抗馬鏈球菌馬亞種組方加味優(yōu)選及其體內(nèi)抑菌作用研究

朱怡萱，劉詩芃，張 偉，李金榮，彭 菲，林 娜，王語嫣，劉丹丹

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.滿洲里海關(guān)技術(shù)中心，滿洲里 021400)

馬腺疫是一種以呼吸道感染、咽后淋巴結(jié)膿腫為特征的馬屬動(dòng)物傳染病[1],馬鏈球菌馬亞種作為其主要致病菌，最早于1888年被分離鑒定，屬于蘭氏分群C群β溶血型鏈球菌，革蘭氏染色呈紫色，單個(gè)菌體呈圓球狀，通常成對(duì)或短鏈狀存在，在含有5%綿羊血清的培養(yǎng)基上生長良好，有明顯的β溶血環(huán)[2]。馬鏈球菌馬亞種傳染性極強(qiáng)，導(dǎo)致馬腺疫的發(fā)病率居高不下[3]，其發(fā)病是否與季節(jié)相關(guān)，目前仍存在爭議，因?yàn)楦鲊幍臍夂驇Р煌?，英國、印度的氣候?qū)︸R鏈球菌馬亞種流行影響較小[4-5]，在加拿大其冬季發(fā)病率高[6-7]，在巴基斯坦早春發(fā)病率高[8]，在中國每年的9月至來年4月期間發(fā)病率高[9]。從2015至2017年的血清學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，新疆地區(qū)每年廠區(qū)馬腺疫的陽性率均可達(dá)20%以上[10-13]，對(duì)當(dāng)?shù)伛R養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，馬腺疫治療主要采取抗生素結(jié)合排膿的方法進(jìn)行，但因長期使用抗生素造成菌株耐藥、食品安全等一系列公共衛(wèi)生問題[10，14]。因此尋找一種療效好、低殘留的天然藥物迫在眉睫[15]。

馬腺疫在中國流行時(shí)間可追溯甚遠(yuǎn)，在諸多馬病名著中均有記載，書中也描述了馬腺疫的病因癥候?！对喁燅R集》中記載“因蓄養(yǎng)失調(diào)，喂飲無節(jié)，春不抽六脈之血，夏失灌清涼之藥，以致氣血太盛，熱積心胸，傳之與咽喉，故成其患[16]?！庇纱丝芍R腺疫主要是因?yàn)樾男胤e熱、氣血紊亂所致。目前對(duì)于馬腺疫的治則是“泄心肺、清咽喉、補(bǔ)氣養(yǎng)血”[17]，圍繞該治則也有相應(yīng)的中藥組方，如：黃芪散[18]、仙方活命飲[18]、清咽利膈湯[18]、閻超山祖?zhèn)髅胤絒19]、加味黃茂散[20]、六神青黛散(含服)[21]等，但多為臨床經(jīng)驗(yàn)自擬，存在以下幾個(gè)問題：試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量有限，治療效果不具有代表性；中藥組方毒性不明確；最佳給藥濃度無定值；這些因素導(dǎo)致上述組方并沒有在臨床治療上廣泛應(yīng)用，使其在國內(nèi)外的推廣應(yīng)用面臨巨大困難?；诖?，本研究根據(jù)中獸醫(yī)辨證理論，選取了多味具有涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、降熱止咳、安神止痛、益氣養(yǎng)血的中藥，通過中藥對(duì)馬腺疫主要致病菌——馬鏈球菌馬亞種的體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及模型動(dòng)物(小鼠)體內(nèi)抑菌試驗(yàn)，篩選治療馬腺疫的最佳組方，以期為臨床選用中獸藥治療馬腺疫提供參考，為中獸藥研發(fā)及相關(guān)的馬屬動(dòng)物疾病基礎(chǔ)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 標(biāo)準(zhǔn)菌株：馬鏈球菌馬亞種(Streptococcusequisubspeciesequi，S.equi)(ATCC9528)由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；試驗(yàn)菌株：馬鏈球菌馬亞種是由昭蘇地區(qū)患馬腺疫馬匹的鼻拭子中分離得到的強(qiáng)毒株。

1.1.2 動(dòng)物 80只6周齡SPF級(jí)昆明小鼠，體重為20 g±2 g，雌雄各半，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(【SCXK(新)2018-0002】【SYXK(新)2018-0003】)，飼養(yǎng)于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)期間各組小鼠自由飲水，飼喂Co60輻照實(shí)驗(yàn)鼠維持飼料(美迪森生物【蘇飼證(2018)10030】)。飼養(yǎng)環(huán)境：恒溫恒濕，所有操作均符合新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理要求(審批號(hào)：2019018)。

1.1.3 藥材 浙貝母(2109158)、大黃(2201080)、苦參(2104064)、山豆根(2010158)、赤芍(2112073)、甘草(2112171)、蒲公英(2111031)、知母(2110073)、黃芩(2112083)、雪白睡蓮(2106051)、黃連(2110039)、荊芥(2111100)、薄荷(2110083)、射干(2109143)、連翹(2111051)、黃藥子(2010136)、苦楝皮、白芷(2109133)、黃柏(2111074)、梔子(2108054)、天花粉(2108021)、桔梗(2108049)、金銀花(2110129)、黃芪(2202012)、防風(fēng)(2201113)、地丁(2107029)、白蘞(2012198)27味中藥均購自新疆烏魯木齊尚德堂大藥房；藥敏片(20100290)購自杭州濱河微生物試劑有限公司；氨芐西林鈉(H23020927)購自哈藥集團(tuán)制藥總廠。

1.1.4 主要試劑及儀器 瓊脂粉、THB培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。麥?zhǔn)媳葷峁苜徸灾楹Ｘ愃魃锛夹g(shù)有限公司；恒溫水浴鍋(HH-W420)購自上海亞榮生化儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52)購自上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫振蕩器(THZ-C)購自上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱(DHP-9082D)購自北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 中藥水提物的制備 27味藥材均采用如下方法處理：稱取40 g藥材，粉碎后按1∶15料液比加入蒸餾水，室溫浸泡2 h，95 ℃回流提取2 h，倒出提取液，再按1∶10料液比加入蒸餾水95 ℃回流提取2 h；合并2次提取液，4 000 r/min離心10 min，抽濾，濃縮藥液至4 g/mL，冷卻后置4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備 將保存的純化馬鏈球菌馬亞種接種于THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)后續(xù)不同試驗(yàn)需要依據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲瞥上鄳?yīng)所需濃度，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)菌敏感的單味中藥篩選 采用牛津杯法[22]進(jìn)行篩選。吸取100 μL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期、濃度為1×106CFU/mL的菌液加入TSA培養(yǎng)基表面，用玻璃涂布棒涂布均勻。定點(diǎn)放置牛津杯6個(gè)，將27味濃度為1 g/mL的中藥水提物分別取200 μL加入牛津杯中，27味藥均設(shè)3個(gè)平行。以青霉素、環(huán)丙沙星藥敏片作為陽性對(duì)照，生理鹽水作為陰性對(duì)照。37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈直徑(R)，R≥15 mm為極敏；10 mm≤R<15 mm為高敏；8 mm≤R<10 mm為低敏；R<8 mm為不敏感[22]。

1.2.4 敏感單味中藥最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)測定 采用美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的微量肉湯稀釋法[23]，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，校準(zhǔn)濃度至1×106CFU/mL。取100 μL濃度為1 g/mL的敏感單味中藥水提物，在96孔板中用THB液體培養(yǎng)基以2倍稀釋法至藥液終濃度為0.001 g/mL，每孔中加入稀釋好的菌液10 μL。只加菌液作為陽性對(duì)照，加藥不加菌作為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)18～24 h。在培養(yǎng)完成后，向其中加入5 g/L氯化三苯四氮唑(TTC)[22]。當(dāng)孔內(nèi)不顯示紅色時(shí)，細(xì)菌生長的最低藥物濃度為MIC。將所有無菌生長的孔內(nèi)液體以涂布法接種于THB瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，以菌落不超過5個(gè)為該單藥的MBC。

1.2.5 敏感單味中藥聯(lián)合藥敏(FIC)指數(shù)測定 采用微量棋盤稀釋法[24]，將單味敏感藥物兩兩組合，用無菌96孔板延X軸方向1～7行每孔依次加入THB肉湯、1/16 MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC、2 MIC的甲藥水提物各50 μL，延Y軸A-G列每孔依次加入2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC的乙藥水提物和THB肉湯各50 μL，每孔加入稀釋好的菌液100 μL，混勻后蓋上板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)完成后加入氯化三苯四氮唑(TTC)觀察細(xì)菌生長情況，計(jì)算FIC指數(shù)。FIC指數(shù)=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用[25]。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次進(jìn)行質(zhì)控菌株的檢測。判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC指數(shù)≤0.5時(shí)兩藥為協(xié)同作用，0.52.0時(shí)兩藥為頡頏作用[22]。

1.2.6 抗馬鏈球菌馬亞種基礎(chǔ)組方藥物主次作用測定 根據(jù)各單味藥物之間的FIC結(jié)果，將篩選出的6味藥物設(shè)置加藥和不加藥2個(gè)水平，分別用1和2表示，再按照L8(26)正交設(shè)計(jì)配制相應(yīng)的8種組方溶液(分別為試驗(yàn)1、2、3、4、5、6、7、8組)，采用牛津杯法，測量8種組方溶液對(duì)馬鏈球菌馬亞種的抑菌圈直徑。試驗(yàn)結(jié)果采用極差分析法統(tǒng)計(jì),初步篩選出能夠抑制馬鏈球菌馬亞種的優(yōu)選因素。

1.2.7 抗馬鏈球菌馬亞種基礎(chǔ)組方劑量優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)1.2.6的試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)優(yōu)選出的6個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平(1、0.5、0.25 g/mL)，分別用1、2和3表示，再按照L18(36)正交設(shè)計(jì)，配制18種組方溶液(分別為試驗(yàn)1～18組)，測量每組抑菌圈直徑，每組平行測定3次，篩選出能夠抑制馬鏈球菌馬亞種的最佳劑量組合，即得到基礎(chǔ)組方的最優(yōu)配比。

1.2.8 抗馬鏈球菌馬亞種加味組方體內(nèi)抑菌試驗(yàn) 根據(jù)中獸醫(yī)方劑配伍理論，將基礎(chǔ)組方中的6味單藥按優(yōu)選濃度分別與不同配比、濃度的補(bǔ)虛藥(黃芪、當(dāng)歸)等體積混勻，分為8組(表1)。將80只昆明小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，每組每天均按照0.01 mL/g體重的藥量灌胃1次，連續(xù)給藥5 d，陰性對(duì)照組灌服等體積的生理鹽水，陽性對(duì)照組灌服等體積2 mg/mL氨芐西林鈉[26]。第5天灌胃1 h后，除空白對(duì)照組不做處理外，其余各組小鼠均腹腔注射0.5 mL濃度為0.8×109CFU/mL即80%最小致死量(MLD)[27-30]的馬鏈菌液，進(jìn)行馬腺疫小鼠模型的構(gòu)建。攻毒后通過觀察小鼠臨床癥狀，以肺臟出現(xiàn)充血及炎性細(xì)胞浸潤的病理變化作為模型建立的判定標(biāo)準(zhǔn)[29-30]。再按上述給藥方法連續(xù)灌胃2 d，其中空白對(duì)照組不作處理。在給藥第7天，計(jì)算每組小鼠存活數(shù)、死亡數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算保護(hù)率[31]。保護(hù)率(%)=(陰性對(duì)照組死亡數(shù)―處理(給藥)組死亡數(shù))/陰性對(duì)照死亡數(shù)×100%。同時(shí)將每組未死亡小鼠脫頸處死，采集肺臟組織，于4%多聚甲醛中固定后進(jìn)行切片染色，觀察病理組織學(xué)變化。

表1 小鼠體內(nèi)抑菌試驗(yàn)分組及給藥情況Table 1 Grouping and administration of in vivo antibacterial test in mice

2 結(jié) 果

2.1 馬鏈球菌馬亞種的敏感中藥篩選結(jié)果

通過牛津杯法測定27味中藥水提物對(duì)馬鏈球菌馬亞種抑菌效果如表2所示。由表2可知，馬鏈球菌馬亞種對(duì)浙貝母、大黃、苦參、山豆根、赤芍、甘草、蒲公英、知母極度敏感；對(duì)黃芩、雪白睡蓮、黃連、荊芥、薄荷、射干、連翹、黃藥子、苦楝皮、白芷、黃柏高度敏感；梔子、天花粉、桔梗、金銀花、黃芪、防風(fēng)、地丁、白蘞對(duì)其無抑菌作用，最終選擇浙貝母、大黃、苦參、山豆根、赤芍、甘草、雪白睡蓮開展后續(xù)試驗(yàn)。

表2 不同中藥對(duì)馬鏈球菌馬亞種的抑菌圈直徑Table 2 Diameter of inhibition zone of different herbs against Streptococcus equi subspecies equimm

2.2 敏感單味中藥MIC及MBC測定結(jié)果

通過微量肉湯稀釋法測定各敏感單味中藥的MIC及MBC，結(jié)果見表3。由表3可知，大黃和雪白睡蓮的MIC最小，均為0.078 g/mL，提示其抑菌作用最強(qiáng)，其次是山豆根、甘草、苦參，最后為浙貝母、赤芍。雪白睡蓮的MBC最小，為0.078 g/mL，其次是赤芍和山豆根，然后為甘草、大黃、苦參和浙貝母。

表3 敏感單味中藥MIC及MBC測定結(jié)果Table 3 Determination of MIC and MBC of single sensitive herbs g/mL

2.3 敏感單味中藥FIC測定結(jié)果

由聯(lián)合藥敏指數(shù)公式計(jì)算得出各敏感中藥間的FIC指數(shù)，發(fā)現(xiàn)浙貝母和雪白睡蓮的FIC指數(shù)>2.00，提示二者有頡頏作用，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果綜合考慮刪減浙貝母，用剩余6味單藥開展后續(xù)試驗(yàn)。

表4 敏感單味中藥FIC測定結(jié)果Table 4 Determination of FIC of single sensitive herbs

2.4 抗馬鏈球菌馬亞種基礎(chǔ)組方單味中藥主次作用結(jié)果

極差法分析結(jié)果表明，在基礎(chǔ)組方中各因素抗馬鏈球菌馬亞種的作用主次順序?yàn)椋嚎鄥?大黃>雪白睡蓮>甘草>赤芍、山豆根，即組方中抑制馬鏈球菌馬亞種效果最佳的是苦參，其次是大黃、雪白睡蓮、甘草，最后是赤芍、山豆根(表5)。

表5 敏感藥物對(duì)馬鏈球菌馬亞種的抑菌效果主次作用分析Table 5 Primary and secondary effect analysis of antibacterial effect of sensitive drugs against Streptococcus equi subspecies equi

續(xù)表

2.5 抗馬鏈球菌馬亞種基礎(chǔ)組方劑量優(yōu)化結(jié)果

采用極差分析法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，得出基礎(chǔ)組方最佳配比組合為赤芍∶甘草∶大黃∶雪白睡蓮∶山豆根∶苦參=4∶2∶2∶4∶4∶1。

表6 優(yōu)選因素各組合對(duì)馬鏈球菌馬亞種抑菌作用結(jié)果Table 6 Bacteriostasis results for each combination of preferred factors against Streptococcus equi subspecies equi

2.6 抗馬鏈球菌馬亞種加味組方配比優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 抗馬鏈球菌馬亞種加味組方體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果 由表7可知，與模型組相比，各藥物組小鼠體內(nèi)抑菌試驗(yàn)保護(hù)率明顯增加，其中加味組方Ⅱ組(87.5%)=陽性對(duì)照組(87.5%)>加味組方Ⅲ組(62.5%)>加味組方Ⅰ組(37.5%)>加味組方Ⅳ組(25%)>基礎(chǔ)組方組(25%)，由此可知加味組方Ⅱ組為抗馬鏈球菌馬亞種最優(yōu)組合。

表7 加味組方體內(nèi)抑菌保護(hù)率Table 7 In vivo antibacterial protection rate of modified formula

2.6.2 各組小鼠肺臟病理組織學(xué)變化結(jié)果 由圖1可知，空白對(duì)照組肺臟結(jié)構(gòu)完整，肺泡無充血和炎性細(xì)胞，肺泡腔無滲出(圖1A)；加味組方Ⅰ組在第7天灌胃結(jié)束后，肺臟結(jié)構(gòu)完整，但肺泡腔中有大量滲出物(圖1B)；加味組方Ⅱ組在第7天灌胃結(jié)束后，肺臟結(jié)構(gòu)完整，染色均勻，修復(fù)良好(圖1C)；加味組方Ⅲ組在第7天灌胃結(jié)束后，肺泡壁依舊有嚴(yán)重的充血及炎性細(xì)胞浸潤(圖1D)；加味組方Ⅳ組、基礎(chǔ)組方組在第7天灌胃結(jié)束后，肺泡壁依舊有少量炎性細(xì)胞浸潤(圖1E、1F)；陰性對(duì)照組在第7天灌胃結(jié)束后，肺泡壁充血且有炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔中有漿液性滲出混有少量的紅細(xì)胞及脫落的上皮細(xì)胞(圖1G)；陽性對(duì)照組在第7天灌胃結(jié)束后，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，有炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔體積縮小(圖1H)。

①A～H，分別代表空白對(duì)照組、加味組方Ⅰ組、加味組方Ⅱ組、加味組方Ⅲ組、加味組方Ⅳ組、基礎(chǔ)組方、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組。②a，脫落的上皮細(xì)胞和漿液性分泌物；b，炎性細(xì)胞浸潤；c，恢復(fù)正常的肺泡；d、e，嚴(yán)重充血和炎性細(xì)胞浸潤 ①A-H,Blank control group,modified formula group Ⅰ,modified formula group Ⅱ,modified formula group Ⅲ,modified formula group Ⅳ,basic formula,negative control group and positive control group,respectively.②a,Sloughed epithelial cells and serous secretions;b,Inflammatory cell infiltrates;c,Normal alveoli;d and e,Severe hyperemia and inflammatory cell infiltration圖1 各組肺臟病理切片觀察(HE染色，100×)Fig.1 Observation of lung pathological sections of each group (HE staining,100×)

3 討 論

目前研究結(jié)果表明，在中國的新疆北部地區(qū)、加拿大、埃及均出現(xiàn)了馬鏈球菌馬亞種對(duì)β內(nèi)酰胺類、萬古霉素普遍耐藥的現(xiàn)象[32-36]，尋找一種替代療法迫在眉睫。中藥來源于植物、動(dòng)物或礦物，耐藥性低、毒性低以及副作用小，現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)?；诖?，本試驗(yàn)根據(jù)馬腺疫治療原則以及“十八反、十九畏”[11,37-38]選取了27味中藥，首先開展了體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示馬鏈球菌馬亞種對(duì)浙貝母、大黃、苦參、山豆根、赤芍、甘草、蒲公英、知母極度敏感，結(jié)果與王雨朦[30]結(jié)果相似，其中蒲公英和知母清熱解毒的藥性與前幾種中藥有重合，所以將其剔除。劉丹丹等[39]研究發(fā)現(xiàn)，雪白睡蓮對(duì)金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌等常見菌種展現(xiàn)出的極強(qiáng)的廣譜抗菌作用，且其作為新疆地道藥材其質(zhì)量優(yōu)、產(chǎn)量高，因此納入敏感單藥中。MIC和MBC的測定結(jié)果顯示，大黃和雪白睡蓮的MIC最小，為0.078 g/mL，提示其抑菌作用最強(qiáng)，雪白睡蓮的MBC最小，為0.078 g/mL，該結(jié)果與牛津杯法結(jié)果并不完全符合，懷疑是不同試驗(yàn)中藥物與細(xì)菌共培養(yǎng)的狀態(tài)不同而影響了藥物的抑菌效果。單一中藥通常只有1～2種藥理作用，當(dāng)聯(lián)合使用多種中藥時(shí)，可能會(huì)發(fā)生協(xié)同效應(yīng)并全面展現(xiàn)相關(guān)的藥理作用，因此試驗(yàn)近一步對(duì)篩選出的敏感單味藥物組方。為避免直接按抑菌效果組方的盲目性，借助聯(lián)合藥敏試驗(yàn)和正交試驗(yàn)[40]，以剔除相頡頏藥物，消除各因素間干擾。聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，浙貝母和雪白睡蓮FIC指數(shù)>2，提示二者頡頏，但因雪白睡蓮和其他藥物的協(xié)同相加作用更強(qiáng)，綜合考慮刪減浙貝母。通過正交試驗(yàn)，得出抗馬鏈球菌馬亞種的基礎(chǔ)組方最佳配比為赤芍∶甘草∶大黃∶雪白睡蓮∶山豆根∶苦參=4∶2∶2∶4∶4∶1。

傳統(tǒng)中獸藥組方中除針對(duì)治則選取藥物外，還會(huì)相應(yīng)添加補(bǔ)虛藥，研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)虛藥具有良好的免疫增強(qiáng)功能，有些可以刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答系統(tǒng)[41]，常見補(bǔ)虛藥物有黃芪、當(dāng)歸、人參、白術(shù)等。在基礎(chǔ)組方前提下，添加黃芪與當(dāng)歸2味補(bǔ)益藥物。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，黃芪當(dāng)歸在5∶1配伍時(shí)，促血管新生療效最佳，黃芪當(dāng)歸在1∶1配伍時(shí)，能提高骨髓造血機(jī)能[42-44]。結(jié)合本研究體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果可知，在黃芪當(dāng)歸以1∶1配伍，濃度為0.5 g/mL加味時(shí)，治療馬腺疫小鼠模型的效果最佳，保護(hù)率可達(dá)87.5%，與陽性對(duì)照組(氨芐西林鈉)相當(dāng)。氨芐西林鈉屬于青霉素類抗生素，主要用以治療敏感細(xì)菌所致的上、下呼吸道感染、胃腸道感染等，在本試驗(yàn)中雖然其顯著降低了小鼠的死亡率，但肺臟病理切片結(jié)果顯示，對(duì)于馬鏈球菌馬亞種引起的肺臟炎性損傷，修復(fù)作用較差。而在組方治療下，小鼠肺臟的病理變化明顯減輕，表明組方不但可以降低小鼠的死亡率，并且對(duì)馬鏈球菌馬亞種所致小鼠肺臟的炎性損傷有一定的改善作用。雖然建立馬腺疫小鼠模型，可以顯著降低試驗(yàn)成本，由于組方成分復(fù)雜，進(jìn)入機(jī)體內(nèi)后會(huì)受到溫度、pH、作用部位及宿主健康狀況等多種因素影響[45]，組方對(duì)于小鼠模型的治療效果是否與本體動(dòng)物治療效果相當(dāng)還有待近一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過單味中藥體外抑菌試驗(yàn)(牛津杯法)、聯(lián)合藥敏試驗(yàn)和正交試驗(yàn)成功篩選出了一種抗馬鏈球菌馬亞種的中藥組方，配比為赤芍∶甘草∶大黃∶雪白睡蓮∶山豆根∶苦參∶黃芪當(dāng)歸(1∶1)=4∶2∶2∶4∶4∶1∶1；中藥組方體內(nèi)抑菌保護(hù)率可達(dá)87.5%，同時(shí)該組方對(duì)馬鏈所致肺臟炎性損傷有改善作用，在馬腺疫無特效藥的情況下，可為臨床用藥提供一定的技術(shù)支持。