鐵死亡基因及相關(guān)長鏈非編碼RNA在肝細(xì)胞癌發(fā)生與預(yù)后中的作用

姚元謙 呂建林 柳琳琳 王光耀

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科，廣西南寧 530023

肝細(xì)胞癌目前仍是全球致死性惡性腫瘤的主要類型之一[1]。手術(shù)治療是肝癌患者早期有效治療手段，可惜大部分患者確診時已是中晚期，盡管近年來開發(fā)了多種晚期肝癌的新療法，但仍達(dá)不到臨床所需療效[2-3]。鐵死亡主要由鐵介導(dǎo)的氧化損傷、過度脂質(zhì)氧化和細(xì)胞膜損傷驅(qū)動[4]，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡在各種癌癥治療中具有重要作用[5]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，而近年積累的證據(jù)表明，lncRNA 的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[6]。本研究運用生物信息學(xué)，構(gòu)建基于鐵死亡相關(guān)lncRNA 的肝癌預(yù)后模型，希望能為打破肝癌治療困境提供新視角。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共424 個樣本。從FerrDb 數(shù)據(jù)庫獲取246 個與肝癌相關(guān)的鐵死亡基因。

1.2 鐵死亡基因功能富集分析

運用R 軟件進行差異分析，并以|logFC|＞1、FDR＜0.05 為過濾條件，篩選出差異表達(dá)基因，進行基因集（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）、GO、KEGG 富集分析。

1.3 鐵死亡相關(guān)lncRNA 篩選

參考Gencode 數(shù)據(jù)庫的基因注釋，提取轉(zhuǎn)錄組中的lncRNA。運用Pearson 相關(guān)性檢驗，以|cor|＞0.4、P ＜0.001 為過濾條件，獲取鐵死亡相關(guān)lncRNA。

1.4 預(yù)后相關(guān)鐵死亡lncRNA 篩選

通過差異分析，提取差異鐵死亡lncRNA 的腫瘤組表達(dá)數(shù)據(jù)，進行單因素Cox 回歸分析，以P ＜0.001為過濾條件，篩選與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA。

1.5 構(gòu)建肝癌預(yù)后模型

進行多因素Cox 回歸分析，構(gòu)建基于鐵死亡相關(guān)lncRNA 的預(yù)后模型，該模型的計算公式：

其中xi為每個lncRNA 的表達(dá)水平，Coefi為回歸系數(shù)。根據(jù)風(fēng)險評分將隊列中的患者分為高、低風(fēng)險組，并進行預(yù)后分析。

1.6 低風(fēng)險組與高風(fēng)險組的免疫差異

從TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫下載免疫細(xì)胞浸潤數(shù)據(jù)，并通過文獻檢索獲得47 個免疫檢查點基因。以P ＜0.05 為過濾條件，篩選兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義的免疫細(xì)胞、免疫檢查點。

2 結(jié)果

2.1 鐵死亡基因功能富集分析

篩選出84 個差異表達(dá)鐵死亡基因，見圖1A。GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)，涉及雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物（mechanistic target of Rapamycin 1，mTORC1）基因集、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）調(diào)控基因集等，見圖1B。GO、KEGG 富集分析得到生物學(xué)進程631 條、細(xì)胞組分22 條、分子功能77 條、信號通路56 條，見圖1C～D。

圖1 鐵死亡基因差異分析及富集分析

2.2 篩選預(yù)后相關(guān)的鐵死亡lncRNA 并構(gòu)建預(yù)后模型

共鑒定出5 296 個與鐵死亡相關(guān)的lncRNA，篩選出差異lncRNA 共781 個，預(yù)后分析獲得66 個與預(yù)后相關(guān)的lncRNA。回歸分析納入17 個lncRNA 參與模型構(gòu)建，其模型相關(guān)系數(shù)詳見表1。根據(jù)風(fēng)險評分公式計算各患者的風(fēng)險得分，并將隊列中的肝癌患者分為高、低風(fēng)險組。

表1 構(gòu)建預(yù)后模型多因素Cox 分析結(jié)果

2.3 預(yù)后分析及模型評估

Kaplan-Meier 生存曲線及預(yù)后風(fēng)險散點圖顯示，低風(fēng)險組預(yù)后優(yōu)于高風(fēng)險組（P ＜0.01），見圖2A～B。受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線顯示，該模型對生存期具有良好的預(yù)測能力，且優(yōu)于其他臨床性狀的預(yù)測效果，見圖2C～D?；貧w分析顯示，該模型與總生存期顯著相關(guān)，且具有獨立預(yù)后價值，見圖2E～F。

圖2 兩組預(yù)后分析及模型評估

2.4 預(yù)后相關(guān)lncRNA-mRNA 共表達(dá)分析

模型中l(wèi)ncRNA 基本在高風(fēng)險患者中呈高表達(dá)狀態(tài)，且大部分隨著病程的進展而增高。lncRNAmRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)見圖3A，圖中紅色節(jié)點為lncRNA、綠色節(jié)點為mRNA；表達(dá)熱圖見圖3B。

圖3 參與模型構(gòu)建的lncRNA 表達(dá)分析

2.5 高風(fēng)險組與低風(fēng)險組免疫差異分析

免疫細(xì)胞浸潤熱圖見圖4A，圖中展示了不同平臺的分析結(jié)果。有17 個具有表達(dá)差異的免疫檢查點，見圖4B。根據(jù)以上免疫分析的結(jié)果，進一步分析14 個差異最顯著的鐵死亡基因（logFC＞3）與免疫分子靶點間的相關(guān)性，見圖5。

圖4 免疫細(xì)胞浸潤及免疫檢查點的差異分析

圖5 鐵死亡基因與免疫靶點相關(guān)性分析

3 討論

鐵死亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，在腫瘤研究中備受關(guān)注，而lncRNA 與鐵死亡之間具有調(diào)控關(guān)系[7]。本研究利用生物信息學(xué)，分析鐵死亡及相關(guān)lncRNA 在肝癌中的作用機制。

差異表達(dá)最顯著的鐵死亡基因中，部分已被證實參與鐵代謝或腫瘤的調(diào)節(jié)。NQO1 在細(xì)胞內(nèi)起到抗氧化作用[8]，其在肝癌患者中高表達(dá)，且與患者生存時間呈負(fù)相關(guān)[9]。SLC7A11 在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，能夠抑制鐵死亡、促進腫瘤發(fā)展[10-11]。AURKA 是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)激酶，其能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡[12]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）能維持細(xì)胞的抗氧化損傷作用，G6PD 過表達(dá)能促進肝癌細(xì)胞的增殖[13-14]。HAMP 是維持體內(nèi)鐵代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵基因，當(dāng)HAMP 表達(dá)下調(diào)時可抑制細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[15]。富集分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌中mTORC1 復(fù)合物處于激活狀態(tài)，其能通過調(diào)節(jié)代謝過程為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)[16]。糖酵解途徑也在肝癌中處于激活狀態(tài)，是腫瘤細(xì)胞中表現(xiàn)活躍的代謝表征，糖酵解是腫瘤治療的潛在靶點[17]。而γ 干擾素應(yīng)答調(diào)控途徑在肝癌中處于抑制狀態(tài)，該因子缺陷小鼠能自發(fā)地發(fā)生肺上皮惡性腫瘤[18]，但也有研究認(rèn)為其能夠使腫瘤細(xì)胞誘發(fā)強效的免疫逃逸機制[19]?？籽┑萚20]發(fā)現(xiàn)，敲除AC012073.1 能夠明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力，而過表達(dá)該基因則會促進癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。LINC00205 能夠作為內(nèi)源競爭性RNA，促進肝癌細(xì)胞增殖[21]，且該基因高表達(dá)的肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率較高[22]。

免疫治療策略能提高肝癌患者的生存率[23]。腫瘤中的淋巴細(xì)胞在免疫逃逸中發(fā)揮著重要作用，包括調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞等[24]。本研究結(jié)果顯示，高、低風(fēng)險組有17 個具有表達(dá)差異的免疫檢查點。目前，以單克隆抗體為代表的一系列免疫檢查點抑制劑在抗腫瘤中取得了較大成功[25]。