鴿源性大腸桿菌的分離鑒定及茶多酚對(duì)其體外抑菌效果的研究

鐘雅靜，朱少平，陳艾玲，馬婷婷，鄧 珊，黃燕華,3，付 晶

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院健康養(yǎng)殖創(chuàng)新研究院，廣州 510225；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣州 510225；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

大腸桿菌(Escherichiacoli)引起的鴿大腸桿菌病是肉鴿養(yǎng)殖業(yè)中常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病之一，主要經(jīng)呼吸道和消化道感染，全年均可發(fā)生，各年齡段的鴿都可感染。該病以精神沉郁、食欲減退和腹瀉等為臨床癥狀，心包炎、敗血癥和腹膜炎等為典型病理變化[1-2]，并且常與其他病毒病及支原體病混合感染，增加患病鴿的死亡率，給肉鴿養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。與此同時(shí)，養(yǎng)殖生產(chǎn)中抗生素的濫用，使大腸桿菌耐藥菌株快速形成，并且在鴿肉和鴿蛋中藥物殘留現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，給人類(lèi)健康帶來(lái)極大威脅。因此，探尋安全、有效和綠色防治大腸桿菌病的抗生素替代品，成為肉鴿養(yǎng)殖業(yè)的研究熱點(diǎn)之一。

茶多酚(TP)主要來(lái)源于茶葉，由30多種多酚類(lèi)物質(zhì)組成，兒茶素的含量占其總含量中的60%～80%，具有抑菌、抗病毒、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等生物活性功能[3]。研究表明，茶多酚的抑菌作用具有高效廣譜性和選擇性，對(duì)變形球菌[4]、金黃色葡萄球菌[5]、鼠傷寒沙門(mén)氏菌[6]和大腸桿菌[7]等多種腸道致病菌均有抑制效果，還能促進(jìn)益生菌的增殖[8]。因此，將茶多酚作為植物性抑菌劑運(yùn)用于腸道細(xì)菌性疾病的防治具有一定的前景。但目前茶多酚對(duì)鴿細(xì)菌性疾病影響的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。

廣州市某規(guī)模化鴿場(chǎng)部分種鴿出現(xiàn)精神沉郁，食欲和渴欲降低或廢絕，羽毛松亂，呆立，消瘦和排黃白色或黃綠色稀糞等癥狀，疑似鴿大腸桿菌病?；诖?，本研究在無(wú)菌條件下采集發(fā)病鴿的糞便，通過(guò)細(xì)菌分離純化、革蘭氏染色鏡檢、16S rRNA基因測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)病原菌的藥物敏感性和毒力基因攜帶情況，旨在確定廣州市某規(guī)模化鴿場(chǎng)腹瀉病例的病原菌。同時(shí)觀察茶多酚對(duì)該病原菌的體外抑菌效果，以期為茶多酚對(duì)鴿大腸桿菌病的防治提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗(yàn)致病菌株分離自廣州市某規(guī)模化鴿場(chǎng)的病料樣品。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25922購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基、甘油、瓊脂粉和胰蛋白胨均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；10種藥敏紙片均購(gòu)自溫州市康泰生物科技有限公司；2×TaqMasterMix和DM2000 DNA Maker均購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物技術(shù)股份有限公司；Gene Red核酸染料購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；革蘭氏染色試劑盒、50×TAE溶液和茶多酚(純度≥98.0%)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；ABI PowerUPTMSYBRTMGreen預(yù)混液購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

恒溫氣浴振蕩器購(gòu)自常州市國(guó)旺儀器制造有限公司；生化培養(yǎng)箱購(gòu)自上海慧泰儀器制造有限公司；普通PCR儀、化學(xué)發(fā)光熒光成像儀和熒光定量PCR儀均購(gòu)自伯樂(lè)公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 病原菌的分離純化和染色鏡檢

在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，將適量糞便樣品稀釋于5 mL無(wú)菌生理鹽水制備懸濁液，混勻后吸取100 μL懸濁液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)情況；隨后挑取培養(yǎng)基中的單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，重復(fù)該操作3次，純化后的病原菌與50%甘油1∶1混合保存；挑取純化后的菌落分別接種于三糖鐵、麥康凱和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中，在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～24 h，觀察并記錄菌落形態(tài)，同時(shí)挑取典型菌落進(jìn)行常規(guī)革蘭氏染色鏡檢。

1.4 病原菌的16S rRNA基因測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

滅菌槍頭挑取病原菌單菌落溶解于100 μL ddH2O制備細(xì)菌模板，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共25 μL：2×TaqMasterMix 12.5 μL，細(xì)菌模板1.25 μL，引物27F和1492R各1.25 μL，ddH2O 8.75 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，最后4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取1 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，并于化學(xué)發(fā)光熒光成像儀上觀察并拍照記錄。將PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果上傳至NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast序列相似性比對(duì)分析。采用Mega 5.0軟件中鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建基于病原菌、不同宿主的大腸埃希氏菌和5種常見(jiàn)致病性大腸埃希氏菌16S rRNA序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.5 病原菌的藥物敏感性試驗(yàn)

試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法，以大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。向新鮮病原菌菌液中加入生理鹽水，調(diào)制菌液濁度至0.5麥?zhǔn)蠁挝?，用無(wú)菌鋼珠將適量的菌液均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基的表面，待培養(yǎng)基表面稍干后貼上藥敏片，37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～20 h，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑(mm)，并以抗菌藥物敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)[9]判斷病原菌對(duì)各抗生素的敏感性。

1.6 檢測(cè)病原菌攜帶的毒力基因

參考已報(bào)道的序列[10-12]合成大腸桿菌毒力基因fliC、fimH、iroN、hlyF、papC、vat、ibeA和iss的引物，引物信息見(jiàn)表1，參照1.4中的PCR方法檢測(cè)病原菌攜帶的毒力基因。

表1 毒力基因引物Table 1 Primers of virulence gene

1.7 茶多酚的體外抑菌效果

1.7.1 茶多酚對(duì)病原菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC) 參考高瑞娟等[13]報(bào)道的方法、試驗(yàn)操作和判定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定茶多酚對(duì)病原菌的MIC和MBC。茶多酚的質(zhì)量濃度分別為125、250、500、1 000、2 000、4 000和8 000 μg/mL。

1.7.2 茶多酚對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響 取適量4 mg/mL茶多酚溶液與等量雙倍濃度LB肉湯培養(yǎng)基混合，配制2 000 μg/mL的茶多酚母液培養(yǎng)基。將茶多酚母液培養(yǎng)基倍比稀釋至濃度分別為125、250、500和1 000 μg/mL的茶多酚培養(yǎng)基?？瞻讓?duì)照組為L(zhǎng)B肉湯培養(yǎng)基，不作任何處理。取混勻、等量的新鮮病原菌菌液分別接種于各組的培養(yǎng)基中，在37 ℃ 200 r/min恒溫氣浴振蕩器培養(yǎng)，接種后的第0、2、4、6、8、10、12和24 h使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組培養(yǎng)基在600 nm時(shí)的吸光值(D600 nm值)，每組3個(gè)重復(fù)。

1.7.3 茶多酚對(duì)病原菌運(yùn)動(dòng)的影響 試驗(yàn)處理及分組同1.7.2。取混勻、等量的新鮮菌液2 μL分別接種于各組的半固體瓊脂培養(yǎng)基平板的中心，在37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，觀察、拍照并測(cè)量記錄各組平板中病原菌從接種點(diǎn)向四周擴(kuò)散生長(zhǎng)的運(yùn)動(dòng)直徑(mm)，每組3個(gè)重復(fù)。

1.7.4 茶多酚對(duì)病原菌毒力基因表達(dá)量的影響 試驗(yàn)設(shè)置不同濃度茶多酚組和空白對(duì)照組，茶多酚組試驗(yàn)濃度根據(jù)1.7.2和1.7.3試驗(yàn)結(jié)果決定，培養(yǎng)基的配制同1.7.2。取混勻、等量的新鮮病原菌菌液分別接種于各組的培養(yǎng)基中。各組培養(yǎng)基在37 ℃ 200 r/min恒溫氣浴振蕩器培養(yǎng)12 h后，取適量菌液按照細(xì)菌總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明提取細(xì)菌RNA并制備cDNA模板。根據(jù)1.6的結(jié)果，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定各組細(xì)菌毒力基因的表達(dá)，以大腸桿菌管家基因uidA為內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系20 μL：SYBR Green MasterMix 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，共循環(huán)40次；測(cè)定熔解曲線，通過(guò)公式RQ=2-△△CT計(jì)算目基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)；并采用Tukey法進(jìn)行多重比較，以P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 病原菌的分離純化和染色鏡檢

病原菌在三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基接種病原菌后，培養(yǎng)基斜面先呈黃色后轉(zhuǎn)為紅色，底部始終保持黃色，并且有氣泡產(chǎn)生(圖1A);在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出白色、中間隆起、邊緣整齊、表面光滑的圓形菌落(圖1B)；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出鮮桃紅色、菌落中心呈深桃紅色、圓形、扁平、邊緣整齊、表面光滑的菌落(圖1C)；在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出帶有金屬光澤的黑色、中間隆起、圓形、表面光滑、邊緣整齊的菌落(圖1D)；病原菌革蘭氏染色、鏡檢后可見(jiàn)粉紅色，兩端鈍圓，單個(gè)、成對(duì)或成叢排列，無(wú)莢膜和芽孢的短小桿菌(圖1E)，與革蘭氏陰性菌形態(tài)相符。根據(jù)臨床癥狀、分離培養(yǎng)特性和細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果，初步證實(shí)病原菌為大腸桿菌，命名為GG20210604。

A，在三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；B，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；C，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；D，在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài);E，革蘭氏染色鏡檢形態(tài)(1 000×) A，Colony morphology in TSI medium;B，Colony morphology in NA medium;C，Colony morphology in MAC medium;D，Colony morphology in EMB medium；E，Gram stain morphology (1 000×)圖1 病原菌分離純化和染色鏡檢Fig.1 Isolation,purification and microscopic examination of pathogenic bacteria

2.2 16S rRNA基因測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將GG20210604的16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠電泳后得到單一條帶，條帶大小約1 500 bp(圖2)，經(jīng)16S rRNA基因測(cè)序證實(shí)，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 445 bp，與預(yù)期的基因片段大小相符。將GG20210604的16S rRNA序列在NCBI進(jìn)行Blast相似性比對(duì)分析，結(jié)果顯示GG20210604與GenBank中收錄的大腸桿菌(登錄號(hào)：CP057638.1)相似性最高，為99.8%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，GG20210604與大腸桿菌在同一分支(圖3)。結(jié)合上述菌落和革蘭氏染色形態(tài)以及16S rRNA基因測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果，最終確定GG20210604為大腸桿菌。

圖2 GG20210604的16S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of 16S rRNA gene fragment of GG20210604

圖3 基于 16S rRNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

由表2可知，GG20210604對(duì)頭孢唑林、慶大霉素、磺胺甲噁唑、頭孢呋辛、頭孢哌酮和丁胺卡那敏感，對(duì)鏈霉素和頭孢噻吩中度敏感，對(duì)環(huán)丙沙星和氨芐西林耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results

2.4 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

由圖4可知，GG20210604毒力基因檢測(cè)中，PCR擴(kuò)增出與fliC、fimH、iroN和hlyF基因預(yù)期大小一致的條帶，未擴(kuò)增出與papC、vat、ibeA和iss基因預(yù)期大小一致的條帶，說(shuō)明GG20210604攜帶fliC、fimH、iroN和hlyF毒力基因。

M,DM2000 DNA Marker;1,fliC基因；2，fimH基因；3，iroN基因；4，hlyF基因；5,papC基因；6，vat基因；7，ibeA基因；8，iss基因；M,DM2000 DNA Marker;1,fliC gene；2，fimH gene；3，iroN gene；4，hlyF gene；5，papC gene；6，vat gene；7，ibeA gene；8，iss gene圖4 GG20210604毒力基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification results of virulence genes of GG20210604

2.5 茶多酚的體外抑菌效果

2.5.1 茶多酚對(duì)GG20210604的MIC和MBC 37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，陰性孔內(nèi)肉湯澄清，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。對(duì)照孔內(nèi)可見(jiàn)肉湯渾濁，細(xì)菌生長(zhǎng)良好。茶多酚對(duì)GG20210604的MIC和MBC均為4 000 μg/mL。

2.5.2 茶多酚對(duì)GG20210604生長(zhǎng)的影響 由圖5可知，與空白對(duì)照組相比，250、500和1 000 μg/mL茶多酚組各階段的吸光值均顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明茶多酚能有效減緩GG20210604的生長(zhǎng)速率。其中，500和1 000 μg/mL茶多酚對(duì)GG20210604生長(zhǎng)的抑制效果無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5.3 茶多酚對(duì)GG20210604運(yùn)動(dòng)的影響 由圖6可知，與空白對(duì)照組相比，各濃度茶多酚組GG20210604的運(yùn)動(dòng)直徑均顯著降低(P<0.05)，125、250、500和1 000 μg/mL茶多酚組的GG20210604運(yùn)動(dòng)直徑分別為空白對(duì)照組的46.01%、13.34%、11.54%和8.56%。

A,GG20210604在茶多酚半固體瓊脂培養(yǎng)基的運(yùn)動(dòng)圖；B，茶多酚對(duì)GG20210604運(yùn)動(dòng)直徑影響的柱狀圖 A,GG20210604 movement image in TP soft agar plates;B，Histogram of the effect of TP on the diameter of GG20210604圖6 茶多酚對(duì)GG20210604運(yùn)動(dòng)的影響Fig.6 Effect of TP on the movement of GG20210604

2.5.4 茶多酚對(duì)GG20210604毒力基因表達(dá)的影響 綜上，當(dāng)茶多酚濃度為500和1 000 μg/mL時(shí)，對(duì)GG20210604生長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)的影響無(wú)顯著差異，因此本試驗(yàn)只檢測(cè)250和500 μg/mL茶多酚對(duì)GG20210604毒力基因表達(dá)的影響。結(jié)果見(jiàn)圖7，與空白對(duì)照組相比，250 μg/mL茶多酚組GG20210604的fimH基因的表達(dá)顯著降低(P<0.05)；250和500 μg/mL茶多酚組GG20210604的fliC、iroN和hlyF基因的表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。

圖7 茶多酚對(duì)GG20210604毒力基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of TP on virulence gene expression of GG20210604

3 討 論

近年來(lái)肉鴿養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展十分迅速，但隨之而來(lái)的養(yǎng)殖密度增大、鴿舍通風(fēng)不良導(dǎo)致氨氣等有害氣體含量高和飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)纫蛩貙?dǎo)致的傳染病暴發(fā)屢見(jiàn)不鮮。鴿大腸桿菌病是危害肉鴿養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的常見(jiàn)傳染病之一[2]，本研究從疑似感染大腸桿菌病的鴿糞便中分離到1株致病菌株，經(jīng)分離純化、染色鏡檢、16S rRNA基因測(cè)序和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，證實(shí)該菌株是大腸桿菌，并命名為GG20210604。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果觀察到，GG20210604對(duì)環(huán)丙沙星和氨芐西林耐藥，菌株耐藥性的產(chǎn)生可能與生產(chǎn)管理中抗生素使用頻繁、使用種類(lèi)單一以及耐藥質(zhì)粒的水平傳播有關(guān)，建議該鴿場(chǎng)在今后臨床治療中合理規(guī)范用藥，采取聯(lián)合、交替用藥方式，避免多重耐藥菌株的產(chǎn)生。同時(shí)可以選擇中獸藥、植物提取物等天然抗菌劑進(jìn)行治療，減少耐藥菌株的出現(xiàn)。大腸桿菌的致病性通常由多種毒力因子如黏附素、攝鐵系統(tǒng)、脂多糖和侵襲素等相互協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，已有研究表明，大腸桿菌的致病性與攜帶的毒力因子的數(shù)量具有顯著相關(guān)性[14]。因此檢測(cè)大腸桿菌攜帶毒力基因?qū)τ谄渲虏∧芰Φ脑u(píng)估有重要意義。Ewers等[15]認(rèn)為，非致病性大腸桿菌沒(méi)有或至多含有3個(gè)毒力基因，而致病性大腸桿菌至少含有4個(gè)毒力基因。iutA、hlyF、iss、iroN和ompT5個(gè)基因與禽致病性大腸桿菌的致病性顯著相關(guān)[16]。毒力基因檢測(cè)結(jié)果表明，GG20210604攜帶fliC、fimH、iroN和hlyF4種毒力基因。根據(jù)GG20210604的藥物敏感性和毒力基因檢測(cè)結(jié)果并結(jié)合病死鴿臨床癥狀，提示GG20210604具有一定毒力，對(duì)宿主具有較強(qiáng)的致病性，養(yǎng)殖戶(hù)應(yīng)加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理，加大對(duì)鴿大腸桿菌病的防控力度。

大量研究表明，茶多酚可通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁膜結(jié)構(gòu)、改變菌體正常形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)容物外泄、抑制蛋白質(zhì)合成與表達(dá)、影響細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制和與金屬離子絡(luò)合等方式發(fā)揮抑菌的生物特性[3]。本試驗(yàn)通過(guò)茶多酚對(duì)GG20210604的體外抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶多酚對(duì)鴿源性大腸桿菌具有良好的抑菌效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚對(duì)GG20210604的MIC和MBC均為4 000 μg/mL。Ma等[7]試驗(yàn)中，茶多酚對(duì)ETEC K88的MIC和MBC分別是5 000和10 000 μg/mL，與本試驗(yàn)結(jié)果不相同，可能與菌株的來(lái)源和耐藥性以及茶多酚的純度等原因有關(guān)。茶多酚對(duì)GG20210604生長(zhǎng)影響的結(jié)果顯示，當(dāng)茶多酚的濃度≥250 μg/mL時(shí)，菌株在指數(shù)期的生長(zhǎng)顯著減緩，說(shuō)明茶多酚對(duì)鴿源性大腸桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。Xiong等[17]研究指出，茶多酚可以誘導(dǎo)大腸桿菌發(fā)生內(nèi)源性氧化應(yīng)激，從而抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。Si等[18]研究發(fā)現(xiàn)，以茶多酚的主要成分表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)和沒(méi)食子兒茶素(EGC)處理細(xì)菌后，細(xì)菌形態(tài)由長(zhǎng)桿狀變?yōu)槎贪魻罨蚯驙睿赡苁怯捎诩?xì)胞分裂受阻所致。茶多酚對(duì)GG20210604運(yùn)動(dòng)影響的結(jié)果表明，茶多酚顯著抑制了GG20210604向培養(yǎng)基四周擴(kuò)散，有效降低了其運(yùn)動(dòng)能力，與于淑池等[19]的研究結(jié)果一致。腸道致病細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力是重要的致病因素之一，可以幫助細(xì)菌附著于宿主體內(nèi)并遷移到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的位置進(jìn)行增殖，并且細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)能力對(duì)生物膜形成以及在宿主表面的黏附聚集過(guò)程中具有重要作用[20]。而鞭毛是介導(dǎo)細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力的主要器官。提示茶多酚能夠干擾鞭毛的正常功能，從而調(diào)控鴿源性大腸桿菌的運(yùn)動(dòng)能力，并且可能影響鴿源性大腸桿菌的生物膜形成和黏附功能。

毒力基因在細(xì)菌致病性中起重要作用。Schneier-Rayman等[21]研究結(jié)果表示，0.55 mg/mL EGCG使變形鏈球菌株的gtfC、gtfB和ftf毒力基因表達(dá)降低70%～90%。在Apisada等[5]的研究中，500 mg/L EGCG可以使金黃色葡萄球菌溶血活性相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)75%，但葡萄糖攝取系統(tǒng)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)上升，推測(cè)金黃色葡萄球菌可能通過(guò)加強(qiáng)葡萄糖的吸收，促進(jìn)細(xì)胞膜的修復(fù)，進(jìn)而抵抗EGCG的損傷。大腸桿菌fliC基因編碼的鞭毛蛋白是鞭毛的主要結(jié)構(gòu)亞基，研究表明，fliC基因?qū)?xì)菌的運(yùn)動(dòng)、毒力因子的釋放、生物膜形成和對(duì)外界壓力的抵抗有重要作用[22]。菌毛是細(xì)菌在宿主黏膜細(xì)胞黏附定居的第一武器，常見(jiàn)的菌毛有Ⅰ型菌毛、P菌毛和Curli菌毛等，其中Ⅰ型菌毛最為常見(jiàn)。黏附素蛋白fimH是菌毛長(zhǎng)度和數(shù)量的調(diào)控因子，同時(shí)是Ⅰ型菌毛與D-甘露糖特異性結(jié)合的黏附素，可特異性與紅細(xì)胞和酵母細(xì)胞結(jié)合，為細(xì)菌進(jìn)一步侵入機(jī)體、引發(fā)感染創(chuàng)造條件[23]。iroN是參與細(xì)菌內(nèi)部鐵離子吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)基因，而鐵離子是細(xì)菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中必需的離子之一，如果鐵離子的吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，細(xì)菌就不能正常的生長(zhǎng)和繁殖[24]。溶血素hlyF可以促進(jìn)外膜囊泡的分泌，將細(xì)菌的毒力因子、遺傳因子和免疫調(diào)控因子等運(yùn)輸?shù)剿拗骷?xì)胞，并且能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生自噬[25]。茶多酚對(duì)GG20210604毒力基因表達(dá)影響的結(jié)果顯示，經(jīng)茶多酚處理后，該菌株的毒力基因fliC、iroN、fimH和hlyF的表達(dá)均被顯著下調(diào)，其中，fliC毒力基因表達(dá)下調(diào)的結(jié)果與茶多酚對(duì)GG20210604運(yùn)動(dòng)的抑制結(jié)果相一致。較為有趣的是，與空白對(duì)照組相比，當(dāng)茶多酚濃度為500 μg/mL時(shí)，對(duì)fimH基因的表達(dá)無(wú)顯著影響，而250 μg/mL茶多酚則顯著降低了fimH基因的表達(dá)，推測(cè)茶多酚抑制不同毒力基因表達(dá)的適宜劑量存在差異性，造成該現(xiàn)象的具體原因有待進(jìn)一步研究。Lagha等[26]研究指出，茶多酚螯合鐵離子的能力是茶多酚發(fā)揮抑菌作用的原因之一。白細(xì)胞毒素LtxA是放線菌分泌的外膜囊泡蛋白，可通過(guò)凋亡效應(yīng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞死亡，Chang等[27]研究表明，EGCG可改變LtxA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，阻止LtxA與細(xì)胞膜的膽固醇結(jié)合。由此推測(cè)，茶多酚可能會(huì)通過(guò)抑制GG20210604毒力基因的表達(dá)，降低大腸桿菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗力，并且螯合鐵離子和改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)抑制GG20210604黏附、侵襲、鐵攝取和增殖等生理過(guò)程達(dá)到抑菌效果。

目前，細(xì)菌性疾病的防控是肉鴿養(yǎng)殖業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。茶多酚主要來(lái)源于茶葉，具有高效廣譜的抑菌作用，且病原菌不易產(chǎn)生耐藥性，是一種綠色、天然的植物性抑菌劑。本研究的試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果相符合，均肯定了茶多酚對(duì)大腸桿菌具有抑制作用。但本研究發(fā)現(xiàn)茶多酚抑制不同毒力基因表達(dá)的適宜劑量存在差異性。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中需合理安排茶多酚用藥量。隨著對(duì)茶多酚抑菌機(jī)理的深入了解以及茶多酚生產(chǎn)工藝不斷升級(jí)、優(yōu)化，茶多酚在今后的細(xì)菌性疾病的防控中具有良好的發(fā)展前景。

4 結(jié) 論

本研究從鴿糞便中分離得到1株大腸桿菌，命名為GG20210604。該菌株對(duì)環(huán)丙沙星和氨芐西林有一定的耐藥性，且攜帶fliC、fimH、iroN和hlyF4種毒力基因，具有一定的致病性。此外，體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，茶多酚對(duì)該菌株的MIC和MBC均為4 000 μg/mL，125～1 000 μg/mL的茶多酚均可不同程度地抑制該菌株的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)和毒力基因的表達(dá)。本研究可為茶多酚應(yīng)用于鴿大腸桿菌臨床感染的預(yù)防和治療提供參考。