參七蟲草方通過抑制促血管生成因子表達(dá)改善大鼠肺組織纖維化實(shí)驗(yàn)研究

何 程,陳 煒,張念志

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科，安徽 合肥 230031)

特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種起源于肺泡上皮反復(fù)發(fā)生損傷后的異常修復(fù)的間質(zhì)性肺疾病，其特征是在肺內(nèi)進(jìn)行性形成廣泛纖維組織[1]，5年生存率僅有20%，早期明確診斷困難，病死率高達(dá)50%[2-3]。迄今為止，西醫(yī)治療選擇有限，缺乏對疾病進(jìn)展顯著有效的治療藥物，肺功能逐漸惡化，出現(xiàn)呼吸衰竭、心力衰竭，終致死亡[4-5]。

最新研究表明，炎癥反應(yīng)在IPF的早期損傷階段發(fā)揮重要作用，而IPF發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)是肺損傷后血管生成開關(guān)失衡，血管出現(xiàn)過度新生，血管生成的失控必然會引起炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)的失控[6]。血管新生是由促血管生成因子和抑制血管生成因子的精妙調(diào)控，保持動態(tài)平衡[7]。IPF過程中，血管生成過程中促血管生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)高表達(dá)，促進(jìn)磷酸肌3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)磷酸化，分泌細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[8-9]。因此，早期干預(yù)IPF的血管新生至關(guān)重要。

本課題組認(rèn)為IPF發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)乃“肺失治節(jié)，因虛致瘀”[10]。肺失治節(jié)，氣血失和，因虛致瘀，痰瘀滯絡(luò)，出現(xiàn)血管新生，組織重塑，推進(jìn)IPF的進(jìn)程。參七蟲草方是國醫(yī)大師韓明向教授“虛瘀”病機(jī)理論指導(dǎo)下的臨床效驗(yàn)方，前期研究表明[11-15]，參七蟲草方可減輕炎癥反應(yīng)，改善肺纖維化的程度。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，觀察參七蟲草方對模型大鼠血管新生相關(guān)因子的動態(tài)影響，探究其調(diào)控靶點(diǎn)及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 128只8周齡SPF級SD大鼠，體重(220±20)g，由濟(jì)南朋悅公司提供，動物許可證號：SCXK(魯)2014-0007。

1.2 主要藥物和試劑 參七蟲草方(西洋參15 g，冬蟲夏草3 g，三七10 g，安徽省中醫(yī)院草藥房提供)，氯沙坦鉀片(規(guī)格50 mg/片，國藥準(zhǔn)字 H20070264，浙江華海藥業(yè))，Trizol(批號204403，Life technogies公司)；Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(批號0512841，Novoprotein公司)，VEGF抗體(批號GR116031-1，美國Abcam公司)，PI3K抗體(批號GR221840-1，美國Abcam公司)，AKT抗體(批號GR24003-93，美國Abcam公司)，HIF-1α(批號GR204055-13，美國Abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 普通PCR儀(杭州晶格公司)，熒光定量PCR(Thermo Scientific公司)；低速迷你離心機(jī)(海門其林貝爾公司)，高速臺式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模、分組及給藥：將128只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成參七蟲草組、氯沙坦組、模型組以及空白組，每組32只。除空白組外均采用博來霉素(BLM)氣管內(nèi)一次性滴注法[16]造IPF模型，將灌胃針置于后咽部，緩慢注入濃度為5 mg/ml的BLM(5 mg/kg)0.2～0.3 ml，注完后迅速將大鼠直立并反復(fù)旋轉(zhuǎn)8～10次，使藥液均勻在肺內(nèi)分布，空白組則同上方法向氣管內(nèi)注入等量0.9%氯化鈉溶液。造模后，對各組大鼠每日進(jìn)行灌胃，模型組、空白組均予以0.9%氯化鈉溶液1 ml/(kg·d)灌胃，參七蟲草組予以0.38 g/(kg·d)參七蟲草方灌胃、氯沙坦組予以10 mg/(kg·d)氯沙坦混懸液灌胃。造模成功后，分別予第7、14、21和28天，分別在各組內(nèi)隨機(jī)抽取8只大鼠處死，取出肺組織，福爾馬林固定左肺下葉，用液氮冷凍保存右肺，以備下一步實(shí)驗(yàn)使用。

1.4.2 記錄大鼠體重及一般情況：記錄四組大鼠第7、14、21、28天的體重，同時觀察各組大鼠的精神、活動、毛發(fā)、呼吸以及飲食情況。

1.4.3 HE染色觀察肺臟病理學(xué)變化：取出浸泡在10%甲醛溶液不同時期的左肺下葉，脫水、包埋、切片等常規(guī)病理學(xué)處理后，觀察肺臟炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有無滲出物，有無充血水腫改變等。

1.4.4 Masson染色觀察肺臟膠原沉積程度：左側(cè)肺組織切片脫水，封片。觀察肺泡結(jié)構(gòu)及纖維結(jié)節(jié)，膠原沉積情況。

1.4.5 RT-PCR檢測肺組織中PI3K、AKT、HIF-1α、VEGF的mRNA表達(dá)：取出液氮保存的不同時間點(diǎn)的右肺組織50～100 mg，嚴(yán)格按照TRIzol試劑盒步驟提取各組的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，每個樣品重復(fù)3次，然后利用PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增操作，反應(yīng)條件為95 ℃ 60 s；95 ℃ 20 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，用2-△△Ct法計算各指標(biāo)的表達(dá)水平。各檢測指標(biāo)引物見表1。

表1 各檢測指標(biāo)引物

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的一般情況 空白組大鼠造模后的一般情況較佳，與造模前比較無明顯改變。模型組大鼠造模后的一般情況日漸下降，較前更為安靜，活動減少，毛發(fā)無光澤，呼吸淺快，食欲下降，實(shí)驗(yàn)的后期，兩肺可聞及痰鳴音，體重較前也有不同程度的減輕。氯沙坦組大鼠造模后精神狀態(tài)不佳，喜靜，皮毛光澤度欠佳，實(shí)驗(yàn)前期該組大鼠食欲明顯下降，伴有嗆咳現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)后期食欲逐漸恢復(fù)正常，嗆咳好轉(zhuǎn)，前期體重下降，后期漸增。參七蟲草組大鼠實(shí)驗(yàn)前期的一般情況與模型組及氯沙坦組相似，但實(shí)驗(yàn)后期該組大鼠的精神、活動、毛發(fā)、呼吸、飲食以及體重情況逐漸改善，整體狀況略優(yōu)于氯沙坦組，但次于空白組。

2.2 參七蟲草方對肺纖維化大鼠體重的影響 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)初期體重差異不明顯，隨著時間推移，各組大鼠體重差距逐漸拉大，第28天時，各組大鼠體重由輕到重的順序依次為模型組、氯沙坦組、參七蟲草組、空白組。見表2。

表2 四組大鼠各時間點(diǎn)體重比較(g)

2.3 HE染色 空白組的大鼠在造模后的不同時間點(diǎn)肺組織結(jié)構(gòu)基本正常。在造模7 d后，模型組大鼠肺組織可見肺泡間隔增寬以及水腫，肺泡腔與支氣管壁有炎細(xì)胞聚集；14 d后，肺泡間隔較前增寬、炎性滲出現(xiàn)象較前加重，肺間質(zhì)有成纖維細(xì)胞增殖以及膠原沉積；21 d后，肺泡內(nèi)的炎性細(xì)胞浸潤狀況較14 d時有減輕，膠原沉積則增多；28 d后，肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重紊亂，纖維增生以及膠原沉積增多，炎性細(xì)胞少見。參七蟲草組以及氯沙坦組肺組織病理變化的趨勢近似于模型組，但各時間點(diǎn)上改變程度均輕于模型組，而參七蟲草組又輕于氯沙坦組。見圖1。

圖1 各組不同時間點(diǎn)肺組織HE染色(×400) 圖2 各組不同時間點(diǎn)肺組織Masson染色(×400)

2.4 Masson染色 空白組大鼠在造模后的各個時期其肺組織均未見到明顯異常。模型組大鼠隨著時間推移，其血管壁以及氣管壁附近呈藍(lán)染的膠原纖維面積越大，第28天可在鏡下觀察到大片的深藍(lán)色膠原纖維沉積。與模型組比較，參七蟲草組以及氯沙坦組在同一時間點(diǎn)其肺間質(zhì)周圍的藍(lán)色膠原纖維的面積較小，染色的顏色也相對較輕。與氯沙坦組比較，參七蟲草組的藍(lán)染程度以及面積更小。見圖2。

2.5 IPF大鼠肺組織第7、14、21、28天的HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平 各時間點(diǎn)，與空白組比較，模型組、參七蟲草組、氯沙坦組大鼠肺組織HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT mRNA的表達(dá)量均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且表達(dá)量與時間成正比。在相同時間節(jié)點(diǎn)，氯沙坦組和參七蟲草組HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。氯沙坦組和參七蟲草組HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3～6。

表3 各組不同時間點(diǎn)HIF-1αmRNA相對表達(dá)量比較

表4 各組不同時間點(diǎn)VEGF mRNA相對表達(dá)量比較

表5 各組不同時間點(diǎn)PI3K mRNA相對表達(dá)量比較

表6 各組不同時間點(diǎn)AKT mRNA相對表達(dá)量比較

3 討 論

IPF為肺臟的慢性虛損性疾患，其病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，肺氣虛失卻治節(jié)之功，日久影響金水相生，肺腎氣陰兩虛為本；肺失治水，痰濁滯絡(luò)，瘀血內(nèi)生，痰瘀滯絡(luò)為標(biāo)[17-18]?！胺问е嗡?，痰瘀滯絡(luò)”，故以益氣養(yǎng)陰活血立法的參七蟲草方辨治IPF，乃我院獨(dú)創(chuàng)，由西洋參、冬蟲夏草、三七組成，補(bǔ)益肺腎，益氣養(yǎng)陰活血，從氣血水重建肺之治節(jié)之功。本課題組既往研究[15]已證實(shí)益氣養(yǎng)陰活血能改善肺纖維化狀態(tài)，因此選用參七蟲草方作為本次實(shí)驗(yàn)的治療藥物。有研究表明，氯沙坦鉀片能夠改善由藥物BLM滴注造成的大鼠肺組織纖維化，且已有多篇有關(guān)于肺纖維化實(shí)驗(yàn)選用氯沙坦片作為陽性對照藥物[19-20]，故本研究選用氯沙坦鉀片為對照藥物。

IPF的是一種病因不明的難治性間質(zhì)性肺疾病，其特征是肺功能不可逆下降和高病死率，西醫(yī)缺乏有效的治療手段，是肺病科常見的難治病種。因此干預(yù)IPF的血管新生對IPF患者。有研究已在動物模型中證實(shí)BLM氣管滴注，會增多肺組織新生的血管[21]。血管生成在肺血管完整性、肺泡結(jié)構(gòu)維護(hù)和肺泡修復(fù)性再生中發(fā)揮著重要作用，以恢復(fù)肺實(shí)質(zhì)損傷后的氣體交換功能[22]。本實(shí)驗(yàn)采用BLM誘導(dǎo)IPF模型[16,23-24]，能夠更好的模擬肺組織重塑的特點(diǎn)。病理學(xué)結(jié)果顯示，隨著時間的推移，模型組肺泡結(jié)構(gòu)紊亂加重，纖維增生以及膠原沉積增多，造模成功。結(jié)合肺組織的病理學(xué)可見，參七蟲草方干預(yù)后，參七蟲草組大鼠肺組織膠原沉積減少，血管生成減少，纖維化減輕。

近年來研究發(fā)現(xiàn)血管的生成失調(diào)與纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25]。VEGF是血管生成和生長的關(guān)鍵因子，在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移方面發(fā)揮重要作用[26-27]。當(dāng)組織或細(xì)胞處于缺氧環(huán)境中時，HIF-1α作為機(jī)體在缺氧條件下重要的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，炎癥反應(yīng)中通過促進(jìn)炎癥因子的分泌以及調(diào)節(jié)VEGF[28-29]，發(fā)揮促進(jìn)血管生成的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，參七蟲草方不僅能夠抑制IPF大鼠肺組織中VEGF的表達(dá)，還能夠抑制上游HIF-1α的表達(dá)。PI3K在VEGF激活后可隨之激活，它的活化促使AKT磷酸化，活化后的AKT可進(jìn)一步激活多種蛋白，參與肺組織的血管新生的調(diào)節(jié)[30]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠肺組織中VEGF的表達(dá)量顯著升高，同時也伴隨著PI3K、AKT mRNA表達(dá)量的升高，而在參七蟲草方、氯沙坦的干預(yù)后，HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT mRNA的表達(dá)均有不同程度的降低，表明參七蟲草方可能通過抑制HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT mRNA等促血管生成因子的生成減輕炎癥反應(yīng)及緩解肺纖維化。

綜上所述，參七蟲草方改善BLM誘導(dǎo)的大鼠肺組織的損傷，其機(jī)制可能通過抑制HIF-1α、VEGF、PI3K、AKT mRNA促血管生成因子的生成，延緩其纖維化。這為臨床治療IPF患者提供了新的思路。