泉州市水葫蘆致病真菌的分離與鑒定

鄭凱玲，楊意伯，李錦泉，謝少和

(泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 福建 泉州 362212)

水葫蘆，又名水浮蓮、布袋蓮、鳳眼蓮，屬雨久花科鳳眼蓮屬，原產(chǎn)于南美洲，自20世紀(jì)初傳入我國，20世紀(jì)50～60年代作為豬的飼料源被廣泛應(yīng)用，后因其營養(yǎng)價值低，精飼料的推廣等原因逐漸被人們放棄，逸為野生。由于脫離了原產(chǎn)地天敵和各種自然因素的制約，再加上其本身極強(qiáng)的繁殖擴(kuò)散能力，目前水葫蘆的生長范圍遍及我國的17個省(自治區(qū))，已成為我國近年來危害最為嚴(yán)重的惡性水生雜草之一[1]。從21世紀(jì)初開始，由于水質(zhì)富營養(yǎng)化等原因，泉州地區(qū)河流中水葫蘆的發(fā)生量逐年增多，生長條件適宜時能在短期內(nèi)大量繁殖，大面積覆蓋溝渠、河流和水庫等的水面，造成江河航道受阻、攔河閘堵塞、橋基受沖擊以及社區(qū)衛(wèi)生環(huán)境惡化等一系列嚴(yán)重的社會、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)問題[2-3]。

目前泉州市對水葫蘆的防治主要依靠人工打撈和化學(xué)防治，費(fèi)時費(fèi)力且易對自然生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生消極作用，采用生物防治是防治水葫蘆安全有效的方法[4-6]。國外水葫蘆天敵的調(diào)查從20世紀(jì)60年代開始，共發(fā)現(xiàn)了70多種取食水葫蘆的節(jié)肢動物和3種螨類，此后又不斷有水葫蘆盲蝽Eccritotarsuscatarinensis等新天敵在巴西等地被發(fā)現(xiàn)。目前國際上已發(fā)現(xiàn)具有生防潛力的生物有水葫蘆象甲Neochetinaeichhorniae、N.bruchi、水葫蘆螟蛾Haimbachinainfusella、Sameodesalbigutsalis和葉螨Orthogalumnaterebrantis，其中最早和最成功的為水葫蘆象甲在水葫蘆生物防治上的應(yīng)用。20世紀(jì)70年代后期，水葫蘆致病菌被作為水葫蘆生物控制的新手段，已先后收集到60多種具有生物控制潛力的病原菌，這些病原菌的大多數(shù)菌株均來自水葫蘆入侵地。利用羅德曼尾孢Cercosporarodmanii防除水葫蘆在國外已獲專利保護(hù)[7-8]。

近年來的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，水葫蘆在我國國內(nèi)已有一些本土天敵動物，如短額負(fù)蝗Atractomorphasinensis、中華蚱蜢Acridachinensis、中華稻蝗Oxyachinensis、斜紋夜蛾Spodopteralitura、蓮縊管蚜Rhopalosiphumnymphaeae以及1種葉螨、1種扁螺。利用本土的繡球葉螨Tetranychushydrangeae來防治水葫蘆已獲得國內(nèi)專利保護(hù)[9]。國內(nèi)水葫蘆致病菌的篩選工作始于20世紀(jì)90年代末，目前已分離獲得的致病真菌有鏈格孢Alternariaspp.、A.eichhorniae、炭疽菌Colletotrichumspp.、石楠擬盤多毛孢Pestalotiopsisphotinia和冬青麗赤殼菌Calonectriailicicola等。露濕漆斑菌Myrotheciumroridum和水葫蘆擬盤多毛孢P.crassipes這2個菌株在國內(nèi)已獲專利保護(hù)[6，8，10-12]。而福建省對水葫蘆天敵種類的調(diào)查報道甚少，僅有楊聞笛[13]觀察到斜紋夜蛾取食水葫蘆，可造成水葫蘆枯萎、死亡；李文文[14]從水葫蘆黑斑病上分離到互隔鏈格孢A.alternata，將該菌接種于16種蔬菜及雜草上，發(fā)現(xiàn)除水葫蘆和水浮蓮有感染外，其他作物均未感??；曹陽[15]從水葫蘆病葉上分離到尾孢菌Cercosporapiaropi，國際上普遍認(rèn)為該菌是高效的水葫蘆致病菌。本研究針對泉州市水域中自然發(fā)病的水葫蘆，開展病原真菌的收集和培養(yǎng)以及病原真菌分類學(xué)地位的鑒定等一系列調(diào)查研究工作，從中分離獲得對水葫蘆具有潛在控制能力的病原真菌，充實(shí)水葫蘆天敵種類名錄，為具有生防潛力微生物的實(shí)際利用和生物除草劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1供試菌株 從泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)科技園區(qū)采集帶回具有典型病斑的水葫蘆葉片和葉柄，并對其發(fā)病情況、侵染情況進(jìn)行記載，通過組織分離法獲得病原真菌。

1.1.2供試植株 從泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)科技園區(qū)水塘采集健康水葫蘆，去除衰老葉片后移植到泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所天臺上的放養(yǎng)容器內(nèi)，加適量肥水，在自然條件下生長。

1.1.3供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，加水煮爛后過濾，加入葡萄糖15 g，溶解后定容至1 000 mL(固體培養(yǎng)基加瓊脂粉18 g，液體培養(yǎng)基不加)，120℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1水葫蘆病害調(diào)查 在泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)科技園區(qū)水塘定點(diǎn)觀察，記錄該水域內(nèi)水葫蘆全年病害發(fā)生種類及受害程度，將發(fā)病植株帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2水葫蘆病原菌的分離與純化 采用組織分離法。選取具有典型病斑的葉片或葉柄，表面用無菌水沖洗干凈后，從病健交界處剪取約5 mm×5 mm的病組織數(shù)塊，在超凈工作臺中將病組織塊放入75%乙醇中消毒2次，后放入無菌水中連續(xù)漂洗3次，最后置于PDA平板培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中倒扣培養(yǎng)。待平板培養(yǎng)基上的菌落長出時，純化并經(jīng)致病性測定后移入試管斜面生長，長滿斜面后置于冰箱4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3水葫蘆病害的診斷與回接 (1)將分離純化所得的病原菌切成5 mm×5 mm大小的菌塊，菌絲一面貼于水葫蘆葉片上，蓋上濕棉花。接種前用無菌水將葉片表面沖洗干凈，針刺接種點(diǎn)。以只貼濕棉花的植株作對照。在每個處理葉片套無色透明的聚乙烯塑料袋，葉柄處扎緊。接種植株置于27℃，植物生長燈下生長。7 d后，取下袋子，觀察記錄葉片上的病斑大小、壞死情況。(2)從分離純化所得的病原菌菌落上切取菌絲塊，接種于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，27℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 d后，用攪拌機(jī)打碎菌絲，按菌液與無菌水的體積比例(1∶3)配制成菌絲懸浮液。噴霧接種于健康水葫蘆上，以只用無菌水噴霧的水葫蘆作對照，每種菌液噴霧2～6株水葫蘆，每株水葫蘆5～9片葉。接種后套上無色透明的聚乙烯塑料袋，在自然溫度和光照下生長。接種7 d后揭去塑料袋，觀察各植株的發(fā)病情況。(3)利用柯赫法則進(jìn)行回接驗(yàn)證，即被接種葉片出現(xiàn)癥狀后，通過組織分離法再次對病原菌進(jìn)行分離，比較前后分離所得菌株的培養(yǎng)性狀、孢子囊、分生孢子等形態(tài)特征。

1.2.4水葫蘆病原菌鑒定 (1)形態(tài)學(xué)鑒定：將病原菌接種于PDA平板上，27℃黑暗培養(yǎng)5 d，觀察菌落顏色、形狀等培養(yǎng)性狀。刮取菌絲，觀察菌絲、孢子囊、分生孢子等形態(tài)特征，將菌種鑒定到屬。(2)分子生物學(xué)鑒定：采用CTAB提取法提取病原菌總DNA。采用ITS通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)，以提取的病原菌樣品DNA溶液作為模板，擴(kuò)增rDNA-ITS片段。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性1 min，52℃退火55 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃補(bǔ)充延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測后由華大基因測序。將獲得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對分析，結(jié)合病原菌的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)一步確定病原菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 水葫蘆病害發(fā)生情況

泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)科技園區(qū)水塘的水葫蘆全年都有病害發(fā)生，其中以葉枯病最為明顯，可造成大量葉片枯萎(圖1A)。葉片發(fā)病后，先在葉尖產(chǎn)生黑褐色壞死，再向葉緣與葉柄延伸；葉面病斑初呈黑色的點(diǎn)狀，面積擴(kuò)大呈不規(guī)則的長條形，病健交界清晰或模糊；病斑連結(jié)形成中央黃褐色的大面積壞死，病部周圍葉黃，發(fā)病嚴(yán)重時整葉枯死，壞死部位向葉柄蔓延(圖1B、C、D、E)。

圖1 水葫蘆葉枯病癥狀

2.2 病原菌的分離與鑒定

通過對水葫蘆病株進(jìn)行分離、純化和回接，得到2種水葫蘆病原菌，分別將它們命名為YQ21和YQ36。

2.2.1菌株YQ21的鑒定 YQ21在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈近圓形，邊緣清晰；菌絲埋生，或表生，氣生菌絲絨毛狀，菌落初為青綠色后漸變?yōu)楹诨疑?，背面灰綠色至黑綠色。分生孢子鏈生，倒棒狀，卵形、倒梨形或近橢圓形，淡褐色至褐色，成熟孢子具3～7(多數(shù)3～5)個橫隔膜，2～4個縱、斜隔膜(圖2)。根據(jù)菌落形態(tài)、分生孢子的形狀、隔膜數(shù)等特征鑒定該菌屬于鏈格孢屬真菌。

圖2 菌株YQ21的菌落及其分生孢子形態(tài)

利用真菌通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增菌株YQ21的ITS區(qū)，得到1個大小為572 bp的擴(kuò)增片段(圖3)，經(jīng)雙向測序和GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)該菌的ITS序列與互隔鏈格孢Alter-nariaalternata和細(xì)極鏈格孢A.tenuissima的相似度都很高，達(dá)到99.6%～99.8%，結(jié)合其形態(tài)特征將其鑒定為互隔鏈格孢Alternariaalternata。

注：M為200 bp DNA Marker條帶

2.2.2菌株YQ36的鑒定 YQ36在PDA培養(yǎng)基上的菌落呈圓形，邊緣清晰；菌落呈淡粉紅色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌落上有凸起物突破菌落表面；整個培養(yǎng)皿因該菌分泌水溶性紅色色素而呈鮮紅色。分生孢子單生，罕見鏈生，褐色，倒棒狀或近橢圓形，具橫隔膜 2～5個，縱、斜隔膜 1～4 個，分隔處略縊縮。喙柱狀，與孢身之間分界不明顯，淡褐色，不分隔(圖4)。根據(jù)分生孢子的形狀、隔膜數(shù)等特征鑒定該菌屬于鏈格孢屬真菌。

圖4 菌株YQ36的菌落及其分生孢子形態(tài)

利用真菌通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增菌株YQ36的ITS區(qū)，得到1個大小為570 bp的擴(kuò)增片段(圖5)，經(jīng)雙向測序和GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對分析發(fā)現(xiàn)該菌的ITS序列與水葫蘆鏈格孢A.eichhorniae相似度高達(dá)99.9%，結(jié)合其形態(tài)特征將其鑒定為水葫蘆鏈格孢A.eichhorniae。

注：M為200 bp DNA Marker條帶

2.3 病原菌的致病性測定

2.3.1菌株YQ21的致病性測定 YQ21菌塊接種產(chǎn)生圓形黑色壞死斑，外圍有黃色暈圈(圖6A)。菌液噴霧接種產(chǎn)生大小不等、不規(guī)則狀、灰褐色至黃褐色的病斑，黃色暈圈明顯(圖6B、C、D)。

注：A為菌塊接種；B～D為噴霧接種。

2.3.2菌株YQ36的致病性測定 菌塊接種產(chǎn)生近圓形灰褐色壞死斑，外圍有黃色暈圈(圖7A)。菌液噴霧接種產(chǎn)生梭形黃褐色病斑(圖7C)；濕度大時病斑呈黑色，病害向葉柄至莖部蔓延，葉片枯萎腐爛(圖7D、E、F)。

注：A為菌塊接種；B～F為噴霧接種

3 結(jié)論與討論

從泉州市農(nóng)科所農(nóng)業(yè)科技園區(qū)的水葫蘆葉枯病上分離得到兩種病原菌互隔鏈格孢菌YQ21和水葫蘆鏈格孢菌YQ36，說明該病害是由真菌復(fù)合侵染造成的，其中水葫蘆鏈格孢菌YQ36為福建省內(nèi)首次分離到的水葫蘆病原菌，該菌的發(fā)現(xiàn)豐富了福建省水葫蘆天敵微生物的資源庫。但這兩種病原菌能否作為水葫蘆的生物防治菌還有待深入研究，現(xiàn)從這兩種菌的致病研究進(jìn)展論述其生防潛能。

3.1 互隔鏈格孢YQ21的生防潛力

國外對該菌株的研究較多，迄今為止發(fā)現(xiàn)其侵染對象有煙草、西紅柿和大豆。國內(nèi)李文文[14]從福建水葫蘆病株上分離得到互隔鏈格孢，將該菌接種于16種蔬菜及雜草上，發(fā)現(xiàn)除水葫蘆和水浮蓮有感染外，其他作物均未感病。因此互隔鏈格孢菌對水葫蘆具有相對的寄主專一性。但由于該菌能侵染煙草、西紅柿和大豆，而西紅柿和大豆在泉州地區(qū)有種植，因此該菌作為生防菌在泉州地區(qū)應(yīng)用存在生態(tài)安全風(fēng)險。

3.2 水葫蘆鏈格孢YQ36的生防潛力

水葫蘆鏈格孢因其寄主專一性而具有生防前景。國外已對該菌進(jìn)行了生物安全性研究，研究中選取了21個屬95種重要的經(jīng)濟(jì)作物進(jìn)行寄主專一性和安全性測定，發(fā)現(xiàn)僅水葫蘆感病，表明水葫蘆鏈格孢菌具有較強(qiáng)的寄主專一性。長期研究結(jié)果表明，水葫蘆鏈格孢能夠作為一種安全、高效的水葫蘆生物除草劑[8]。后續(xù)將結(jié)合泉州市的主要作物種類進(jìn)一步研究該菌的寄主范圍，探索該菌作為生防菌的可行性與開發(fā)應(yīng)用價值。