36），四組比較大鼠骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=407.5，P＜0.05）。酒精組、對(duì)照組、治療組大鼠骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均多于假手術(shù)組（P＜0.05），治療組與對(duì)照組大鼠骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均少于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組（P＜0.05）。四組大鼠骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞熒光顯色圖片，見(jiàn)圖2。

圖2 四組大鼠骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞熒光顯色圖片（×200）

2.3 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較

四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。酒精組、對(duì)照組、治療組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均低于假手術(shù)組（P＜0.05），Tb.Sp均高于假手術(shù)組（P＜0.05）；治療組與對(duì)照組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均高于酒精組（P＜0.05），Tb.Sp均低于酒精組（P＜0.05）；治療組大鼠骨組織BVF、Tb.Th均高于對(duì)照組（P＜0.05），Tb.Sp低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表 1。

表1 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較（±s）

表1 四組骨組織BVF、Tb.Th和Tb.Sp比較（±s）

*與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#與酒精組比較，P＜0.05；△與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別 BVF（%） Tb.Th（mm） Tb.Sp（mm）假手術(shù)組（n=10） 31.60±2.98 0.079±0.003 0.13±0.04酒精組（n=10） 8.42±1.05* 0.034±0.002* 0.65±0.07*對(duì)照組（n=10） 17.53±2.14*# 0.048±0.005*# 0.54±0.06*#治療組（n=10） 20.90±2.36*#△ 0.060±0.007*#△ 0.26±0.03*#△F值 175.8 167.2 235.0 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 四組血清ALP和TRAP水平比較

四組血清ALP與TRAP水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。酒精組、對(duì)照組、治療組大鼠血清ALP與TRAP水平均高于假手術(shù)組（P＜0.05），治療組與對(duì)照組大鼠血清ALP與TRAP水平均低于酒精組（P＜0.05），治療組大鼠骨血清ALP與TRAP水平均低于對(duì)照組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 四組血清ALP和TRAP水平比較（±s）

表2 四組血清ALP和TRAP水平比較（±s）

*與假手術(shù)組比較，P＜0.05；#與酒精組比較，P＜0.05；△與對(duì)照組比較，P＜0.05。

組別 ALP（U/L） TRAP（pg/ml）假手術(shù)組（n=10） 17.36±2.48 14.30±1.69酒精組（n=10） 60.17±3.95* 35.72±3.68*對(duì)照組（n=10） 41.60±2.72*# 26.47±2.16*#治療組（n=10） 33.80±2.49*# △ 21.05±2.24*# △F值 357.5 125.6 P 值 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

酒精性O(shè)P是繼發(fā)性O(shè)P，是指因人體長(zhǎng)期大量飲酒引起骨量丟失，骨微觀結(jié)構(gòu)退化致使骨脆性增加的一種全身性骨骼疾病[6]。長(zhǎng)期慢性飲酒可致多種疾病發(fā)生，酒精可干擾骨代謝，損害骨骼系統(tǒng)引起骨質(zhì)疏松，導(dǎo)致骨折，為家庭帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。hUV-MSC能分化成為中胚層間質(zhì)組織，具備自我更新及多向分化的潛能。hUV-MSCs來(lái)源豐富、取材操作方便、不涉及倫理學(xué)問(wèn)題，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖活性[8]。國(guó)外學(xué)者通過(guò)構(gòu)建骨質(zhì)疏松性下頜骨壞死大鼠模型，探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果，結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松性下頜骨壞死大鼠骨再生明顯增強(qiáng)，成骨細(xì)胞數(shù)量增高[9]。

以往有研究顯示，長(zhǎng)期酒精攝入可導(dǎo)致大鼠骨小梁數(shù)量減少、間隙增大、厚度降低，使骨骼彈性模量、最大載荷及破壞載荷等生物力學(xué)性能降低，骨骼抵抗外力性能下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[10]；還有研究顯示，酒精可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞ROS水平及自噬水平升高，抑制成骨而促進(jìn)成脂分化[11]。本研究結(jié)果顯示，酒精組、對(duì)照組、治療組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均低于假手術(shù)組，骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均高于假手術(shù)組（P＜0.05）；治療組與對(duì)照組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均高于酒精組，骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于酒精組（P＜0.05）；治療組大鼠骨組織骨小梁面積、BVF、Tb.Th均高于對(duì)照組，骨組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、Tb.Sp及血清ALP、TRAP水平均低于對(duì)照組（P＜0.05）。提示酒精對(duì)hUV-MSCs治療OP大鼠有消極的影響。ALP是堿性磷酸的一種同工酶，由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，是成骨細(xì)胞成熟和具有活性的標(biāo)志，對(duì)了解成骨細(xì)胞的狀態(tài)有重要意義。隨著OP病情的進(jìn)展ALP水平逐漸升高，表明其與骨質(zhì)疏松有密切的關(guān)系[12-13]。TRAP過(guò)度表達(dá)的大鼠模型表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松。骨吸收時(shí)，破骨細(xì)胞附著在骨的表面，分泌的酸和蛋白酶在骨基質(zhì)與破骨細(xì)胞之間形成一個(gè)空隙，磷酸酐酶和H+-ATP酶質(zhì)子泵形成一個(gè)酸性環(huán)境，位于破骨細(xì)胞微粒體TRAP，即通過(guò)破骨細(xì)胞波狀緣分泌進(jìn)入此空隙，與其他酶一起參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化物的降解[14-15]。

綜上所述，酒精影響hUV-MSCs成骨/成脂分化平衡，進(jìn)而影響了其在腎虛血瘀型OP中的治療效果。