金葉復(fù)葉槭水培嫩枝組織培養(yǎng)體系研究

張煥玲

(西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

金葉復(fù)葉槭(Acernegundo‘Aurea’)屬槭樹科槭樹屬落葉喬木，是復(fù)葉槭的一個栽培變種。金葉復(fù)葉槭小枝光滑，奇數(shù)羽狀復(fù)葉對生，春季色澤金黃，觀賞性極高[1-2]。其生長快，耐干旱、極耐寒冷、耐輕度鹽堿，我國于20世紀(jì)初從歐洲引進(jìn)，目前在華北、東北、西北及華東地區(qū)均有栽培[3]。因其扦插生根困難，生產(chǎn)中主要采用嫁接繁殖[1]，但在嫁接繁殖中不親和現(xiàn)象較為普遍，后期樹勢衰退嚴(yán)重。利用組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以快速建立其快繁體系，還能促進(jìn)品種改良和分子育種研究的開展。

1 材料與方法

1.1 材料

以金葉復(fù)葉槭3年生休眠枝溫室水培嫩枝為外植體。休眠枝采自楊凌大石景觀苗木基地從遼寧引進(jìn)的金葉復(fù)葉槭5年生大苗，于1月中旬采集后水培，水培時枝條上端套1塑料袋，每3 d換水1次，同時修剪枝條下切口。

1.2 方法

1.2.1 初代培養(yǎng)及基本培養(yǎng)基篩選

待休眠枝萌發(fā)嫩枝長至15 cm左右長時，將其剪成帶1個腋芽的莖段，按照體積分?jǐn)?shù)75%酒精浸潤 50 s、無菌水沖洗3次、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯化汞消毒8 min、無菌水沖洗5次的程序消毒，消毒后修剪莖段兩端約2 mm后接種在不含任何附加物的不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 d，觀察統(tǒng)計接種外植體的腋芽萌發(fā)率及長度，以篩選適合的基本培養(yǎng)基。選用3種基本培養(yǎng)基，即富集元素平衡培養(yǎng)基MS、高硝酸鉀含量培養(yǎng)基B5和低鹽培養(yǎng)基WPM。

1.2.2 莖段增殖培養(yǎng)

將初代培養(yǎng)中獲得的無菌莖段接種在含不同濃度生長素和分裂素的基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選適合的增殖培養(yǎng)基。

生長素和分裂素篩選采用逐步篩選的單因素試驗設(shè)計，先將修剪好的帶1個腋芽的無菌莖段接種在附加0.5 mg/L 6-BA、不同質(zhì)量濃度NAA(0.02、0.04、0.06、0.08 mg/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以篩選有利于莖段增殖的NAA濃度。再將材料接種在含上述篩選出的NAA、不同質(zhì)量濃度6-BA(0.3、0.5、0.7、0.9 mg/L) 的培養(yǎng)基中，以篩選有利于莖段增殖的6-BA濃度。最后將材料接種在含上述篩選出的NAA、6-BA、不同質(zhì)量濃度的TDZ(0.00、0.01、0.05、0.10 mg/L)的培養(yǎng)基中，篩選有利于莖段增殖的TDZ濃度。培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計每個外植體的增殖芽數(shù)、長度，觀察記錄芽的長勢。

1.2.3 生根培養(yǎng)

將增殖培養(yǎng)中獲得的2～3 cm的段分別接種于含不同質(zhì)量濃度IBA及不同質(zhì)量濃度NAA(0.00、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/L)的1/2 MS基本培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計初生根時間、50 d時的生根率及生根苗生長情況，以篩選生根培養(yǎng)基。

1.2.4 煉苗移栽

當(dāng)生根苗根長至3～6 cm時，將瓶蓋半開，在培養(yǎng)室煉苗3 d后進(jìn)行移栽。移栽時先用鑷子輕輕夾出幼苗，在水中輕柔沖洗根部培養(yǎng)基，移栽至裝有商品化育苗細(xì)基質(zhì)的培養(yǎng)容器中，置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)至恢復(fù)生長，培養(yǎng)箱相對濕度設(shè)置為85%，以30%(接近室內(nèi)濕度)為對照。

1.2.5 培養(yǎng)條件與重復(fù)數(shù)

所有實驗培養(yǎng)條件為于(25±2) ℃、16 h/d光照、2 000 lx光照度條件。每個實驗處理接種25瓶，重復(fù)3次。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

對實驗結(jié)果中增殖芽數(shù)、平均根數(shù)數(shù)據(jù)經(jīng)平方根轉(zhuǎn)換，百分率經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后，用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基篩選結(jié)果

基本培養(yǎng)基是建立一個新植物組培體系時首要研究的問題。用于復(fù)葉槭組培的基本培養(yǎng)基報道不一致，故選取3種代表不同類型的培養(yǎng)基進(jìn)行實驗。結(jié)果表明，金葉復(fù)葉槭水培嫩枝在不添加任何附加物的MS、B5、WPM 3種培養(yǎng)基中均能成功誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)。外植體接種3周后，腋芽開始萌動，露出綠點，5周后開始伸長。但在MS和WPM培養(yǎng)基中的萌發(fā)率要顯著高于B5培養(yǎng)基(P<0.05)10余個百分點(表1)。MS和WPM培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于無機(jī)鹽濃度差異，B5與MS、WPM培養(yǎng)基的主要區(qū)別在于其含有高濃度的硝態(tài)氮，這說明金葉復(fù)葉槭莖段腋芽誘導(dǎo)的關(guān)鍵影響因素可能是N元素的供應(yīng)形態(tài)，而非無機(jī)鹽的濃度。

表1 不同培養(yǎng)基中的初代培養(yǎng)比較

盡管MS和WPM在腋芽誘導(dǎo)方面差異不顯著，但對萌發(fā)新芽的伸長生長影響較大。在MS培養(yǎng)基中新芽生長快，30 d后平均長度超過2 cm(表1、圖1A)。

A.MS培養(yǎng)基中的初代培養(yǎng)primary culture in MS medium；B.最佳增殖培養(yǎng)基中的增殖培養(yǎng)proliferative culture in optimum medium;C.0.05 mg/L IBA誘導(dǎo)生根root inducing with 0.05 mg/L IBA;D.再生組培苗regeneration plant。圖1 金葉復(fù)葉槭不同組培階段生長情況Fig.1 The growth situation in different cultural stages of A. negundo ‘Aurea’

而在WPM和B5培養(yǎng)基中新芽生長緩慢，平均長度在1.5 cm以下(表1)，這說明金葉復(fù)葉槭離體材料的伸長生長需要含較高濃度無機(jī)鹽的培養(yǎng)基。

綜上，從腋芽萌發(fā)率和新芽伸長生長綜合考慮，最終選擇MS作為金葉復(fù)葉槭組培的最佳基本培養(yǎng)基。

2.2 生長調(diào)節(jié)劑濃度對金葉復(fù)葉槭增殖培養(yǎng)的影響

2.2.1 NAA

以MS為基本培養(yǎng)基，固定細(xì)胞分裂素6-BA濃度(0.5 mg/L)，添加不同質(zhì)量濃度的生長素NAA，研究了NAA對金葉復(fù)葉槭增殖培養(yǎng)的影響(表2)。

表2 NAA濃度對金葉復(fù)葉槭增殖培養(yǎng)的影響

從表2可看出，NAA質(zhì)量濃度在0.02～0.08 mg/L范圍內(nèi)，隨著NAA濃度的增加，金葉復(fù)葉槭每個外植體增殖芽數(shù)和芽平均長度均呈現(xiàn)升高趨勢。0.02和0.04 mg/L，以及0.06和0.08 mg/L NAA中增殖芽數(shù)間無顯著差異(P>0.05)，但0.06和0.08 mg/L NAA中的增殖芽數(shù)顯著高于0.02和0.04 mg/L(P<0.05)。盡管0.06和0.08 mg/L NAA在增殖芽長度方面差異不顯著(P>0.05)，但二者均顯著高于0.02和0.04 mg/L NAA中的芽長(P<0.05)，芽長比前者增加了5～6倍，比后者增加了2倍左右。這些結(jié)果表明，在金葉復(fù)葉槭增殖培養(yǎng)中，與0.5 mg/L 6-BA搭配使用的NAA濃度至少要達(dá)到0.05 mg/L以上，二者濃度比在10∶1左右為宜。

另外，從增殖芽長勢情況來看，在低濃度和高濃度NAA中增殖的芽生長都不正常，0.02和0.04 mg/L NAA中增殖的芽表現(xiàn)出“細(xì)弱”的典型特征，0.08 mg/L NAA中的則表現(xiàn)出“細(xì)長”的特征，說明NAA濃度過高或過低都會削弱增殖芽的長勢。

2.2.2 6-BA

以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.06 mg/L NAA，添加不同濃度的6-BA，研究了6-BA對金葉復(fù)葉槭增殖培養(yǎng)的影響。

細(xì)胞分裂素是植物組織培養(yǎng)增殖培養(yǎng)階段必須添加的植物生長調(diào)節(jié)劑，實驗結(jié)果(表3)表明，在0.3～0.9 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，外植體增殖芽數(shù)和芽長度均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。增殖芽數(shù)最高的是含0.7 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基，芽長度最長的是含0.5 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達(dá)0.9 mg/L時，增殖芽數(shù)有所下降。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度超過0.7 mg/L時，外植體基部開始出現(xiàn)愈傷組織，影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，芽長度開始下降。盡管0.5和0.7 mg/L 6-BA中增殖芽數(shù)無顯著差異(P>0.05)，但0.5 mg/L中的芽長度顯著高于0.7 mg/L(P<0.05)，故選擇0.5 mg/L 6-BA為增殖培養(yǎng)的最佳濃度。

表3 6-BA濃度對金葉復(fù)葉槭增殖培養(yǎng)的影響

2.2.3 TDZ

TDZ是人工合成的具有細(xì)胞分裂素活性的苯基脲衍生物，是被廣泛用于植物組織培養(yǎng)形態(tài)發(fā)生的高效生物調(diào)節(jié)劑，具有生長素和細(xì)胞分裂素雙重作用。為進(jìn)一步提高金葉復(fù)葉槭增殖系數(shù)，在篩選6-BA(0.5 mg/L)和NAA(0.06 mg/L)的基礎(chǔ)上,通過添加不同質(zhì)量濃度的TDZ探究其是否有利于莖段增殖。

表4 TDZ濃度對金葉復(fù)葉槭增殖培養(yǎng)的影響

結(jié)果(表4)表明，添加TDZ能顯著提高金葉復(fù)葉槭的增殖系數(shù)(P<0.05)，隨著TDZ濃度的增加，增殖芽數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢。不添加TDZ時的增殖芽數(shù)平均只有4.1個，添加TDZ后最高可達(dá)6.6個，當(dāng)TDZ質(zhì)量濃度超過0.05 mg/L時，增殖芽數(shù)不再增加。低濃度的TDZ(0.01 mg/L)對芽伸長生長影響不顯著(P>0.05)，但高濃度的TDZ(>0.05 mg/L)會抑制芽的生長，芽長度顯著降低(P<0.05)。0.05 mg/L TDZ中增殖的芽平均長度比0.01 mg/L中短1 cm，且芽纖細(xì)，當(dāng)TDZ質(zhì)量濃度達(dá)0.10 mg/L時，增殖芽開始出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。

綜上，金葉復(fù)葉槭莖段增殖培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ+0.06 mg/L NAA，該培養(yǎng)基中每個外植體可增殖5.8個新芽，芽長勢良好(圖1B)。

2.3 NAA、IBA濃度對金葉復(fù)葉槭生根的影響

NAA和IBA是植物組織培養(yǎng)中生根培養(yǎng)常用的兩種生長素，實驗在1/2 MS培養(yǎng)基中通過分別添加不同濃度的NAA和IBA，研究了2種生長素對金葉復(fù)葉槭組培苗生根的影響。

由表5分析可得，培養(yǎng)基中添加IBA或NAA均可促進(jìn)組培苗生根，無論是生根時間、生根數(shù)量，還是生根率，都比不添加任何生長素要好，但I(xiàn)BA生根效果要明顯好于NAA。不添加任何生長素時最早生根需要25 d，生根率只有23.1%，平均根數(shù)2.8條，添加IBA后生根時間最多可提前12 d，生根率達(dá)100%，平均根數(shù)最多達(dá)9.1條(圖1C)；添加NAA后對生根天數(shù)影響不大，但生根率可最高至78.3%，平均根數(shù)也顯著增加，最多5.7條。研究發(fā)現(xiàn)，隨著生長素濃度的增加，愈傷組織生根增多，當(dāng)IBA質(zhì)量濃度為0.07 mg/L、NAA質(zhì)量濃度為0.09 mg/L時，新生根與莖基部有愈傷組織出現(xiàn)，愈傷組織生根會影響后期的移栽成活率，不利移栽。故最終選取1/2 MS+0.05 mg/L IBA為金葉復(fù)葉槭組培生根培養(yǎng)基,在該培養(yǎng)基中生長的組培苗長勢良好(圖1D)。

表5 不同NAA與IBA濃度生根效果比較

2.4 試管苗的煉苗移栽

金葉復(fù)葉槭試管苗葉片較大，蒸騰失水快，煉苗3 d的試管苗移栽至培養(yǎng)基質(zhì)中，如不能保證足夠的空氣濕度，30 min 內(nèi)就可出現(xiàn)葉片失水萎蔫現(xiàn)象(圖2A)，1 d內(nèi)葉片即可干枯，移栽成活率不到10%。相反，置于85%相對濕度下的移栽苗葉片失水較輕，輕度萎蔫3 d內(nèi)即可恢復(fù)正常(圖2B)，10 d即可恢復(fù)生長，移栽成活率高達(dá)95%。因此，保溫是金葉復(fù)葉槭組培苗移栽成活的關(guān)鍵。

A.30%相對濕度30% relative humidity；B.85%相對濕度85% relative humidity;C.IBA誘導(dǎo)的組培苗根系roots of tissue culture plantlets induced by IBA。圖2 金葉復(fù)葉槭組培苗煉苗移栽Fig.2 Acclimatization and transplants of A. negundo ‘Aurea’ tissue culture plantlets

移栽使用的基質(zhì)是普通的商品化育苗細(xì)基質(zhì)，在相對濕度85%的條件下并未發(fā)現(xiàn)移栽苗生長不良現(xiàn)象，說明金葉復(fù)葉槭組培苗移栽可能對基質(zhì)要求不嚴(yán)，也可能是因為IBA誘導(dǎo)的試管苗根系與莖段連接處愈傷組織少，主、側(cè)根均較粗壯(圖2C)，易于移栽成活。

3 討 論

1) 本研究以3年生休眠枝水培嫩枝為試材，建立了遼寧種源的金葉復(fù)葉槭組織培養(yǎng)體系，系統(tǒng)篩選了基本培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基，移栽成活率高達(dá)95%，為該觀賞樹種良種快繁提供了新途徑。研究結(jié)果顯示，營養(yǎng)元素富集的MS培養(yǎng)基適合作為金葉復(fù)葉槭莖段培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，其誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)性能要比B5和WPM培養(yǎng)基好。細(xì)胞分裂素與生長素的聯(lián)合使用對增殖培養(yǎng)有利，低濃度的TDZ有助于提高不定芽增殖系數(shù)，0.5 mg/L 6-BA結(jié)合0.01 mg/L TDZ和0.06 mg/L NAA，可使每個外植體平均增殖5.8個新芽。生長素IBA和NAA均可有效促進(jìn)組培苗生根，但I(xiàn)BA效果明顯優(yōu)于NAA，在1/2 MS附加0.05 mg/L IBA的生根培養(yǎng)基中生根率可達(dá)100%，較不添加生長素提升近75%。影響金葉復(fù)葉槭組培苗移栽的主要因素是空氣相對濕度，85%的相對濕度可保證95%的移栽成活率。

2) 本研究所用外植體為室內(nèi)水培休眠枝萌發(fā)的新枝，與生長季大田采集的外植體相比，有污染率小、消毒時間短、消毒劑對外植體傷害小的優(yōu)點，這對初代培養(yǎng)十分有利。金葉復(fù)葉槭休眠枝休眠狀態(tài)較難打破，水培枝條萌發(fā)需要較高溫度和較長時間，但長時間下高溫水培對枝條營養(yǎng)消耗和蒸騰失水影響很大，因此需要選擇健壯的枝條并在相對濕潤的環(huán)境下進(jìn)行水培。

基本培養(yǎng)基是建立一個新植物組培體系時首要研究的問題，選擇不當(dāng)，會直接影響組培效果。目前植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域常用的基本培養(yǎng)基達(dá)14種之多，根據(jù)成分可將其聚為4大類[14]，本研究選取了3大類當(dāng)中的3種典型培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基的效果優(yōu)于WPM和B5培養(yǎng)基，這與王艷輝等[2]的研究結(jié)果類似，但與李艷敏等[3]的研究結(jié)果不一致。李艷菊等[4]和馬秋月等[5]在元寶楓組培中也發(fā)現(xiàn)同種培養(yǎng)基有不同的培養(yǎng)效果，這可能與基因型、外植體類型及狀態(tài)有關(guān)，因為同一樹種的不同基因型、不同外植體及同一外植體的不同狀態(tài)都會要求不同的組培系統(tǒng)[15]。此外，是否可進(jìn)一步通過微調(diào)MS培養(yǎng)基中各種成分的量，找到一種更優(yōu)的改良MS培養(yǎng)基，或者其他10余種培養(yǎng)基是否比MS更好，值得進(jìn)一步研究。

細(xì)胞分裂素和生長素聯(lián)合使用是增殖培養(yǎng)的有效方法，從前人經(jīng)驗和經(jīng)濟(jì)角度考慮，多數(shù)研究都采用6-BA與NAA或IBA聯(lián)合使用，均能起到一定的增殖效果，但增殖系數(shù)普遍不高[2,8,10,12]。研究發(fā)現(xiàn)很少量的TDZ即可產(chǎn)生明顯的增殖效果[4，16]，本研究也證實0.01 mg/L的TDZ就可使每個外植體多增殖近2個新芽，但用量控制不當(dāng)容易引起愈傷組織生根及玻璃化苗的產(chǎn)生。因此，尋找新的使用方便且高效的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)十分有必要。

金葉復(fù)葉槭試管苗生根相對容易，單獨使用IBA即可100%生根，關(guān)鍵是如何調(diào)整濃度控制愈傷組織生根現(xiàn)象的發(fā)生。此外，本研究只對組培苗以半開瓶蓋的方式進(jìn)行了3 d的短時間培養(yǎng)室煉苗，保濕是按此方式煉苗后移栽成活的關(guān)鍵，是否可以通過全開蓋、長時間、室溫?zé)捗鐏硖岣呓M培苗對干旱的耐性應(yīng)該是今后研究的重點。