化脂復肝顆粒通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3減輕Kupffer細胞炎癥改善非酒精性脂肪性肝病機制研究

唐穎慧，葉苗青，何瑾瑜，劉皎皎，李粉萍，薛敬東，楊躍青

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確損肝因素外所致的肝細胞內(nèi)脂肪過度沉積、肝臟彌漫性脂肪浸潤為主要臨床特征的疾病[1]。NAFLD病程包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝癌。實踐提示，這種疾病后期通常會向肝硬化乃至肝癌進行演變，對人們的身體健康已經(jīng)構成嚴重威脅[2]。國內(nèi)有1/3的人群患有非酒精性脂肪性肝病，隨著生活方式的迅速轉(zhuǎn)變，我國非酒精性脂肪性肝病發(fā)展日益加重[3-4]。因此，NAFLD的發(fā)病機制和藥物防治已經(jīng)成為當前中醫(yī)研究熱點。

化脂復肝顆粒是根據(jù)陜西省中醫(yī)醫(yī)院名中醫(yī)張瑞霞治療脂肪肝的經(jīng)驗方制成的中成藥，其可減輕四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷，可明顯降低乙硫氨酸誘導的脂肪肝大鼠的總膽紅素和TG含量，減輕脂肪肝重量和肝臟病理損傷[5]。張欣等[6]和李小瑞等[7]報道采用化脂復肝顆粒治療脂肪肝患者的總有效率分別達到 86.9% 和 86.7%，證實化脂復肝顆粒具有降低血脂、保肝降酶及改善脂肪肝臨床表現(xiàn)的作用，但目前化脂復肝顆粒治療非酒精性脂肪性肝病的機制并不十分明確。

近年相關研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞是肝臟內(nèi)含量最豐富的非實質(zhì)細胞，肝臟中的巨噬細胞Kupffer細胞(KCs)是肝臟中炎癥因子的最主要來源，KCs被激活后，其分泌的各種細胞因子會直接作用于肝臟內(nèi)的其他細胞，能夠直接影響肝臟內(nèi)的脂質(zhì)代謝而誘發(fā)脂肪肝[8]，在NAFLD進展及肝臟炎癥損傷中發(fā)揮不可或缺的作用[9-10]。本研究分離培養(yǎng)SD大鼠原代肝臟KCs，通過設置不同實驗組別，觀察LPS、高糖對肝臟KCs炎癥通路的刺激作用，并以化脂復肝顆粒含藥血清干預，進一步解釋化脂復肝顆粒通過改善內(nèi)毒素血癥治療NAFLD的分子機制。

1 材料與方法

1.1 原代SD大鼠KCs分離與培養(yǎng) 4周齡雄性SD大鼠禁食不禁水48 h，斷頸處死。肝內(nèi)灌注預熱灌注液，待肝臟脂肪變軟后以37 ℃預熱0.5%Ⅳ型膠原酶灌注，剔除肝包膜及結(jié)締組織，剪碎至2 mm×2 mm×2 mm小塊，酶解消化，200目篩網(wǎng)過濾。離心取上清后再次離心，沉淀細胞行Percoll 密度梯度離心，收集KCs，制備1×106個/ml細胞懸液，接種6孔培養(yǎng)板，37 ℃溫箱內(nèi)孵育20 min，PBS洗去未貼壁細胞，繼續(xù)培養(yǎng)備用。

1.2 KCs分組及處理 分離培養(yǎng)KCs 48 h后，隨機將其分為空白組、LPS干預組、LPS+空白血清組、LPS+化脂復肝組、高糖+對照組、高糖+LPS干預組、高糖+LPS+空白血清組、高糖+LPS+化脂復肝組，LPS干預濃度為100 ng/ml，高糖干預為于KCs培養(yǎng)基中另加入葡萄糖30 mmol/L。

1.3 藥物及試劑、儀器 化脂復肝顆粒，陜西省中醫(yī)醫(yī)院提供；CCK-8試劑盒，碧云天生物公司；ELISA試劑盒，CUSABIO公司；RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 實時熒光定量試劑盒，TAKARA公司；酶標儀(MK3)，THERMO 公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，Sanyo公司。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 促炎因子指標：收集培養(yǎng)基，離心取上清，ELISA法測定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)含量。

1.4.2 RT-qPCR測定KCs中Toll 樣受體4(TLR4)、髓樣分化因子(MyD88)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65(NF-κB p65)、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構域相關蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)、TNF-α、IL-1β、IL-18 mRNA表達量。

收集細胞，取適量細胞樣本加入Trizol室溫裂解5 min，加入1/5Trizol體積的氯仿提取，并用異丙醇沉淀RNA后用75%乙醇洗滌，用滅菌DEPC水溶解抽提總RNA。取1 μg RNA用Super ScriptTMⅡ Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR Green染料法進行擴增檢測。引物序列：βactin-F 5’-ACCCTAAGGCCAACCGTGAAA-3’，βactin-R 5’-ATGGCGTGAGGGAGAGCATA-3’；TLR4-F 5’-TTCTGCAATGTCTCTGGCAGG-3’，TLR4-R 5’-GCTGAGACTTGGTAGGGCCA-3’；MyD88-F 5’-TGTTCTTGAACCCTCGGACG-3’，MyD88-R 5’-TTCCAGCTCTCGGATCTCCA-3’；NF-κB p65-F 5’-ATCATCGAACAGCCGAAGCA-3’，NF-κB p65-R 5’-TGATGGTGGGGTGTGTCTTG-3’；TNF-α-F 5’-AGGCACTCCCCCAAAAGATG-3’；TNF-α-R 5’-ACTGATGAGAGGGAGGCCAT-3’；NLRP3-F5’-CCTTAAGCTGGAGCTGCTGT-3’；NLRP3-R5’-TCACCTCTCGGCAGTGGATA-3’；Caspase-1-F5’-ACTGCTATGGACAAGGCACG-3’；Caspase-1-R5’-CCTGCCAGGTAGCAGTCTTC-3’；IL-1β-F5’-TTCAGGCAGGCAGTATCACTC-3’；IL-1β-R5’-GAAGGTCCACGGGAAAGACAC-3’；IL-18-F5’-GACTCTTGCGTCAACTTCAAGG-3’；IL-18-R5’-CAGGCTGTCTTTTGTCAACGA-3’。反應體系：Power SYBR=Green Master Mix 10 μl，10 μmol/L Forward Primer 0.5 μl，10 μmol/L micro-R 0.5 μl，SDW 8 μl，cDNA 1.0 μl，用DEPC水定容到總體積20 μl。反應條件：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～34 s，40個循環(huán)，60 ℃處收集熒光；55～95 ℃繪制溶解曲線。每個樣品重復3次，用2-△△Ct法計算基因的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1 各組KCs增殖情況比較 空白及高糖培養(yǎng)對照組KCs不斷增殖，長勢良好；LPS+化脂復肝組與高糖+LPS+化脂復肝組KCs緩慢增殖，非高糖組KCs均較含高糖組KCs增殖速率更快；而LPS或高糖+LPS誘導模型組及各加空白血清組KCs于第6 h開始出現(xiàn)凋亡，含高糖組KCs均較非高糖組KCs凋亡速率更快。見圖1。

2.2 各組KCs培養(yǎng)基上清液中促炎因子TNF-α、IL-1β的含量比較 非高糖各組與含高糖各組中促炎因子TNF-α、IL-1β含量均呈相同變化趨勢，且含高糖各組上述促炎因子含量均較非高糖組高。以非高糖組為例，LPS誘導模型組和LPS+空白血清組的促炎因子TNF-α與IL-1β含量均顯著高于對照組(P<0.05)，LPS誘導模型組與LPS+空白血清組間TNF-α與IL-1β含量比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與LPS誘導模型組或LPS+空白血清組比較，LPS+化脂復肝組促炎因子TNF-α與IL-1β含量均顯著降低(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組KCs中TLR4/NF-κB/NLRP3通路相關基因表達水平比較 非高糖各組與含高糖各組中炎癥相關基因(TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-18)表達水平均呈相同變化趨勢，且含高糖各組上述促炎因子及炎癥相關基因表達水平均較非高糖組高。以非高糖組為例，LPS誘導模型組和LPS+空白血清組KCs中炎癥相關基因TLR4、MyD88等的mRNA表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，LPS誘導模型組與LPS+空白血清組間KCs中炎癥相關基因TLR4、MyD88等的mRNA表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與LPS誘導模型組及LPS+空白血清組比較，LPS+化脂復肝組KCs中炎癥相關基因TLR4、MyD88等的mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注：與對照組比較，*P<0.05

圖3 RT-qPCR檢測KCs中各炎癥相關基因表達水平

3 討 論

NAFLD又稱代謝相關脂肪性肝病(Metabolic associated fatty liver disease,MAFLD)，包括單純脂肪變性和脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)，可進展為肝臟纖維化及不可逆的肝硬化和肝細胞肝癌[11]。早期單純性脂肪肝的患者幾乎不表現(xiàn)出不良結(jié)果，隨著疾病進展，如進展至NASH，可出現(xiàn)多種并發(fā)癥，如肝衰竭、2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)、心血管疾病、腎臟疾病等代謝相關疾病[12-15]。近年來，對NAFLD的發(fā)病機制的研究有了重大進展。關于NAFLD的發(fā)病機制，之前的“雙重打擊”學說不足以解釋NAFLD中發(fā)生的相關分子和代謝變化，目前較推崇的是“多重打擊”學說，其反映了NAFLD的發(fā)病過程的復雜性。其發(fā)病機制可能包括胰島素抵抗、脂肪因子損傷、脂肪組織分泌炎癥因子、腸道菌群紊亂、基因及表觀遺傳學異常、氧化應激、環(huán)境影響及飲食因素等[16-18]。

KCs占全身巨噬細胞總數(shù)的80%～90%，是體內(nèi)最大的巨噬細胞群，占肝臟細胞總數(shù)的15%，占肝臟非實質(zhì)性細胞的20%～25%，占肝竇細胞總數(shù)的30%，是肝臟防御系統(tǒng)主要成員。KCs特殊的細胞結(jié)構和生理功能及其在肝臟和全身巨噬細胞中所處的地位和性質(zhì)決定了它在全身和肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。在NAFLD中，KCs大量浸潤[19]，且極化的KCs會促進NAFLD中肝臟炎癥-纖維化的啟動和進展[20]。KCs激活后通過產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、INF-β等炎癥因子招募T淋巴細胞、NKT細胞等炎癥細胞，間接參加炎癥和免疫反應[21]。

有研究指出，NAFLD的進展進一步受到核苷酸結(jié)合域、富含亮氨酸的家族、熱蛋白結(jié)合域因子-3(NLRP3)炎性小體的影響。NLRP3炎性小體是一種多聚體復合物，是炎癥反應中常見的急性產(chǎn)物。NLRP3炎性小體在慢性肝病的晚期進展如NAFLD向NASH的進展中起重要作用。Wree等[22]證明，經(jīng)膽堿氨基酸缺乏的飲食喂養(yǎng)，WT小鼠出現(xiàn)肝臟重量增加、血漿ALT和AST 升高等肝臟病理變化，而NLRP3-/-小鼠的肝腫大和肝損傷的表現(xiàn)則明顯減輕。同樣，與正常人比較，NASH 患者的 NLRP3、IL-1β及 IL-18 水平則明顯升高[22]。與正常飲食小鼠比較，高脂飲食組小鼠的 NF-κB的活性高出2倍，且伴有肥胖程度和胰島素抵抗的增加，以及炎性細胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α等的升高[23]。此外，有學者通過體外研究發(fā)現(xiàn)，細菌DNA含有的未甲基化的胞嘧啶-鳥苷二核苷酸(CpG)序列，可與KCs表面的TLR9結(jié)合，可通過Toll/白介素-1受體(TIR)結(jié)構域啟動MyD88依賴性途徑，從而增強促炎基因的表達和產(chǎn)生IL-1β等[24]。

本研究通過用LPS或加高糖刺激KCs誘導炎癥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCs中炎癥因子TNF-α、IL-1β含量以及炎癥相關基因TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-18 mRNA表達水平均顯著升高，且含高糖各組上述促炎因子及炎癥相關基因表達水平均較非高糖組更高。經(jīng)化脂復肝顆粒含藥血清治療組后，促炎因子TNF-α與IL-1β含量均顯著降低，炎癥相關基因TLR4、MyD88、NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65、TNF-α、IL-1β、IL-18的mRNA表達水平也均顯著降低(P<0.05)。提示化脂復肝顆粒含藥血清可改善KCs活力，有效減輕KCs炎癥反應，減少KCs細胞焦亡的發(fā)生，具有顯著的抗炎、抗氧化損傷及保肝作用，推測其作用機制與TLR4/MyD88/NF-κB p65/NLRP3信號通路直接相關，為非酒精性脂肪性肝病的治療提供了新的思路及靶點。