知母皂苷AⅢ調(diào)控miR-494對原發(fā)性皮膚黑色素瘤生物學(xué)行為的影響

唐劍輝，黃昭明，余盼盼，朱必勝，劉啟勝

(咸寧市中心醫(yī)院，湖北 咸寧 437100)

黑色素瘤是來源于黑色素細(xì)胞起病的高度惡性的腫瘤，多發(fā)生于皮膚、眼睛，皮膚黑色素瘤與古籍中的“厲癰” “翻花”等十分相似，《內(nèi)經(jīng)》中對“厲癰”的描述為“其狀赤黑”，《外科正宗》中對“翻花”描述為“烏烏黑黑”[1]。近年來，惡性黑色素瘤的發(fā)生率和病死率逐年升高，致死年齡降低[2]。因此，惡性黑色素瘤的早期診斷和治療極其重要。

黑色素瘤基本病因是黑素細(xì)胞發(fā)生DNA損傷。中藥知母是指植物知母的干燥根莖，性寒、味苦、有滋陰潤肺、泄熱清火、止咳等功效，知母皂苷AⅢ是知母的最主要活性成分之一，具有改善記憶功能、抗炎、抗氧化、抗病毒、降低血糖、降低血壓、抗腫瘤等藥理活性[3-4]。miR-494可以調(diào)控多種腫瘤疾病的進(jìn)程。miR-494介導(dǎo)人成纖維細(xì)胞生長因子受體2調(diào)控骨肉瘤細(xì)胞侵襲和遷移[5]。miR-494-3p靶向HTRA1調(diào)節(jié)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞生物學(xué)功能[6]。miR-494-3p靶向配子生成素結(jié)合蛋白2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]。本實(shí)驗(yàn)主要研究知母皂苷AⅢ調(diào)控miR-494對原發(fā)性皮膚黑色素瘤增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 知母皂苷AⅢ購自上海同田生物技術(shù)股份有限公司；人黑色素瘤A375細(xì)胞株購自美國 ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，批號：086-150；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物科技有限公司；二辛可寧酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒來源于上海碧云天生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel膠購自廣州銳博生物科技有限公司；Cyclin D1、MMP-2、MMP-9抗體購自美國CST公司；β-actin購自美國Santa Cruz公司；Trizol試劑購自日本Takara公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：體外培養(yǎng)人黑色素瘤A375細(xì)胞，分別用0.9%氯化鈉溶液(對照組)、4 μmol/L低劑量組、8 μmol/L中劑量組、16 μmol/L高劑量組的知母皂苷AⅢ處理A375細(xì)胞24 h，作為對照組、4 μmol/L低劑量組、8 μmol/L中劑量組、16 μmol/L高劑量組。將miR-NC、miR-494轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞，作為miR-NC、miR-494組；將anti-miR-NC、anti-miR-494轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞，再用知母皂苷AⅢ(16 μmol/L)作用，作為anti-miR-NC+16 μmol/L組、anti-miR-494+16 μmol/L組。

1.2.2 細(xì)胞增殖情況檢測：按每孔0.5×104接種96孔板收集細(xì)胞，按照對照組、8 μmol/L中劑量組、16 μmol/L高劑量組分組處理后，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)培育4 h，在酶標(biāo)儀490 nm處測量細(xì)胞吸光度A值，將吸光度A值轉(zhuǎn)換為細(xì)胞存活率，得出細(xì)胞增殖的結(jié)果。

1.2.3 檢測細(xì)胞Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的蛋白表達(dá)情況：每組細(xì)胞以2.5×104個(gè)/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)1 d后，收集細(xì)胞，使用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，在蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA法)定量后，再進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，再將封閉與5%脫脂奶粉溶液中1 h。分組放入Cyclin D1(1∶1000)、MMP-2(1∶1000)、MMP-9(1∶1000)進(jìn)行一抗和二抗，然后加顯影液進(jìn)行顯影，避光拍照，觀察蛋白條帶，計(jì)算蛋白表達(dá)。

1.2.4 檢測細(xì)胞遷移和侵襲情況：將200 μl細(xì)胞(1×105)接種在Transwell上腔室中進(jìn)行細(xì)胞遷移，并將600 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基加入下腔室。37 ℃下孵育24 h，將下腔室中的細(xì)胞在1%甲醛中固定20 min，并用0.1%結(jié)晶紫染色20 min。Olympus顯微鏡下觀察細(xì)胞，并取5個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域的平均值為遷移細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲，在上腔室中預(yù)涂了Matrigel膠，其余步驟與上述步驟相同。

1.2.5 檢測細(xì)胞miR-494表達(dá)水平：Trizol試劑提取各組細(xì)胞中總RNA，檢測各組中總RNA的純度和濃度，在A260 nm/A280 nm處于1.8～2.0范圍內(nèi)說明其情況良好，能用于擴(kuò)增。嚴(yán)格按照說明書操作，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算相對表達(dá)水平。miR-494上游引物：5’-TGGTGATGGGATTTGAAACATACACGGGAAAC-3’，下游引物：5’-AGATAGACGG-TGTCGCTGTTGAAGTCAG-3’； U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引 物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’[14]。

2 結(jié) 果

2.1 知母皂苷AⅢ對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響 與對照組比較，8 μmol/L中劑量組、16 μmol/L高劑量組的知母皂苷AⅢ處理細(xì)胞后，A值和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而4 μmol/L的知母皂苷AⅢ處理細(xì)胞后，A值和Cyclin D1蛋白表達(dá)水平均無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1(表1)。

圖1 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

表1 知母皂苷AⅢ對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖的影響

2.2 知母皂苷AⅢ對黑色素瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與對照組比較，8、16 μmol/L的知母皂苷AⅢ處理細(xì)胞后，細(xì)胞遷移數(shù)、細(xì)胞侵襲數(shù)以及遷移相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，說明知母皂苷AⅢ可明顯抑制黑色素瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲。見圖2(表2)。

圖2 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

表2 知母皂苷AⅢ對黑色素瘤A375細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.3 知母皂苷AⅢ對黑色素瘤A375細(xì)胞miR-494表達(dá)的影響 與對照組比較，8 μmol/L中劑量組、16 μmol/L高劑量組的知母皂苷AⅢ處理細(xì)胞后，miR-494相對表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，說明知母皂苷AⅢ可能通過調(diào)控miR-494的表達(dá)發(fā)揮作用。見表3。

表3 知母皂苷AⅢ對黑色素瘤A375細(xì)胞miR-494表達(dá)的影響

2.4 過表達(dá)miR-494對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-494組細(xì)胞A值、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，說明過表達(dá)miR-494可抑制黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。見表4(圖3)。

表4 過表達(dá)miR-494對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖3 Western blot法檢測蛋白表達(dá)

2.5 抑制miR-494逆轉(zhuǎn)知母皂苷AⅢ(16 μmol/L)對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與anti-miR-NC+16 μmol/L組比較，anti-miR-494+16 μmol/L組細(xì)胞miR-494表達(dá)水平顯著降低；細(xì)胞A值、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量以及Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，說明知母皂苷AⅢ可通過miR-494抑制黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。見表5(圖4)。

表5 抑制miR-494逆轉(zhuǎn)知母皂苷AⅢ對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

黑色素瘤惡性程度很高，如果治療不及時(shí)則會病情兇險(xiǎn)，《內(nèi)經(jīng)》中提到，發(fā)現(xiàn)“厲癰”后應(yīng)該立即治療，將黑色消除，如果黑色不退反而加重，則無藥可治，命不久矣?，F(xiàn)代研究表明，長期紫外線照射、摩擦、外傷刺激等導(dǎo)致黑色素細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂、轉(zhuǎn)位、突變或異常甲基化等，黑色素細(xì)胞發(fā)生增殖失控和分化異常，最后發(fā)展為惡性腫瘤細(xì)胞[1,8-9]。惡性黑色素瘤好發(fā)于男性，且男性患者病死率比女性患者高。女性患者的腫瘤好發(fā)部位是腿部，男性則為背部和頭頸部。

知母是常用中藥，有廣泛的藥理學(xué)作用，歸肺、胃、腎經(jīng)，可用于內(nèi)熱消渴、高熱煩渴、腸燥便秘等的治療，知母皂苷是知母的重要組成部分，近些年來，隨著對知母皂苷的不斷研究，發(fā)現(xiàn)知母皂苷AⅢ是典型的螺甾皂苷類物質(zhì)，有抗血小板聚集、改善學(xué)習(xí)記憶能力等作用[3,10]。有文獻(xiàn)[11]的結(jié)果說明，知母皂苷AⅢ可以抑制腫瘤的生長。知母皂苷AⅢ抑制人腦膠質(zhì)瘤增殖和生長[12]。知母皂苷AⅢ可以促進(jìn)曲美替尼對肺癌A549細(xì)胞抑制活性[13]。知母皂苷AⅢ抑制白血病細(xì)胞HL-60增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并延長細(xì)胞周期[14]。知母皂苷AⅢ通過抑制PI3k/AKT信號通路的激活來抑制急性B淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的生長發(fā)展[15]。知母皂苷AⅢ具有抗鼻咽癌增殖的作用功能[16]。本實(shí)驗(yàn)研究表明，與對照組比較，知母皂苷AⅢ明顯下調(diào)組細(xì)胞A值、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量明顯降低。潘會君等[17]研究結(jié)果，知母皂苷AⅢ能夠抑制黑色素瘤B16細(xì)胞生長，并能誘導(dǎo)部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，我們的結(jié)果與前人研究結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，知母皂苷AⅢ明顯上調(diào)細(xì)胞miR-494表達(dá)水平。知母皂苷AⅢ調(diào)控黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲可能是通過調(diào)控miR-494的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)與miR-NC組比較，miR-494組細(xì)胞A值、遷移和侵襲數(shù)量以及遷移侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達(dá)水平明顯降低。這提示，過表達(dá)miR-494可顯著抑制黑素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。 已經(jīng)有研究報(bào)道與本實(shí)驗(yàn)類似，miR-494可以促進(jìn)黑素瘤A375細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞的周期[18]。

已有研究顯示，中藥可通過調(diào)控miRNA的表達(dá)發(fā)揮其抗腫瘤功效。嚴(yán)淑等[19]發(fā)現(xiàn)甘草素可通過調(diào)控miRNA抑制人黑色素瘤A375細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。李燕華等[20]也在研究中證實(shí)中藥白藜蘆醇可通過調(diào)控miR-506的表達(dá)可抑制黑色素瘤的生物學(xué)表達(dá)。本研究結(jié)果表明，與anti-miR-NC+16 μmol/L組比較，anti-miR-494+16 μmol/L組細(xì)胞A值、遷移數(shù)量和侵襲數(shù)量顯著升高。這提示，抑制miR-494表達(dá)逆轉(zhuǎn)了知母皂苷AⅢ對黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，這也證實(shí)了我們的猜想：知母皂苷AⅢ可通過調(diào)控miR-494的表達(dá)影響黑色素瘤A375細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上所述，知母皂苷AⅢ上調(diào)miR-494抑制原發(fā)性皮膚黑色素瘤增殖、遷移和侵襲，本研究為該疾病的治療提供了一種治療方式，有了一個(gè)新的靶標(biāo)。