馬鈴薯組培脫毒技術(shù)在生產(chǎn)中存在的問題和解決方法

包永佶

（1.威海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 威海 264200；2.威海市薯類脫毒技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 威海 264200）

0 引言

植物組培技術(shù)是未來農(nóng)業(yè)工廠化育苗的重要發(fā)展方向[1]。其具備獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：一是不受外界氣候因素影響，不受時(shí)間限制，一年四季均可進(jìn)行繁殖生產(chǎn)[2]；二是不受空間制約，場(chǎng)所可按照生產(chǎn)規(guī)模進(jìn)行規(guī)劃；三是技術(shù)運(yùn)用廣泛，可運(yùn)用到多種植物的脫毒、快繁、保存和育種中[3-4]；四是能帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益。

我國(guó)馬鈴薯的種植面積已經(jīng)穩(wěn)居全世界第一[5]。馬鈴薯的組培脫毒技術(shù)日臻成熟，近20年脫毒種苗的繁育推廣在生產(chǎn)實(shí)踐中的應(yīng)用得以快速發(fā)展[6]。剝離的莖尖經(jīng)3至6個(gè)月的培養(yǎng)后，通過馬鈴薯病毒檢測(cè)，獲得了脫毒試管苗。對(duì)脫毒試管苗繼代培養(yǎng)，獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)試管苗，形成了工廠化生產(chǎn)。

南方馬鈴薯種植業(yè)受氣候和地理位置影響，曾需用火車從北方運(yùn)輸原種，解決種薯病毒、病害的問題。隨著組培脫毒技術(shù)的推廣，現(xiàn)使用組培脫毒技術(shù)，在本地就可獲得脫毒優(yōu)質(zhì)種薯。

1 馬鈴薯組培脫毒技術(shù)存在的問題

組培脫毒技術(shù)雖然很成熟了，但是在人為操作過程中，仍然存在很多問題。

1.1 植物培養(yǎng)基配置中出現(xiàn)的問題

在植物組培技術(shù)中，植物培養(yǎng)基是植株成活所需營(yíng)養(yǎng)成分的來源，是植株生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。馬鈴薯的培養(yǎng)基普遍使用MS培養(yǎng)基。在配置MS培養(yǎng)基的時(shí)候，傳統(tǒng)做法是按照大量元素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，分門別類進(jìn)行配置[7]，由于配置的母液需要放置在冰箱中，有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)母液發(fā)生沉淀和變質(zhì)而導(dǎo)致基礎(chǔ)培養(yǎng)基發(fā)生問題的情況。目前，由于硝酸銨、硝酸鉀藥品的購(gòu)買程序比較復(fù)雜，很多藥品廠家直接按照MS培養(yǎng)基成分表生產(chǎn)成品，這樣省去了各種藥品稱量配置的過程，在生產(chǎn)上操作極為方便。但是出現(xiàn)了另一個(gè)問題，不同廠家生產(chǎn)的不同批次的MS培養(yǎng)基在使用過程中，會(huì)出現(xiàn)差異。筆者以相同的操作在更換了一次產(chǎn)品后出現(xiàn)了馬鈴薯試管苗生長(zhǎng)異常的現(xiàn)象，如圖1所示。

圖1 馬鈴薯試管苗生長(zhǎng)異?，F(xiàn)象圖

通過觀察，筆者發(fā)現(xiàn)更換MS培養(yǎng)基藥品廠家后馬鈴薯試管苗出現(xiàn)異常，表現(xiàn)出馬鈴薯試管苗增粗、扭曲現(xiàn)象，換回原MS培養(yǎng)基后異常消失。

1.2 組培技術(shù)操作中出現(xiàn)的污染問題

組培的整個(gè)操作過程需要在無菌環(huán)境中進(jìn)行，污染程度的大小成為馬鈴薯組培生產(chǎn)整體成敗的決定因素，污染來源也是在生產(chǎn)操作過程中產(chǎn)生的[8]。

1.2.1 培養(yǎng)植株的容器清潔不徹底，引起污染

盛放培養(yǎng)基的容器，以試管或玻璃瓶、塑料容器為主，以及和其相配的密封蓋。容器的清潔是重要的工作，在清洗過程中，操作者不認(rèn)真，對(duì)瓶壁、蓋子上粘黏的污物處理不徹底，忽視了細(xì)微之處的潔凈，也可能引起后續(xù)培養(yǎng)基的污染，導(dǎo)致試管苗的遺棄。

1.2.2 培養(yǎng)基滅菌不徹底，引起污染

將配置好的培養(yǎng)基分裝到容器后，需進(jìn)行高溫高壓滅菌。如果在高溫高壓滅菌時(shí)，設(shè)置的溫度、壓力、處理時(shí)間沒有按照要求設(shè)定，使滅菌未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，就會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基滅菌不徹底。在長(zhǎng)期生產(chǎn)中也可能忽視了滅菌鍋密封圈的更換，長(zhǎng)期使用導(dǎo)致密封圈老化，滅菌漏氣，也達(dá)不到培養(yǎng)基徹底滅菌的要求，導(dǎo)致培養(yǎng)基的污染。

1.2.3 操作者操作不當(dāng)，引起污染

在超凈工作臺(tái)上的操作是植物組培技術(shù)的重要操作環(huán)節(jié)。操作者沒有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膽B(tài)度，不嚴(yán)格按照無菌操作程序，均可能導(dǎo)致試管苗的污染。常見的操作失誤有：配置的消毒酒精度數(shù)沒有達(dá)到70%～75%的濃度，達(dá)不到消殺目的；操作前，未對(duì)操作室及操作臺(tái)做整體紫外燈和酒精噴殺等滅菌操作；操作者沒有更換衣服、佩戴口罩；操作者手部碰觸試管苗、剪子、鑷子或者瓶口、瓶蓋等部位，對(duì)剪子、鑷子等物件沒有嚴(yán)格在火苗上消殺滅菌；長(zhǎng)期使用超凈工作臺(tái)，忽視了對(duì)其初效過濾器和高效過濾器的清潔和更換。

1.2.4 培養(yǎng)室不潔凈，引起污染

組培技術(shù)中對(duì)培養(yǎng)室環(huán)境的潔凈度要求很高。轉(zhuǎn)移擴(kuò)繁后的試管苗時(shí)，雖有培養(yǎng)容器的密封蓋，但仍然不是真空的。所以在空氣污濁、環(huán)境臟亂差的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，污染是不可避免的。如果組培試管苗在培養(yǎng)室中培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，就會(huì)導(dǎo)致試管苗污染。一般情況下，馬鈴薯在25 ℃左右的培養(yǎng)室，生長(zhǎng)20 d左右就可以進(jìn)行下一次的擴(kuò)繁操作了。

1.3 組培苗在馴化中發(fā)生的問題

馬鈴薯組培試管苗最終在達(dá)到預(yù)期數(shù)量后，要進(jìn)入日光溫室進(jìn)行微型薯的生產(chǎn)。筆者培育的組培試管苗是在恒溫、高濕和弱光環(huán)境下培育生長(zhǎng)的，進(jìn)入溫室，徹底改變了原有的生長(zhǎng)環(huán)境，所以要對(duì)試管苗進(jìn)行馴化，也就是煉苗。

馬鈴薯和其他植物相比，它的試管苗相對(duì)更嬌嫩一些，在馴化過程中，打開培養(yǎng)瓶時(shí)間過快、突然增大光照強(qiáng)度、突然降低濕度等不當(dāng)操作，都會(huì)引起試管苗在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生萎蔫，降低試管苗的成活率。

1.4 日光溫室管理不當(dāng)出現(xiàn)的問題

馴化后的馬鈴薯試管苗移栽進(jìn)入日光溫室的管理極為重要。這個(gè)階段是微型薯生產(chǎn)的最后關(guān)鍵點(diǎn)。日光溫室前期的準(zhǔn)備工作不足，忽視防蟲網(wǎng)的安裝，會(huì)導(dǎo)致外來性蟲害的發(fā)生；忽視溫室殺菌和消毒工作，苗床和基質(zhì)不做消殺，后期溫室培育的薯苗會(huì)滋生病蟲害；基質(zhì)配制不合理，在移栽馴化苗后，會(huì)返苗困難；馴化苗成活后，缺乏定期的施肥，會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯苗營(yíng)養(yǎng)匱乏，出現(xiàn)黃葉、不健壯等癥狀；也有操作者主觀認(rèn)為脫毒苗，無菌無病，忽視溫室苗期的病害預(yù)防，使得脫毒微型薯感染馬鈴薯病害，失去了脫毒種薯的意義。

2 馬鈴薯組培脫毒技術(shù)問題的解決方法

2.1 認(rèn)真配置，杜絕培養(yǎng)基異常

針對(duì)培養(yǎng)基選擇問題，盡量選擇大的藥品廠家，先行購(gòu)買小量MS培養(yǎng)基，嚴(yán)格按照說明配制培養(yǎng)基，小量轉(zhuǎn)移馬鈴薯試管苗，觀察10 d以后，如果沒有發(fā)生試管苗異?，F(xiàn)象，就可以放心進(jìn)行大規(guī)模的繼代擴(kuò)繁或其他用途的培養(yǎng)基配制，避免因更換生產(chǎn)廠家或者批次，導(dǎo)致培養(yǎng)基不同引起試管苗的異常。

2.2 遵守操作規(guī)則，減少污染

2.2.1 認(rèn)真清洗，潔凈容器

嚴(yán)格清洗容器，對(duì)于污漬嚴(yán)重和已經(jīng)污染的器皿和密封蓋，清洗之前，在高溫高壓滅菌鍋中進(jìn)行正規(guī)滅菌，然后再取出進(jìn)行洗滌。目前，由于人工費(fèi)用的增加，很多馬鈴薯種苗企業(yè)通過使用機(jī)器洗瓶子來降低成本。在此建議，在使用機(jī)器清洗容器之前，應(yīng)用適量的消毒劑浸泡容器，使用0.1%的84消毒劑或潔爾滅，效果更佳。

2.2.2 熟悉設(shè)備，設(shè)置正確

購(gòu)買高溫高壓滅菌鍋后，按照使用說明，正確設(shè)置溫度、壓力和處理時(shí)間。及時(shí)更換即將老化的滅菌鍋密封圈，也要定期進(jìn)行滅菌測(cè)試。將滅菌后的培養(yǎng)基在接種室閑置3 d，觀察是否有污染現(xiàn)象。如果培養(yǎng)基正常就可進(jìn)行正常轉(zhuǎn)苗等操作。

2.2.3 嚴(yán)格操作，減少污染

嚴(yán)格按照要求操作植物組培技術(shù)的每個(gè)步驟環(huán)節(jié)。消毒酒精按照75%的濃度進(jìn)行配制，減少95%酒精揮發(fā)濃度不足帶來的隱患；操作前，對(duì)操作室及操作臺(tái)進(jìn)行紫外燈照射30 min，用75%酒精對(duì)操作室和操作臺(tái)進(jìn)行噴殺，做空氣噴霧降塵；操作者操作前進(jìn)行手部清潔，可佩戴一次性手套，用75%酒精滅菌；操作者更換衣服、佩戴口罩，操作時(shí)候不必要不說話和走動(dòng)；對(duì)剪子、鑷子等物件定期在滅菌鍋進(jìn)行消毒，操作時(shí)位置嚴(yán)格定位于火苗前上方，注重操作細(xì)節(jié)；定期對(duì)超凈工作臺(tái)的初效過濾器和高效過濾器進(jìn)行清潔和更換，確保儀器的正常使用。

2.2.4 保持環(huán)境潔凈，避免后期污染

常年保持培養(yǎng)室的清潔，保證光照、溫度、濕度的數(shù)值在合理正常范圍內(nèi)。進(jìn)出培養(yǎng)室快進(jìn)快出，定期對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行滅菌。通常使用移動(dòng)臭氧紫外燈，一個(gè)月進(jìn)行一次30 min的臭氧消殺，能保障培養(yǎng)室處于相對(duì)無菌狀態(tài)。對(duì)馬鈴薯試管苗20 d左右進(jìn)行一次繼代擴(kuò)繁操作，縮短培養(yǎng)時(shí)間，既能保證試管苗的健康生長(zhǎng)，又能保障不增加試管苗培養(yǎng)的成本。

2.3 循序漸進(jìn)，提高試管苗成活率

馬鈴薯試管苗的馴化要循序漸進(jìn)。當(dāng)需要移栽的試管苗生長(zhǎng)到5 cm～7 cm的時(shí)候，開始馴化。先將需要移栽的試管苗帶著瓶子轉(zhuǎn)移出培養(yǎng)室，瓶蓋不動(dòng)，在具備自然光的環(huán)境中培養(yǎng)3 d，使弱光下生長(zhǎng)的試管苗慢慢適應(yīng)光照相對(duì)強(qiáng)的自然光。第4 d，擰松瓶蓋，讓培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的空氣和外界空氣適度流通，使試管苗慢慢接觸培養(yǎng)瓶以外的空氣。第5 d，徹底揭開瓶蓋，試管苗暴露在自然環(huán)境中，但是此時(shí)的環(huán)境濕度要保證在85%以上，如果達(dá)不到，就要在中午光照溫度較高的時(shí)候，對(duì)空氣進(jìn)行噴霧，增加濕度。避免直射強(qiáng)光，棚頂覆蓋遮陽網(wǎng)。第7 d以后即可從瓶中取出試管苗，輕輕清洗掉苗根部的培養(yǎng)基，剪去長(zhǎng)根，保留1 cm～3 cm長(zhǎng)度的根，用0.1%濃度的高錳酸鉀或者百菌清等殺菌劑浸泡試管苗幾分鐘后取出，進(jìn)行移栽定植。

2.4 完善日光溫室，加強(qiáng)日常管理

對(duì)于生產(chǎn)馬鈴薯微型薯的日光溫室，要充分做好前期的準(zhǔn)備配制工作，完善溫室設(shè)施[9]。選擇安裝60目的防蟲網(wǎng)；對(duì)溫室和苗床進(jìn)行殺菌和消毒，殺滅隱藏的菌類和蟲卵；配制配方合理的基質(zhì)，提前做好基質(zhì)消殺，浸透基質(zhì)，移栽馴化苗。目前，很多馬鈴薯種薯生產(chǎn)企業(yè)選擇椰糠作為基質(zhì)，椰糠因透氣性、保濕性好成為馬鈴薯脫毒試管苗溫室育苗的新寵，如圖2所示。

圖2 馬鈴薯脫毒試管苗溫室育苗圖

但是由于椰糠中含有高鹽分，在使用之前要進(jìn)行清洗鹽分的工作。筆者嘗試用浸泡清洗3～4遍的方法，如圖3所示，使椰糠基質(zhì)中的鹽分含量低于0.2%。基本達(dá)到了馬鈴薯育苗的要求。大型育苗企業(yè)擁有比較先進(jìn)的自動(dòng)化溫室，馴化苗的成活率都較高。筆者在這里用簡(jiǎn)易溫室做了2年的試驗(yàn)，試管苗在椰糠基質(zhì)中的成活率獲得了100%的好效果。簡(jiǎn)易溫室長(zhǎng)20 m，寬2.5 m，最外層覆蓋有遮陽網(wǎng)，溫室側(cè)面由60目防蟲網(wǎng)圍繞。將馴化苗移栽到椰糠基質(zhì)上，選用碳纖維細(xì)管在溫室內(nèi)搭建了一個(gè)小拱棚，拱棚外覆蓋塑料膜，提高馴化苗生長(zhǎng)的濕度。

圖3 浸泡清洗圖

馴化苗進(jìn)入溫室后，前7 d的苗期管理尤為重要，一方面要保障溫室的濕度達(dá)到85%以上，另一方面要做好遮陽管理。馴化苗成活后，懸掛粘蟲板。約20 d左右，開展噴施肥料和病害預(yù)防等正常管理。

80 d以后可視不同品種的成熟期進(jìn)行微型薯的采收。本文試驗(yàn)的普通基質(zhì)微型薯，同一品種的單株結(jié)薯在2～3顆，采用椰糠基質(zhì)后，獲得微型薯，單株結(jié)薯達(dá)到5～7顆的成績(jī)。

3 結(jié)語

綜上所述，要提升馬鈴薯組培脫毒技術(shù)水平，環(huán)環(huán)相扣，專注每一個(gè)步驟的細(xì)節(jié)，克服因人為操作帶來的污染損失，真正把握好馬鈴薯組培脫毒技術(shù)，通過生物技術(shù)在生產(chǎn)中提高馬鈴薯質(zhì)量和產(chǎn)量[10]，充分發(fā)揮其應(yīng)有的作用。