紫檀芪通過調(diào)控細胞自噬對抗大鼠心肌缺血/再灌注損傷

付華君，宋文英，田俊斌，李 揚

(1.陜西省人民醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710068；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710004)

細胞自噬在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要價值。自噬參與降解凋亡細胞以及冗余蛋白質(zhì)、細胞器清除，在維持細胞穩(wěn)定性及線粒體能量利用方面具有積極的意義[1-2]。生理情況下細胞自噬對自身結(jié)構(gòu)和功能具有保護作用，但在病理狀態(tài)下則可能給機體帶來嚴重損壞[3]。研究表明[4-5]，在心肌缺血/再灌注損傷(Myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)過程中，自噬反應(yīng)極其活躍，其可分為兩個階段，在心肌缺血階段，自噬因線粒體能量代謝受損以及氧化應(yīng)激等而激活，這一過程對于心肌細胞功能和結(jié)構(gòu)的維護具有積極的保護意義，但在再灌注階段，過度激活的細胞自噬反作用于心肌細胞，造成蛋白質(zhì)和細胞器清除，最終引起心肌細胞壞死。因此，探索一種調(diào)節(jié)細胞自噬于適當水平的方法或藥物對MI/RI過程中維護心肌功能和結(jié)構(gòu)具有重要意義。有研究報道，紫檀芪作為一種中藥活性成分，可有效抑制腫瘤、治療糖尿病并發(fā)癥、保護心腦血管功能[6]，但在治療MI/RI方面鮮有報道。因此本研究擬構(gòu)建MI/RI大鼠模型，探究紫檀芪在MI/RI過程中的作用，并從自噬方面探究其作用機制，為其在保護心肌功能方面提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗 SD 大鼠，雌雄各半，72只，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，體重160～180 g，動物合格證號SCXK(陜)2014-002，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(24±2)℃，濕度55%，照明采用光照，黑暗/照明=12 h∶12 h，所有大鼠自由進食飲水。

1.2 主要材料 紫檀芪(薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，貨號：A01E1003520050)；阿司匹林注射液(哈藥集團生物工程有限公司，批號：H20084565)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)(貨號：CSB-E14403r)和乳酸脫氫酶(LDH)(武漢華美生物工程有限公司，貨號：CSB-E11324r)；氧化和抗氧化應(yīng)激相關(guān)指標丙二醛(MDA，貨號：A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD，貨號：A001-3-2)、過氧化氫酶(CAT，貨號：A007-1-1)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，貨號：A005-1-2)(南京建成生物工程研究所)；自噬相關(guān)5同源物(Atg5)、卷曲肌球蛋白樣Bcl-2相互作用蛋白(Beclin1)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3Ⅰ/Ⅱ)、p62和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(美國cell signaling technology公司，貨號分別為12994S、3495S、12741S、16177S和5174S)；相對應(yīng)的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：TA09)，其他試劑和耗材等為實驗室?guī)齑妗?/p>

1.3 主要儀器 V1300型分光光度計(上海美析儀器有限公司)；DNM-9606型酶標儀(南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司)；Sorvall Legend Micro 17型低溫高速離心機(賽默飛世爾科技中國有限公司)；8930086D型超低溫冰箱(賽默飛世爾科技中國有限公司)； EX225ZH/AD型分析級天平(奧豪斯儀器上海有限公司)；電Mini Pro3型泳槽(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司)；Bio-Rad Mini型電泳儀(美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品公司)；Quant Studio 6型實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.4 大鼠分組、給藥、模型構(gòu)建及組織收集方法 將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按隨機數(shù)字表法隨機分為六組：假手術(shù)組即假手術(shù)組(10 ml/kg 0.9%氯化鈉溶液灌胃)；MI/RI組即心肌缺血/再灌注損傷模型組(10 ml/kg 0.9%氯化鈉溶液灌胃)；阿司匹林組(30 mg/kg阿司匹林灌胃)；紫檀芪低劑量組(10 mg/kg)、紫檀芪中劑量組(20 mg/kg)和紫檀芪高劑量組(40 mg/kg)灌胃時將其分散于0.9%氯化鈉溶液中。各組連續(xù)給藥14 d，1次/d。

模型構(gòu)建：所有大鼠均于末次給藥1 h后，構(gòu)建MI/RI動物模型。戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，剔除手術(shù)區(qū)域的毛發(fā)，消毒后從左側(cè)第3～4根肋骨開胸，充分暴露心臟，尋找冠狀動脈左前降支，除假手術(shù)組外，所有大鼠均對左前降支下穿線并結(jié)扎(假手術(shù)組只進行穿線但不結(jié)扎)，結(jié)扎30 min后松開結(jié)扎線，恢復(fù)血流后再灌注2 h。

標本收集：上述完成后，采集腹主動脈血，3000 r/min離心10 min，收集上清液，分裝于1.5 ml的離心管中被用于相關(guān)生化指標的檢測；動物處死后取出心臟，0.9%氯化鈉溶液充分洗滌后進行后續(xù)相關(guān)指標檢測。

1.5 大鼠心肌梗死面積的測定 根據(jù)文獻報道方法[7]，將取下的心臟切除心房后，稱取左心室濕重，后沿心臟長軸將其橫切，放入棕色瓶中，用0.5% NBT 磷酸鹽緩沖液37 ℃水浴中浸泡1 min后取出即可(評價方法為梗死區(qū)面積不著色，非梗死區(qū)呈紫紅色，切下梗死區(qū)稱重即可)。心肌梗死面積=(缺血梗死心肌重/左心室濕重)×100%。

1.6 大鼠心功能和血清抗氧化指標的測定 所有指標的測定均嚴格按照試劑盒說明書進行，其中SOD、CK-MB和LDH的測定儀器為酶標儀，GSH-Px、CAT 和 MDA的測定儀器為分光光度計，測定相應(yīng)數(shù)值后，根據(jù)對應(yīng)公式即可計算得到結(jié)果。

1.7 心肌組織形態(tài)學(xué)的觀察 病理學(xué)觀察時，橫切一小塊心肌組織，置入4%的多聚甲醛溶液中保存24～72 h后取出，依次梯度乙醇脫水、浸蠟、包埋切片、脫蠟、蘇木素及伊紅染色、中性樹膠封片等，完成后采用帶有照相功能的光學(xué)顯微鏡拍攝圖像。

1.8 目標蛋白表達的檢測 根據(jù)總蛋白提取試劑盒說明書提取心肌總蛋白，提取后采用BCA法對其定量并調(diào)平，采用水浴鍋煮沸 5 min使蛋白變性，后每組各取50 μg行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，裁剪目的蛋白后，加入5%的牛血清蛋白封閉2 h，2 h后取出加入一抗封閉過夜孵育，次日取出后加入二抗孵育30 min，洗滌3次后暗室曝光洗片，Image J計算各條帶灰度值，進行比較分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用 Student’st檢驗；以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 在整個實驗過程中，有部分大鼠發(fā)生死亡，其中假手術(shù)組無死亡情況出現(xiàn)，MI/RI組死亡2只，阿司匹林組死亡1只，紫檀芪低劑量組和中劑量組各死亡2只，紫檀芪高劑量組死亡1只。

2.2 心肌組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，細胞核均勻分布清晰可見，MI/RI組心肌纖維出現(xiàn)明顯的斷裂，部分壞死，部分細胞結(jié)構(gòu)模糊，與MI/RI組比較，各治療組明顯好轉(zhuǎn)(圖1)。

圖1 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果(×400)

2.3 心肌梗死面積 假手術(shù)組未見心肌梗死，MI/RI組心肌梗死面積明顯增加；與MI/RI組比較，紫檀芪干預(yù)組和阿司匹林組心肌梗死面積均明顯降低，但紫檀芪各組并無劑量依賴性，差異并不明顯，此外紫檀芪給藥組與阿司匹林組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與MI/RI組比較，#P<0.05

2.4 血清心功能指標LDH和CK-MB比較 與假手術(shù)組比較，模型組LDH 和CK-MB 明顯升高(P<0.05)，給予紫檀芪和阿司匹林治療后二者均明顯降低(P<0.05)，但紫檀芪給藥組與阿司匹林組比較并無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清心功能指標LDH和 CK-MB比較(U/L )

2.5 對血清氧化和抗氧化指標的影響 與假手術(shù)組比較，MI/RI組大鼠血清中 SOD、CAT 和 GSH-Px 含量明顯降低，而MDA 則明顯增加(P<0.05)。與 MI/RI組比較，各治療組 MDA 含量顯著降低，SOD、CAT和GSH-Px均明顯升高(P<0.05)；此外，紫檀芪中劑量組和高劑量組SOD、CAT和GSH-Px明顯高于阿司匹林組(P<0.05)，MDA則明顯低于阿司匹林組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清氧化和抗氧化指標比較

2.6 對自噬相關(guān)蛋白表達的影響 與假手術(shù)組比較，MI/RI組大鼠心肌組織中 LC3Ⅱ、Beclin1和Atg5 蛋白表達均明顯升高，p62 蛋白表達明顯表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與 MI/RI 組比較，紫檀芪各劑量組LC3Ⅱ、Beclin1 和 Atg5 蛋白表達明顯下降，p62 蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白表達圖(其中A、B、C、D、E和F分別為假手術(shù)組、MI/RI組、阿司匹林組、紫檀芪低、中、高劑量組)

表3 各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白的相對表達量

3 討 論

紫檀芪化學(xué)名為3,5-二甲氧基-4’-羥基二苯乙烯，其因首次發(fā)現(xiàn)于紫檀中而命名，是白藜蘆醇的二甲基衍生物[8]。當前關(guān)于白藜蘆醇的研究目前已經(jīng)較多，而紫檀芪的研究相對較少，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實紫檀芪和白藜蘆醇在藥理活性上具有相似性，二者均可以有效的抑制腫瘤、治療糖尿病并發(fā)癥、保護心腦血管疾病等，其機制可能與提高抗氧化能力及減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)[9-10]。紫檀芪在親脂性和口服吸收效率上明顯增加，因此具有更高的生物利用度[11]。近年來關(guān)于紫檀芪在心臟相關(guān)疾病包括MI/RI的研究也有相關(guān)文獻報道[12-14]，本研究同樣采用紫檀芪干預(yù)MI/RI大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫檀芪在降低心肌梗死面積、改善心肌組織病理學(xué)以及調(diào)節(jié)心肌自噬等方面具有很好的效果，與上述學(xué)者的研究具有一致性。

自噬與MI/RI的產(chǎn)生關(guān)系密切，可能是MI/RI后心肌有效恢復(fù)的核心。自噬發(fā)生的過程中，Beclin1、Atg5、LC3和p62四種蛋白起關(guān)鍵作用，故也被認為是自噬過程的特異性標記物[15-16]。在上述四種蛋白中，Beclin1 主要作用為與Ⅲ型磷脂酰肌醇 3-激酶(PI3KC3)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這種穩(wěn)定的復(fù)合物可以調(diào)控ATG 蛋白自噬體的形成。而在ATG蛋白中，又以Atg5 為核心，其主要作用為促進相關(guān)自噬體的延伸[17]。LC3Ⅱ是可以反映自噬體數(shù)量的核心指標，其含量的高低可以準確的反應(yīng)自噬體數(shù)量的高低[18-19]。p62則正好相反，其主要作用為吞噬自噬體，進而抑制自噬的發(fā)生[20]。對于心肌缺血/再灌注損傷而言，當細胞發(fā)生自噬時，Beclin1、LC3Ⅱ及 Atg5表達增加，p62 表達下降，因此通過檢測上述四個指標可以準確的反應(yīng)細胞自噬發(fā)生的狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)相較于假手術(shù)組，MI/RI組Beclin1、LC3Ⅱ及 Atg5表達增加，p62 表達下降，這和相關(guān)文獻報道是一致的[21]，而相較于MI/RI組，各治療組Beclin1、LC3Ⅱ及 Atg5表達明顯降低，p62表格明顯升高，這提示紫檀芪對MI/RI細胞自噬的發(fā)生具有明顯的抑制作用。

細胞自噬是一個復(fù)雜的過程，文獻報道[22]氧化應(yīng)激與細胞自噬存在相互作用。MI/RI過程中心肌細胞線粒體功能障礙，細胞產(chǎn)生過量自由基，進而激活氧化應(yīng)激。在氧化應(yīng)激過程中，核酸以及脂類等大分子會被破壞、分解，產(chǎn)生大量自由基和MDA，因此MDA也常被用來評價心肌細胞是否受到氧化應(yīng)激攻擊的指標。對于氧化應(yīng)激而言，體內(nèi)也存在著一些防御系統(tǒng)，這些防御系統(tǒng)包括SOD、CAT 和 GSH-Px 等[23]，這些抗氧化因子的存在有利地清除了過氧化產(chǎn)物，保護了心臟。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，MI/RI組心肌組織中MDA明顯升高，而SOD、CAT和 GSH-Px顯著下降，這提示，在心肌缺血/再灌注損傷過程中，氧化應(yīng)激增加，而紫檀芪則可以明顯的降低MDA，同時升高SOD、CAT 和GSH-Px 水平。這提示，紫檀芪可提升MI/RI大鼠心肌的抗氧化能力。

綜上所述，本研究提示紫檀芪能減輕大鼠MI/RI，其可能的機制是抑制自噬、減輕氧化應(yīng)激和維持心肌細胞完整性。