尖銳濕疣患者皮損組織中Smac、BIRC5的表達(dá)及意義*

牛理達(dá), 畢新嶺, 張瑞, 丁菲

1周口市中心醫(yī)院皮膚科(河南周口 466000)；2上海長海醫(yī)院皮膚科(上海 200433)

尖銳濕疣(condyloma acuminatum，CA)是由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染引起的性傳播疾病，好發(fā)部位包括生殖器、肛門等，具有傳播能力強(qiáng)、增生快速、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)。有研究表明CA復(fù)發(fā)率高達(dá)59%。雖然目前臨床上有很多治療CA的方法，但易復(fù)發(fā)仍然是一個(gè)急需解決的問題，且容易合并宮頸癌等癌癥的發(fā)生，給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者及家人的身心健康。因此，研究與CA有關(guān)的標(biāo)志物對疾病的早期鑒別和防治具有重要意義[1-3]。第二個(gè)線粒體衍生半胱天冬氨酸蛋白酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)是一種線粒體膜間隙蛋白，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)功能，Smac高表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[4-5]。王志紅等[6]研究結(jié)果表明，Smac異常低表達(dá)與卵巢子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生有關(guān)。凋亡抑制因子5(baculoviral IAP repeat-containing protein 5，BIRC5)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的一員，正常情況下不表達(dá)或少量表達(dá)，但在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡的作用，研究表明，BIRC5異常高表達(dá)與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7-9]。然而，關(guān)于Smac、BIRC5在CA患者組織中表達(dá)的研究較少。本研究主要探討CA患者組織中Smac和BIRC5表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2021年6月在本院就診的100例CA患者作為研究對象并設(shè)置為研究組，其中男52例，女48例，年齡24～36歲，平均(30.16±5.28)歲。皮損部位位于包皮、陰莖、龜頭、冠狀溝、尿道口、大小陰唇、陰道、肛周。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合中華醫(yī)學(xué)會皮膚性病學(xué)分會性病學(xué)組制定的《CA診療指南(2014)》[10]中關(guān)于CA的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)術(shù)后經(jīng)病理確診；(3)近期未接受任何免疫治療；(4)臨床資料完整；(5)患者及家屬均知情同意并簽署同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他系統(tǒng)性疾??；(2)有不典型增生、癌變等；(3)伴有其他皮膚疾病；(4)合并糖尿病、惡性腫瘤等其他疾病；(5)近期服用炎癥抑制藥或抗凝藥物等；(6)精神疾病者。

另選擇同時(shí)期103例非皮膚病行手術(shù)切除后留取切緣處正常皮膚組織的患者為對照組；其中男53例，女50例，年齡26～35歲，平均(30.52±4.04)歲。

研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(AF-HEC-006-01.0)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集所有受試者以下臨床資料：性別、年齡、HPV感染類型、病程、發(fā)病部位、復(fù)發(fā)次數(shù)等。

1.2.2 樣品采集 取手術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為CA患者的CA組織，非皮膚病行手術(shù)切除后留取切緣處的正常皮膚組織，置于-80℃冰箱中保存待測。

1.2.3 免疫組化法檢測組織中Smac、BIRC5的表達(dá)情況 取組織標(biāo)本進(jìn)行多聚甲醛固定，然后石蠟包埋，制作3 μm石蠟切片，用多聚賴氨酸處理防止脫片，分別加入稀釋的兔抗人Smac(1∶150)、BIRC5(1∶100)一抗，4℃過夜，陰性對照組使用稀釋液代替，使用PBS進(jìn)行3次清洗，在室溫條件下，分別滴加3%的H2O2溶液孵育10 min，分別加入山羊抗兔IgG二抗25℃孵育1 h，DAB染色，蘇木素復(fù)染，使用生物顯微鏡高倍視野(×400)觀察切片。兔抗人Smac單克隆抗體、兔抗人BIRC5單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德公司，DAB染色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，生物顯微鏡(型號：SPCC-200)購自日本尼康公司。

1.2.4 結(jié)果判定 根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比乘積大小劃分：0分為Smac、BIRC5陰性(-)，1～4分為Smac、BIRC5弱陽性(+)，5～8分為Smac、BIRC5中度陽性(++)，9≥為Smac、BIRC5強(qiáng)陽性(+++)，見表1。

表1 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 qRT-PCR檢測組織Smac mRNA、BIRC5 mRNA的相對表達(dá)量 取相應(yīng)組織研磨，加入1 mL Trizol試劑完全裂解提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用qRT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為5℃，5 min；95℃，30 s；60℃，60 s，70℃，35 s，共39個(gè)循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參。Smac mRNA、BIRC5 mRNA、GAPDH的上下游引物序列見表2，采用2-ΔΔCT法分析Smac mRNA、BIRC5 mRNA的表達(dá)水平。Smac mRNA、BIRC5 mRNA、GAPDH引物序列由上海生工生物工程技術(shù)公司構(gòu)建，Trizol試劑購自美國Invitrogen公司，PCR基因擴(kuò)增儀購自美國Applied Biosyst AB公司。

表2 qRT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用例(%)表示，組間比較采用2檢驗(yàn)；用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)性分析Smac、BIRC5的相關(guān)性；使用ROC曲線分析Smac、BIRC5對CA的診斷價(jià)值；多因素logistic回歸分析影響CA發(fā)生的危險(xiǎn)因素，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織中Smac、BIRC5陽性表達(dá)比較 研究組患者CA組織BIRC5陽性率明顯高于對照組，Smac陽性率明顯低于對照組(P<0.05)，見表3、圖1。

表3 組織中Smac、BIRC5陽性表達(dá)比較 例

注：A:CA組織Smac陰性表達(dá)；B:CA組織Smac陽性表達(dá);C:CA組織BIRC5陰性表達(dá);D:CA組織BIRC5陽性表達(dá)

2.2 組織中Smac mRNA、BIRC5 mRNA表達(dá)水平比較 研究組患者CA組織Smac mRNA相對表達(dá)量明顯低于對照組，BIRC5 mRNA相對表達(dá)量明顯高于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 組織中Smac mRNA、BIRC5 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 組織中Smac與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 Smac表達(dá)與CA患者性別、發(fā)病部位、年齡無關(guān)(P>0.05)，病程≥3個(gè)月、HPV感染類型為混合型、復(fù)發(fā)次數(shù)≥6次的組織中Smac陽性表達(dá)均低于病程<3個(gè)月、HPV感染類型為單一型、復(fù)發(fā)次數(shù)<6次的組織(P<0.05)，見表5。

表5 組織中Smac表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

2.4 組織中BIRC5與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 BIRC5表達(dá)與CA患者性別、發(fā)病部位、年齡無關(guān)(P>0.05)，病程≥3個(gè)月、HPV感染類型為混合型、復(fù)發(fā)次數(shù)≥6次的組織中BIRC5陽性表達(dá)均高于病程<3個(gè)月、HPV感染類型為單一型、復(fù)發(fā)次數(shù)<6次的組織(P<0.05)，見表6。

表6 組織中BIRC5表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例

2.5 組織Smac、BIRC5的相關(guān)性分析 CA患者組織中，Smac、BIRC5表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.663，P<0.05)，見表7。

表7 CA組織中Smac、BIRC5相關(guān)性分析 例

2.6 Smac、BIRC5水平對CA的診斷價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，Smac診斷CA的ROC曲線下面積(area under the cure，AUC)為0.805(0.746～0.864)，敏感度為73.0%，特異度為78.6%，截?cái)嘀禐?.425；BIRC5診斷CA發(fā)生的AUC為0.813(0.752～0.874)，敏感度為80.0%，特異度為78.6%，截?cái)嘀禐?.439；兩者聯(lián)合診斷CA發(fā)生的AUC為0.939(0.906～0.972)，敏感度為93.0%，特異度為77.7%；與Smac、BIRC5單獨(dú)相比，兩者聯(lián)合診斷CA發(fā)生的AUC更高(z=3.886、3.564，P均=0.000)，見圖2。

圖2 ROC曲線

2.7 多因素logistic回歸分析影響CA的危險(xiǎn)因素 將是否發(fā)生CA作為因變量，以病程、HPV感染類型、復(fù)發(fā)次數(shù)、Smac、BIRC5水平作為自變量進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示病程≥3個(gè)月、HPV感染類型為混合型、復(fù)發(fā)次數(shù)≥6次、Smac陰性表達(dá)、BIRC5陽性表達(dá)是影響CA發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表8。

表8 多因素logistic回歸分析影響CA發(fā)生的危險(xiǎn)因素

3 討論

CA是由HPV感染引起生殖器、肛門等部位皮膚黏膜增生性損害的疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為皮損、生殖器或肛周等部位出現(xiàn)淡紅色丘疹及贅生物，目前臨床上大多是通過物理治療(CO2激光治療、微波治療等)、藥物治療(鬼臼毒素、咪喹莫特乳膏等)、手術(shù)治療(剪切術(shù)、刮除術(shù)等)等方法進(jìn)行治療，但無法根治性治愈，仍有部分患者反復(fù)發(fā)作，給患者及家人的身心健康帶來極大的影響。因此，研究與CA有關(guān)的標(biāo)志物對疾病的早期鑒別和防治具有重要意義[11-13]。

Smac主要定位于線粒體，由線粒體膜間隙釋放，是一種促凋亡蛋白，通過解除凋亡抑制蛋白對半胱氨酸蛋白酶 caspase 的抑制而發(fā)揮促凋亡作用，在細(xì)胞凋亡、增殖等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，參與子宮內(nèi)膜癌[14]、口腔鱗癌[15]、乳腺癌[4]等多種疾病的發(fā)生?？椎沦坏萚16]研究結(jié)果表明將Smac轉(zhuǎn)染至人晶狀體上皮細(xì)胞后，細(xì)胞增生率下降，Smac可抑制人晶狀體上皮細(xì)胞的增生且促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，可有效防治晶狀體后囊膜渾濁的發(fā)生。祝平等[17]研究結(jié)果表明，在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜組織和異位內(nèi)膜組織中Smac表達(dá)均低于正常子宮內(nèi)膜組織，患者異位內(nèi)膜組織中Smac表達(dá)低于位內(nèi)膜組織，正常子宮內(nèi)膜組織中增生期Smac表達(dá)低于分泌期，表明Smac低表達(dá)可使異位內(nèi)膜細(xì)胞增生和抗凋亡能力增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，研究組CA組織中Smac陽性率及相對表達(dá)量明顯低于對照組，提示Smac低表達(dá)可能與CA的發(fā)生有關(guān)，推測Smac可能通過促進(jìn)CA組織細(xì)胞的凋亡,抑制CA組織的增長；研究組患者中病程≥3個(gè)月、HPV感染類型為混合型、復(fù)發(fā)次數(shù)≥6次的組織中Smac陽性表達(dá)均低于病程<3個(gè)月、HPV感染類型為單一型、復(fù)發(fā)次數(shù)<6次的組織，提示Smac表達(dá)與病程、HPV感染類型、復(fù)發(fā)次數(shù)有關(guān)；ROC曲線分析結(jié)果表明，Smac診斷CA的AUC為0.805，提示Smac對CA具有良好的診斷價(jià)值；多因素logistic回歸分析顯示，Smac陰性表達(dá)是影響CA發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示Smac可作為CA的診斷標(biāo)志物。

BIRC5是一種致癌因子，是凋亡抑制家族中新發(fā)現(xiàn)的成員，是目前最強(qiáng)的抑制凋亡因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、抑制細(xì)胞凋亡等復(fù)雜生物學(xué)功能，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，與癌細(xì)胞的增殖分化相關(guān)[18-19]。李雪菲等[20]研究結(jié)果表明，胃癌組織中BIRC5陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，BIRC5陽性表達(dá)的胃癌患者生存期比BIRC5陰性表達(dá)患者的生存期短，表明BIRC5高表達(dá)患者預(yù)后不良，將BIRC5轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS中，細(xì)胞凋亡率降低，BIRC5具有抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增長的作用。王華彬等[21]研究結(jié)果表明，干擾BIRC5在白血病細(xì)胞株TCHu147中的表達(dá)，TCHu147細(xì)胞增殖能力減弱，下調(diào)BIRC5在白血病細(xì)胞株TCHu147中的表達(dá)，TCHu147細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，表明BIRC5表達(dá)與TCHu147細(xì)胞增殖有關(guān)，BIRC5具有促進(jìn)急性淋巴細(xì)胞白血病TCHu147細(xì)胞株的增殖和抑制其凋亡的作用。本研究結(jié)果表明，研究組CA組織中BIRC5陽性率及相對表達(dá)量明顯高于對照組，提示BIRC5高表達(dá)可能與CA的發(fā)生有關(guān)；病程≥3個(gè)月、HPV感染類型為混合型、復(fù)發(fā)次數(shù)≥6次的組織中BIRC5陽性表達(dá)均高于病程<3個(gè)月、HPV感染類型為單一型、復(fù)發(fā)次數(shù)<6次的組織，提示BIRC5表達(dá)與病程、HPV感染類型、復(fù)發(fā)次數(shù)有關(guān)；ROC曲線分析結(jié)果表明，BIRC5診斷CA發(fā)生的AUC為0.813，兩者聯(lián)合診斷發(fā)生的AUC為0.939，與Smac、BIRC5單獨(dú)相比，兩者聯(lián)合診斷CA發(fā)生的AUC更高，提示BIRC5對CA具有良好的診斷價(jià)值，而二者聯(lián)合診斷可提高對CA的診斷價(jià)值；多因素logistic回歸分析顯示，BIRC5陽性表達(dá)是影響CA發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示BIRC5可作為CA的診斷標(biāo)志物。Chang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Smac模擬物可下調(diào)BIRC5從而抑制癌癥的發(fā)生，本研究進(jìn)一步分析結(jié)果表明，CA組織中Smac、BIRC5表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示Smac、BIRC5可共同參與CA的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，Smac、BIRC5在CA組織中表達(dá)異常，檢測兩者水平對CA的早期防治具有重要意義。但本研究存在一定的不足，比如樣本量少，只進(jìn)行了對Smac、BIRC5在CA患者中表達(dá)變化的研究，未從分子機(jī)制上研究Smac與BIRC5在疾病中的具體作用機(jī)制，需后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

利益相關(guān)聲明：本文不涉及相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：牛理達(dá)是本研究的設(shè)計(jì)者和執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作；張瑞、丁菲參與研究設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果分析；畢新嶺是項(xiàng)目的構(gòu)思者及負(fù)責(zé)人，指導(dǎo)研究設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)分析、論文寫作與修改。全體作者都閱讀并同意最終的文本。