外泌體非編碼RNA在胰腺癌化療耐藥中的潛在作用

劉詩詩,歐陽玉娟,盧先州

劉詩詩,歐陽玉娟,盧先州,南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院肝膽外科 湖南省衡陽市 421200

0 引言

胰腺癌是世界上最致命的消化道腫瘤之一,它是2021年全球第七大常見惡性腫瘤,也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因.胰腺癌最常見的類型是胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC).由于早期診斷困難、早期轉(zhuǎn)移、以及對化療反應(yīng)不敏感,胰腺癌患者的五年存活率僅為3%.手術(shù)是徹底治愈胰腺癌的唯一辦法,然而由于早期臨床癥狀不典型,大多數(shù)胰腺癌患者確診時(shí)已經(jīng)進(jìn)入了晚期,錯(cuò)過最佳手術(shù)時(shí)機(jī).晚期胰腺癌患者可通過化療提高生存率,包括吉西他濱(gemcitabin,GEM)、鉑類藥物、5-氟尿嘧啶以及PARP抑制劑等靶向治療藥物.然而,對化療產(chǎn)生多藥耐藥(multiple drug resistance,MDR)是臨床腫瘤學(xué)的主要障礙,可能導(dǎo)致預(yù)后不良.胰腺癌的耐藥機(jī)制很復(fù)雜,包括細(xì)胞內(nèi)藥物攝取減少、藥物外排增加、藥物代謝加速、對藥物誘導(dǎo)的凋亡的抵抗、DNA損傷修復(fù)、影響藥物靶點(diǎn)的突變、癌癥干細(xì)胞的激活以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)改變藥物轉(zhuǎn)運(yùn).因此,進(jìn)一步了解耐藥的潛在分子機(jī)制對于更有效的胰腺癌治療是十分必要的.

外泌體是由多種細(xì)胞釋放的內(nèi)體多囊泡體形成的雙層納米級膜泡,與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和化療耐藥有關(guān).外泌體可以攜帶各種生物成分,包括:蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和遺傳物質(zhì)等,可經(jīng)鄰近細(xì)胞攝取需傳遞的“信息”,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞之間的物質(zhì)交換,并誘導(dǎo)其表型變化.越來越多的證據(jù)表明,外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通訊是一種新發(fā)現(xiàn)的耐藥機(jī)制.通過直接輸出藥物,誘導(dǎo)藥物失活,并傳遞功能蛋白和ncRNAs,對PDAC耐藥起著重要作用.

非編碼RNA(ncRNAs)是一種不能被編碼成蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物.根據(jù)長度、形狀和功能,ncRNAs可細(xì)分為以下幾種類型:tiny/short ncRNAs,大于200個(gè)核苷酸的long ncRNA (lncRNAs)和環(huán)狀RNA(circRNAs),小的ncRNA,如microRNAs(miRNAs)、小核仁RNA(snoRNAs)和小核RNAs(snRNAs).NcRNAs已被證明是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)控因子,而不僅僅只是基因轉(zhuǎn)錄過程中的“副產(chǎn)品”.大量研究表明,NcRNAs參與許多生物學(xué)功能,如細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞凋亡等,并且在胰腺不同的發(fā)育階段和腫瘤等病理?xiàng)l件下表達(dá)存在差異,與胰腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、放化療耐藥有關(guān).NcRNAs也可以作為分子信號,利用外泌體在不同的細(xì)胞和組織之間傳遞.在這些異常表達(dá)的ncRNAs中,各種miRNAs和lncRNAs已被發(fā)現(xiàn)在PDAC化療耐藥中發(fā)揮重要作用.

本文主要綜述了外泌體的生物學(xué),外泌體ncRNAs調(diào)控胰腺癌耐藥的機(jī)制,從而為外泌體ncRNAs作為未來可能的胰腺癌生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的作用提供了新的思路.

1 外泌體:起源、生物學(xué)功能

外泌體是在1981年由Trams等人在綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞體外培養(yǎng)液中分離得到被雙層膜包圍的小囊泡.1987年,Johnstone將這些細(xì)胞外小泡命名為Exosomes.外泌體主要在胞外刺激、微生物攻擊或者其他應(yīng)激條件等的誘導(dǎo)下生成.外泌體是由晚期的核內(nèi)體發(fā)育而來的,核內(nèi)體是由質(zhì)膜內(nèi)陷產(chǎn)生的.與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合后,在高爾基體中加工,產(chǎn)生多泡小體(multivesicular bodies,MVB).然后,成熟的MVB與質(zhì)膜結(jié)合,以外體的形式將其內(nèi)容釋放到細(xì)胞外空間.由于外泌體的結(jié)構(gòu)很小,通常采用超速離心法進(jìn)行分離,從血液或細(xì)胞培養(yǎng)液中提取外泌體.簡而言之,血漿或血清被稀釋(1:1),在2000轉(zhuǎn)的4 ℃下離心30 min,收集的沉淀物用PBS洗滌,在11萬轉(zhuǎn)的4 ℃下離心70 min,得到的沉淀物含有外泌體.雖然有不同的方法來分離外泌體,包括免疫分離、沉淀和密度梯度離心法,但到目前為止,還沒有分離外泌體的金標(biāo)準(zhǔn).因此,分離方法應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)的要求和問題而定.

外泌體(Exosome)由多種細(xì)胞類型釋放,包括腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞,并發(fā)現(xiàn)在各種體液中富集,包括血液、唾液、母乳、尿液和腦脊液.最初外泌體被認(rèn)為是清除細(xì)胞中降解的或不需要的細(xì)胞成分的“垃圾桶”,隨著對外泌體研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)這些囊泡是有功能的,外泌體可以介導(dǎo)大量生理或病理?xiàng)l件下的細(xì)胞間通訊,將DNA、RNA(編碼和非編碼)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等活性成分從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,也可以通過配體-受體相互作用激活受體細(xì)胞的下游信號通路,同時(shí)外泌體的雙層膜可以保護(hù)這些成分免受蛋白酶、核酸酶和其他環(huán)境影響,從而參與抗原提呈、細(xì)胞分化、生長、腫瘤的免疫反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲.越來越多的研究發(fā)現(xiàn),與健康人相比,腫瘤患者血液循環(huán)中的外泌體數(shù)量增加了,這表明癌癥與外泌體分泌增加有關(guān).據(jù)報(bào)道,癌癥中的外泌體被關(guān)鍵地釋放到癌癥微環(huán)境和循環(huán)系統(tǒng)中,這些證據(jù)表明包括ncRNAs在內(nèi)的外泌體成分被認(rèn)為是一種很有前途的篩查工具,它們可以用來增強(qiáng)早期胰腺癌檢測的響應(yīng)性和可靠性.同時(shí),腫瘤來源的外泌體可能與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、腫瘤微環(huán)境和化療耐藥有關(guān).然而,外泌體在腫瘤中的確切作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究.

2 外泌體中的非編碼RNA

非編碼RNA約占人類基因組的98%,是一類不能編碼蛋白質(zhì)的RNA,可以與DNA、RNA或蛋白質(zhì)相互作用,在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá),并調(diào)節(jié)細(xì)胞過程.廣泛的研究表明,NcRNAs可調(diào)節(jié)各種分子過程和人類疾病.越來越多的研究表明:外泌體中富含ncRNAs,包括microRNA(MiRNAs)、長非編碼RNA(LncRNAs)、環(huán)狀RNA(CircRNAs)等,外泌體作為細(xì)胞溝通的媒介,可以將ncRNAs選擇性地包裝、分泌和在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移,影響腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、免疫調(diào)節(jié)和耐藥性等腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵過程.隨著對外泌體中的ncRNAs的發(fā)現(xiàn)和進(jìn)一步研究,出現(xiàn)了許多新的功能和應(yīng)用,從細(xì)胞間通訊工具到有前途的疾病生物標(biāo)志物,可能還存在新的治療應(yīng)用.本文主要對外泌體miRNAs、lncRNAs和CircRNAs在胰腺癌的化療耐藥中的潛在機(jī)制進(jìn)行綜述.

2.1 MicroRNA(微小RNA) MiRNAs是由外泌體傳遞的重要貨物,通常由大約21-25個(gè)核苷酸組成的小ncRNA,通過與靶mRNA的3‘非翻譯區(qū)(UTR)互補(bǔ)結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而降低或抑制靶基因的穩(wěn)定性.大多數(shù)成熟的miRNA序列位于非編碼RNA的內(nèi)含子或外顯子以及Pre-mRNA的內(nèi)含子中.MiRNA的生物發(fā)生始于將miRNA基因轉(zhuǎn)錄成大的初級轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA),其中含有一個(gè)或幾個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu),每個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)由大約70個(gè)核苷酸組成.然后被包括RNase-Ⅲ型酶Drosha和RNA結(jié)合蛋白Dgcr8的微處理器復(fù)合體切割成一個(gè)約85個(gè)核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu),稱為前體miRNA(pre-miRNA).通過Exportin 5和Ran-GTP復(fù)合物將pre-miRNA輸出到細(xì)胞質(zhì)后,它們在環(huán)附近被Disher切割成小的雙鏈RNA(DsRNAs).這些miRNA雙鏈?zhǔn)遣环€(wěn)定的,很快就會被切割成單鏈成熟的miRNA.成熟的miRNA被裝載到Argonaute蛋白(AGO)上,形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC),然后與靶mRNA結(jié)合,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后基因沉默.大量研究表明,在許多癌癥中,包括胰腺癌,miRNA表達(dá)異常在癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用.此外,miRNAs被選擇性地包裹在參與腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞間通訊的外泌體,并在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要作用.

2.2 長鏈非編碼RNA 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNAs)是另一類長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本,沒有或具有有限的蛋白質(zhì)編碼能力.與mRNAs一樣,它們也是由RNA聚合酶II(RNA Pol II)從獨(dú)立啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而來.LncRNAs既存在于細(xì)胞核中,也存在于細(xì)胞質(zhì)中,并根據(jù)其亞細(xì)胞定位而發(fā)揮不同的功能.在細(xì)胞核內(nèi),LncRNAs可能參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和mRNA的剪接.而在細(xì)胞質(zhì)中,它們可以影響mRNA的穩(wěn)定性并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能.越來越多的研究表明,包括胰腺癌在內(nèi)的許多癌癥中都觀察到了LncRNAs表達(dá)的失調(diào),并通過其作為腫瘤抑制因子或癌基因的雙重作用與癌癥的分期和分級密切相關(guān).有趣的是,LncRNA也可以選擇性地包裹在外泌體內(nèi),從而保護(hù)LncRNA免受降解,并有助于腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞間通訊.外泌體LncRNA可參與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展,如增殖、侵襲、血管生成和耐藥,可能成為有吸引力的治療靶點(diǎn).

2.3 環(huán)狀RNA 環(huán)狀RNA(circular RNA,CircRNA)是一種新的非編碼RNA分子亞型,它在5‘端和聚(A)尾部之間的3’端形成具有共價(jià)鍵的環(huán)狀結(jié)構(gòu).主要是由外顯子的pre-mRNA通過反向剪接產(chǎn)生的.CircRNA是一種長度超過200個(gè)核苷酸的長轉(zhuǎn)錄本,它們高度穩(wěn)定,進(jìn)化保守,在特定組織中廣泛分布.CircRNA最初被認(rèn)為是RNA拼接的副產(chǎn)品.隨著高通量RNA測序(RNA-seq)和CircRNA特異的生物信息學(xué)的廣泛應(yīng)用,已經(jīng)在人類和其他真核生物中鑒定出了數(shù)以千計(jì)的CircRNA,并在最近幾年逐漸揭示了CircRNA的特征和行為.雖然CircRNA不編碼已知的蛋白質(zhì),但它們廣泛參與人類生物過程的調(diào)節(jié).許多研究證實(shí),CircRNA在包括胰腺癌在內(nèi)的腫瘤中高度表達(dá),在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用.目前對于外泌體circRNA的研究仍處于初級階段,但少數(shù)研究表明,CircRNA富含在外泌體中,CircRNA通過外泌體開始循環(huán)并到達(dá)受體細(xì)胞,從而實(shí)現(xiàn)其各種生物學(xué)功能.與線性RNA不同,具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的CircRNA不易被核酸外切酶消化,更穩(wěn)定,半衰期更長,因此它們可以被認(rèn)為是大量癌癥診斷和預(yù)后的有前途的生物標(biāo)志物.

3 外泌體ncRNAs與胰腺癌耐藥

越來越多的證據(jù)表明,外泌體ncRNAs在促進(jìn)胰腺癌化療耐藥中發(fā)揮了重要的作用,找出其中涉及的機(jī)制有助于抑制危及生命的胰腺癌.GEM是胰腺癌化療中使用最廣泛的藥物,GEM是一種DNA核苷類似物,它不可逆轉(zhuǎn)地抑制核苷酸還原酶的活性,阻止DNA復(fù)制和修復(fù)所需的雙氧核糖核苷酸的合成,可以導(dǎo)致DNA損傷,最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡.盡管如此,大量臨床試驗(yàn)表明GEM對胰腺癌患者的療效較低.腫瘤細(xì)胞在首次接觸GEM后表現(xiàn)出抗藥性.因此,了解GEM耐藥的潛在分子機(jī)制對于克服GEM耐藥和開發(fā)胰腺癌新的治療策略具有重要意義.

外泌體MiRNAs在諸如PDAC等不同惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用.幾乎所有提到的miRNA都能夠在耐藥細(xì)胞及反應(yīng)性細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移,以攜帶耐藥特性,反之亦然.例如:癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts,CAFs)是PDAC腫瘤的主要組成部分,對GEM具有本質(zhì)耐藥性,而GEM是PDAC的化療治療標(biāo)準(zhǔn).然而,GEM治療的胰腺癌(pancreatic cancer,PC)細(xì)胞將外泌體傳遞的miR-155轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,通過下調(diào)GEM代謝基因(DCK)導(dǎo)致胰腺癌細(xì)胞耐藥.同時(shí),也有研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中miR-155表達(dá)的增加具有抗凋亡作用,并導(dǎo)致細(xì)胞釋放外泌體.外泌體隨后將與化療耐藥相關(guān)的物質(zhì),包括miR-155,傳遞給其他癌細(xì)胞,受體細(xì)胞隨后產(chǎn)生化療耐藥并顯示出外泌體合成的增加.此外,有研究發(fā)現(xiàn),miR-365可以通過上調(diào)癌細(xì)胞中三磷酸核苷酸庫和誘導(dǎo)胞苷脫氨酶抑制GEM的激活,后者使GEM失活,巨噬細(xì)胞來源的外泌體可以通過轉(zhuǎn)移miR-365誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對GEM的耐藥性.更有研究發(fā)現(xiàn),來自GEM耐藥胰腺癌干細(xì)胞的外泌體通過傳遞miR-210介導(dǎo)耐藥性狀向GEM敏感胰腺癌細(xì)胞的水平轉(zhuǎn)移,并抑制GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯,拮抗GEM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的管形成和細(xì)胞遷移.此外,研究發(fā)現(xiàn),miR-106b通過癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)來源的外泌體傳播,并通過直接靶向TP53INP1促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞對GEM的耐藥性.因此,CAFs來源的外泌體miR-106b在導(dǎo)致胰腺癌GEM耐藥性中發(fā)揮了重要作用,從而為胰腺癌細(xì)胞對GEM敏感提供了一個(gè)新的靶點(diǎn).綜上所述,外泌體MiRNAs是一種潛在的非侵入性生物標(biāo)志物和新的抗癌治療靶點(diǎn).外泌體MiRNAs作為抗化療耐藥性靶點(diǎn)的價(jià)值值得進(jìn)一步研究.

同時(shí),大量研究表明外泌體LncRNA在胰腺癌發(fā)展過程及化療耐藥起著關(guān)鍵作用.例如:外泌體可以介導(dǎo)LncRNA SNHG11通過海綿覆蓋miR-324-3p調(diào)控VEGFA的表達(dá),促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和血管生成.也有研究表明,外泌體LncRNA Sox2ot,作為一種競爭性內(nèi)源性RNA(ceRNA),可以競爭性地結(jié)合miR-200家族上調(diào)Sox2,從而誘導(dǎo)EMT和干細(xì)胞樣特征,促進(jìn)PDAC的侵襲和轉(zhuǎn)移.此外,有研究表明,在缺氧條件下,缺氧誘導(dǎo)的胰腺星形細(xì)胞(pancreatic stellate cells,PSCs)分泌的外泌體將lncRNA UCA1傳遞到胰腺癌細(xì)胞中,lncRNA UCA1通過招募EZH2調(diào)控SOCS3蛋白的甲基化,降低SOCS3的表達(dá),促進(jìn)胰腺癌的GEM耐藥性.因此,外泌體介導(dǎo)的LncRNA可以在胰腺癌發(fā)生發(fā)展及化療耐藥中發(fā)揮重要作用.

并且,有研究發(fā)現(xiàn),外泌體cirRNA在胰腺癌發(fā)展過程中及化療耐藥中起著重要作用.例如:研究發(fā)現(xiàn)circ-PDE8A可以通過miR-338/MACC1/MET/AKT 或 ERK通路促進(jìn)胰腺癌侵襲能力,并且circ-PDE8A可以通過腫瘤分泌的外泌體釋放到血液循環(huán)中.因此,外泌體circ-PDE8A可能是PDAC診斷或進(jìn)展的有用標(biāo)志物.同時(shí),也有研究發(fā)現(xiàn),來自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs)的外泌體circ-0030167通過海綿吸收miR-338-5p和靶向Wif1/Wnt8/β-catenin軸,從而抑制胰腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移、增殖和干細(xì)胞性.同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)外泌體circZNF91可以作為一種載體,介導(dǎo)低氧和常氧腫瘤細(xì)胞之間的信號傳輸,可以競爭性地結(jié)合miR-23b-3p并上調(diào)去乙?；窼irtuin1(SIRT1)導(dǎo)致受體胰腺癌細(xì)胞的糖酵解和對GEM化療耐藥性,并可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn).

4 結(jié)論

綜上所述,外泌體ncRNAs在胰腺癌化療耐藥中的作用已逐漸被揭示.外泌體作為天然載體,轉(zhuǎn)移參與耐藥的ncRNAs和蛋白質(zhì).靶向外泌體ncRNAs,結(jié)合傳統(tǒng)化療或靶向治療,可能是治療晚期胰腺癌耐藥性的一個(gè)有希望的選擇.本文綜述了外泌體ncRNAs影響胰腺癌化療耐藥的多種機(jī)制,包括:通過調(diào)節(jié)不同的信號通路、影響EMT、細(xì)胞凋亡、自噬、細(xì)胞周期失調(diào)、靶向ABC藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體以及相互調(diào)節(jié)來發(fā)揮作用.例如,一些環(huán)狀RNA可以充當(dāng)miRNA海綿.外泌體ncRNAs能夠在不同細(xì)胞之間傳遞,使它們對化療藥物敏感或耐藥.本文還討論了外泌體ncRNAs作為生物標(biāo)志物的潛在治療價(jià)值.然而外泌體ncRNAs在化療耐藥中的潛在作用目前尚不清楚.迄今為止,將有希望的細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果轉(zhuǎn)化為臨床試驗(yàn)仍然是最困難的挑戰(zhàn).因此,了解外泌體ncRNAs調(diào)節(jié)胰腺癌耐藥的各種機(jī)制將有助于改善胰腺癌治療.因此,在這個(gè)領(lǐng)域進(jìn)行全面的臨床研究是有必要的.