孕晚期無乳鏈球菌感染的血清型耐藥性及分子遺傳背景特征*

楊景, 田輝, 蘇慧琳, 許一諾

湖南省婦幼保健院婦產(chǎn)科(湖南長沙 410028)

無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae，GBS)又稱為B族鏈球菌，屬于革蘭陽性鏈球菌，該菌最早于患有乳腺炎的牛中所分離，隨后在孕產(chǎn)婦、新生兒中分離得到，該菌可導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)腦膜炎、敗血癥，且具有較高的致死率[1]。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)報道[2]，孕婦GBS定植發(fā)生率因地區(qū)的不同而存在差異，全球范圍內(nèi)GBS定植發(fā)生率約為11%～35%。GBS最早于1938年被國外學(xué)者最先報道，該學(xué)者的研究中指出[3]，3例GBS感染孕產(chǎn)婦在分娩后發(fā)生心內(nèi)膜炎，進(jìn)而導(dǎo)致死亡，也從側(cè)面證實(shí)了GBS是人類致病菌。在健康人群中，GBS攜帶率約為15%～35%，而孕產(chǎn)婦GBS攜帶率則高達(dá)40%～50%，GBS感染也是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦生殖道感染、胎膜早破、胎兒窘迫以及新生兒窒息等不良妊娠結(jié)局的主要致病菌之一。國外文獻(xiàn)指出[4]，美國疾病預(yù)防中心指南中提倡35～37周孕產(chǎn)婦應(yīng)進(jìn)行GBS陽性篩查，對于GBS陽性孕產(chǎn)婦及時的采取抗菌藥物進(jìn)行預(yù)防性治療，以降低母嬰傳播發(fā)生率，改善不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險。隨著臨床上抗菌藥物的大量使用，耐藥菌不斷增多，多種細(xì)菌耐藥譜發(fā)生了改變，GBS對不同類型的抗生素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。既往有學(xué)者的研究指出[5]，GBS感染致病能力與其毒力因子有關(guān)，GBS的高毒力因子是GBS表面蛋白，但是其中的具體分子作用機(jī)制目前尚不明確。GBS陽性血清型耐藥性及分子遺傳背景特征對于臨床上防治GBS感染、研發(fā)GBS疫苗具有重要意義。既往的研究中[6]，不同國家以及不同地區(qū)的GBS血清型存在不同的差異，拉丁美洲以Ⅲ型多見，美國、歐洲以Ⅰa、Ⅱ、Ⅲ以及Ⅴ型多見，韓國以Ⅲ、Ⅰa型多見，日本以Ⅵ、Ⅷ型多見，而東南亞地區(qū)則以Ⅱ型多見。為全面了解并分析孕產(chǎn)婦樣本分離的 GBS 菌株抗菌藥物敏感性、毒力基因和耐藥基因的分布情況，本次研究中，探討并分析孕晚期GBS感染的血清型耐藥性及分子遺傳背景特征，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性選取我院2018年1月至2021年1月收治的孕晚期(35～37周)孕婦為研究對象，采集陰道分泌物，采用熒光定量PCR法和顯色培養(yǎng)加鑒定法篩查GBS，GBS陽性患者設(shè)為觀察組(n=50)，GBS陰性患者設(shè)為對照組(n=50)。其中，觀察組年齡20～38歲，孕周35～37周，體質(zhì)指數(shù)(BMI)18.4～25.6 kg/m2；觀察組年齡20～39歲，孕周35～37周，BMI 18.2～25.5 kg/m2。兩組患者的年齡、孕周、BMI等一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，詳見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

所有患者均知曉該研究方案且簽署同意書，該方案通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)(快 202024號)。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：觀察組采用熒光定量PCR法和顯色培養(yǎng)加鑒定法篩查鑒定為GBS陽性，對照組鑒定為GBS陰性；孕周35～37周；均為單胎妊娠。

排除標(biāo)準(zhǔn)：已經(jīng)接受過抗菌藥物治療；合并其他感染；合并全身性疾??；合并嚴(yán)重的器質(zhì)性病變；近一個月內(nèi)有正常性生活；病歷資料不全；合并惡性腫瘤；合并精神疾病。

1.3 方法

1.3.1 GBS的分離鑒定 取所有患者陰道分泌物，采用熒光定量PCR法和顯色培養(yǎng)加鑒定法對GBS陽性進(jìn)行鑒定。顯色培養(yǎng)加鑒定法：將陰道分泌物拭子轉(zhuǎn)種至GBS顯色鑒定培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中于35～37℃中培養(yǎng)18～24 h，將顯色的GBS陽性菌落進(jìn)行進(jìn)一步革蘭染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)，若出現(xiàn)紅色、粉紅色或淺紫色，則判定為可疑陽性。熒光定量PCR法：將陰道分泌物在35℃、10%二氧化碳環(huán)境下孵育24～48 h，使用PCR法檢測GBS，嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明書進(jìn)行操作，若檢測出GBS，則判為GBS陽性。

1.3.2 血清分型 選取GBS陽性患者的血清，選用Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ-Ⅸ 10種乳膠凝集分型血清(生產(chǎn)廠家：丹麥血清研究所)對GBS血清型進(jìn)行鑒定，若菌株與上述10種乳膠凝集分型血清不發(fā)生凝集，則定義為不可分型。

1.3.3 抗菌藥物敏感性試驗(yàn) 選取GBS陽性菌落，對GBS菌株進(jìn)行抗菌藥物敏感性試驗(yàn)分析，采用紙片擴(kuò)散法，操作方法按照說明書進(jìn)行，對8種抗菌藥物(青霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢曲松敏感，對左氧氟沙星、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇肺炎鏈球菌ATCC 49619為質(zhì)控菌株(購自上海寶錄生物科技有限公司)，按照CLSI 2017標(biāo)準(zhǔn)[7]對結(jié)果進(jìn)行判定。

1.3.4 耐藥基因和毒力基因檢測 選取GBS陽性菌落，在完成DNA提取后，使用PCR法檢測8種抗菌藥物(青霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢曲松敏感，對左氧氟沙星、克林霉素、紅霉素、四環(huán)素)的耐藥基因(ermA、ermB、ermC、mefA/E、ermTR、tetM、tetO、tetL、tetS 和 linB)以及毒力基因(riB、alphaC、alp2/3、epsilon)。反應(yīng)體系總體積25 μL，包括：上下引物各1 μL、雙蒸水17.3 μL、dNTP 2 μL、10×Buffer 2.5 μL、DNA 模板1 μL、Taq 酶0.2 μL。循環(huán)條件：93℃預(yù)變性5 min，然后 93℃變性 30 s，50℃退火 30 s 接 72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后一個循環(huán)結(jié)束后再72℃延長5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物測序委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的妊娠結(jié)局比較 觀察組陰道分娩人數(shù)低于對照組，剖宮產(chǎn)人數(shù)、胎兒窘迫、胎膜早破、羊水污染發(fā)生率高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。觀察組早產(chǎn)人數(shù)以及Apgar評分均明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者的妊娠結(jié)局 例(%)

2.2 GBS陽性患者耐藥情況 GBS陽性患者的耐藥情況：GBS對青霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢曲松敏感，出現(xiàn)耐藥性情況左氧氟沙星24株(48.00%)、克林霉素19株(38.00%)、紅霉素36株(72.00%)、四環(huán)素43株(86.00%)。

2.3 GBS陽性孕婦定植GBS主要血清型分布 50例GBS陽性孕婦陰道定植的GBS共發(fā)現(xiàn)5個血清型，其中Ⅲ型有27株，占比54.00%、Ⅰb型有9株，占比18.00%、Ⅰa有5株，占比10.00%、Ⅴ型有5株，占比10.00%、Ⅱ型有4株，占比8.00%。

2.4 50株GBS菌株及不同血清型菌株對7種抗生素的敏感性 不同血清型菌株對青霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢曲松敏感。比較不同血清型對抗生素的敏感性發(fā)現(xiàn)，血清Ⅲ型菌株對左氧氟沙星的耐藥率明顯高于其他菌株。血清Ⅲ、Ⅰa型菌株對克林霉素的耐藥率明顯高于其他菌株。血清Ⅰb、Ⅰa型菌株對紅霉素的耐藥率明顯高于其他菌株。血清Ⅰb、Ⅰa型菌株對四環(huán)素的耐藥率明顯高于其他菌株。見表3。

表3 50株GBS菌株及不同血清型菌株對7種抗生素的敏感性

2.5 孕產(chǎn)婦GBS陽性菌株的血清型與耐藥性、毒力基因之間的關(guān)系 GBS陽性孕產(chǎn)婦主要的耐藥模式為：紅霉素-克林霉素-四環(huán)素、紅霉素-克林霉素-氯霉素、紅霉素-克林霉素-四環(huán)素-氯霉素、紅霉素-克林霉素-四環(huán)素-左氧氟沙星4種。其中Ⅲ型血清對抗生素耐藥性陽性率最高，耐藥陽性對比紅霉素>四環(huán)素>左氧氟沙星>克林霉素。耐藥基因中，tetM、mefA/E、tetO/ermB基因陽性率排名前三，tetM基因在血清Ⅰb型菌株的陽性率最高，mefA/E基因在血清Ⅲ型菌株的陽性率最高，tetO基因在血清Ⅰa型菌株的陽性率最高，ermB基因在血清Ⅱ型菌株的陽性率最高。毒力基因中，epsilon基因陽性率最高，epsilon基因在血清型Ⅰb的菌株陽性率最高。見表4。

表4 孕產(chǎn)婦GBS陽性菌株的血清型與耐藥性、毒力基因之間的關(guān)系分析 株(%)

3 討論

女性在妊娠狀態(tài)下，自身的激素水平發(fā)生改變，機(jī)體免疫功能下降，導(dǎo)致機(jī)體對抗病原菌的能力下降，大大增加了感染GBS的風(fēng)險。而對于合并陰道炎癥的孕婦，其陰道酸堿平衡維持作用減弱，宮頸防御能力下降，若是GBS感染，則會導(dǎo)致新生兒窒息、胎膜早破等并發(fā)癥。GBS感染可通過胎盤傳播，尤其是陰道分娩的孕產(chǎn)婦，則會增加早產(chǎn)、流產(chǎn)以及死胎等不良妊娠結(jié)局的發(fā)生概率[8]。大部分GBS病菌多寄生于人體的陰道或結(jié)腸，多數(shù)GBS陽性孕婦無明顯臨床癥狀，而GBS陽性孕婦發(fā)生產(chǎn)后感染的概率高達(dá)10.86%，故而加強(qiáng)對孕晚期GBS感染的篩查，對于降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生具有重要意義[9-10]。本次研究中，對兩組患者進(jìn)行GBS陽性篩查，同時統(tǒng)計分析兩組患者的妊娠結(jié)局，觀察組陰道分娩人數(shù)低于對照組，剖宮產(chǎn)人數(shù)、胎兒窘迫、胎膜早破、羊水污染發(fā)生率高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。觀察組早產(chǎn)人數(shù)以及Apgar評分均明顯高于對照組(P<0.05)。既往也有學(xué)者的研究指出[11]，GBS陽性也是導(dǎo)致新生兒腦膜炎、產(chǎn)褥期膿毒血癥發(fā)生的重要因素，GBS寄生于孕晚期產(chǎn)婦的陰道中，當(dāng)胎兒從陰道娩出時，通過母嬰傳播可導(dǎo)致嬰兒感染的發(fā)生，可導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、菌血癥、產(chǎn)后感染、骨髓炎以及皮膚和軟組織感染。由此可推測，孕晚期感染GBS大大增加了胎兒窘迫、胎膜早破、羊水污染、早產(chǎn)發(fā)生率。對于孕35～37周的產(chǎn)婦，及時進(jìn)行GBS陽性篩查，對于預(yù)防不良妊娠結(jié)局具有重要臨床意義。

GBS感染首選的抗菌藥物是青霉素，也是治療GBS感染的一線藥物。大量研究指出[12-14]，GBS對紅霉素、四環(huán)素、克林霉素等呈現(xiàn)不同程度的耐藥，而對萬古霉素表現(xiàn)出極高的敏感性。本次研究中，GBS陽性患者的耐藥情況：GBS對青霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢曲松敏感，對左氧氟沙星(48.00%)、克林霉素(38.00%)、紅霉素(72.00%)、四環(huán)素(86.00%)均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。50株GBS抗生素敏感性檢測結(jié)果顯示，不同血清型菌株對青霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢曲松敏感。比較不同血清型對抗生素的敏感性發(fā)現(xiàn)：血清Ⅲ型菌株對左氧氟沙星的耐藥率明顯高于其他菌株。血清Ⅲ、Ⅰa型菌株對克林霉素的耐藥率明顯高于其他菌株。血清Ⅰb、Ⅰa型菌株對紅霉素的耐藥率明顯高于其他菌株。血清Ⅰb、Ⅰa型菌株對四環(huán)素的耐藥率明顯高于其他菌株。美國疾病預(yù)防控制中心將青霉素G作為GBS陽性的首選抗菌藥物，但是由于青霉素過敏率較高，對于青霉素過敏的患者，建議選擇克林霉素、紅霉素進(jìn)行治療，但是不建議使用萬古霉素以及四環(huán)素；其主要原因在于四環(huán)素會導(dǎo)致新生兒骨骼發(fā)育受損、牙齒變色，而萬古霉素則會增加耳聾、腎臟損傷的發(fā)生風(fēng)險[15]。結(jié)合不同GBS血清分型，結(jié)合菌株藥敏結(jié)果，可以針對性地選擇抗生藥物進(jìn)行治療，以降低GBS陽性所致的不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險。

GBS按照細(xì)胞壁特異性S物質(zhì)可分為10種，其主要致病類型為Ⅰa、Ⅰb、Ⅲ、Ⅴ型，其中，以Ⅲ型毒性最強(qiáng)。有研究指出[16-18]，不同地區(qū)的GBS血清型分布情況存在較大的差異，在日本地區(qū)，血清Ⅵ-Ⅸ型占比最高，在其他地區(qū)較為少見。在西澳大利亞地區(qū)，以Ⅰa、Ⅲ、Ⅱ型占比最高；摩洛哥地區(qū)地區(qū)Ⅴ、Ⅱ型較為常見；葡萄糖地區(qū)，以Ⅲ、Ⅴ、Ⅰb型較為常見。結(jié)合本次研究，50例GBS陽性孕婦陰道定植的GBS共發(fā)現(xiàn)5個血清型，其中Ⅲ型有27株，占比54.00%、Ⅰb型有9株，占比18.00%、Ⅰa型有5株，占比10.00%、Ⅴ型有5株，占比10.00%、Ⅱ型有4株，占比8.00%。本次收集的數(shù)據(jù)中，以Ⅲ型較為常見，其中Ⅲ型血清也是毒性最強(qiáng)的血清分型。GBS陽性孕產(chǎn)婦主要的耐藥模式為：紅霉素-克林霉素-四環(huán)素、紅霉素-克林霉素-氯霉素、紅霉素-克林霉素-四環(huán)素-氯霉素、紅霉素-克林霉素-四環(huán)素-左氧氟沙星4種。其中Ⅲ型血清對抗生素耐藥性陽性率最高，耐藥陽性對比紅霉素>四環(huán)素>左氧氟沙星>克林霉素。耐藥基因中，tetM、mefA/E、tetO/ermB基因陽性率排名前三，tetM基因在血清Ⅰb型菌株的陽性率最高，mefA/E基因在血清Ⅲ型菌株的陽性率最高，tetO基因在血清Ⅰa型菌株的陽性率最高，ermB基因在血清Ⅱ型菌株的陽性率最高。毒力基因中，epsilon基因陽性率最高，epsilon基因在血清型Ⅰb的菌株陽性率最高。GBS在全球?qū)W者的研究報道中均顯示[19-21]，糖肽類以及β-內(nèi)酰胺類抗生素對GBS均有較強(qiáng)的抑菌活性，但是不同抗生素對GBS的抑菌活性存在不同的差異。GBS對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素產(chǎn)生耐藥的機(jī)制是ermB、ermA、ermC、ermTR基因所介導(dǎo)，而erm基因編碼甲基化酶23S rRNA負(fù)責(zé)低克林霉素、紅霉素核糖體中的受體位點(diǎn)進(jìn)行甲基化，進(jìn)而引起抗性，導(dǎo)致耐藥性發(fā)生；其次，mef基因所介導(dǎo)的大環(huán)內(nèi)脂外排泵，也是導(dǎo)致發(fā)生耐藥性的原因。對應(yīng)本次研究結(jié)果，菌株的血清型分型的耐藥性與基因分型、毒力基因之間存在高度相關(guān)性，且GBS遺傳背景存在一定的特異性，通過對孕晚期GBS感染的血清型耐藥性及分子遺傳背景特征進(jìn)行分析，能夠?yàn)镚BS感染孕婦選擇針對性抗生藥物進(jìn)行治療，進(jìn)一步為研發(fā)GBS疫苗提供理論依據(jù)。

綜上所述，孕晚期GBS感染的血清分型以Ⅲ型、Ⅰb型、Ⅰa型、Ⅴ型、Ⅱ型常見，GBS對青霉素、萬古霉素、氨芐西林、頭孢曲松敏感，對紅霉素、四環(huán)素耐藥程度極高。其中Ⅲ型血清對抗生素耐藥性陽性率最高，tetM、mefA/E、tetO/ermB基因陽性率排名前三，毒力基因中，epsilon基因陽性率最高。通過對孕晚期GBS感染的血清型耐藥性及分子遺傳背景特征進(jìn)行分析，可有效防止母嬰 GBS 垂直傳播的發(fā)生，為GBS疫苗提供流行病學(xué)依據(jù)。受樣本量限制，本研究結(jié)果有待擴(kuò)大化的中心試驗(yàn)證實(shí)。

利益相關(guān)聲明：此研究不存在潛在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：楊景醞釀和設(shè)計實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集、分析解釋數(shù)據(jù)，起草、撰寫論文，統(tǒng)計分析。田輝獲取研究經(jīng)費(fèi)，行政、技術(shù)或材料支持，審閱論文，指導(dǎo)。蘇慧琳采集、分析解釋數(shù)據(jù)，指導(dǎo)。許一諾實(shí)施研究，采集、分析解釋數(shù)據(jù)。