ER陽性乳腺癌患者miR-1-3p、SOX9的表達(dá)及意義*

張亞娜, 周倩梅, 李嘉昊, 李靖若

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科(河南鄭州 450052)

乳腺癌是激素依賴性腫瘤，全球每年有210萬新發(fā)乳腺癌[1]。內(nèi)分泌治療是激素受體(estrogen receptor，ER)陽性乳腺癌的重要治療手段。術(shù)前對乳腺癌患者行內(nèi)分泌治療可提高腫瘤的局部控制率、降低腫瘤分期，提高腫瘤成功切除率，改善預(yù)后[2-3]。內(nèi)分泌治療作為臨床上一種新輔助治療方法，臨床效果好，對年老體弱、不耐化療的患者尤為適用。但內(nèi)分泌治療耐藥阻礙了乳腺癌的治療療效，目前關(guān)于內(nèi)分泌治療藥物耐藥的發(fā)生機(jī)制尚不明確。微小RNA(microRNA，miRNA)可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成等影響腫瘤的發(fā)展。微小RNA-1-3p(microRNA-1-3p，miR-1-3p)可調(diào)節(jié)生命進(jìn)程中重要進(jìn)程。Jiao等[4]研究顯示，miR-1-3p肺癌組織表達(dá)水平明顯下降，過表達(dá)miR-1-3p增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對吉非替尼藥的敏感性。性別決定區(qū)Y框蛋白9[SRY(sex determining region Y)-box 9，SOX9]是一種癌基因，沉默其表達(dá)可抑制腫瘤遷移能力。有研究顯示過表達(dá)SOX9促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖[5]。Zhang等[6]研究顯示，在肝細(xì)胞癌中SOX9是miR-1-3p直接靶目標(biāo)。目前SOX9、miR-1-3p表達(dá)水平與乳腺癌內(nèi)分泌治療的關(guān)系尚未有研究報道。本研究探討miR-1-3p、SOX9表達(dá)水平對ER陽性乳腺癌細(xì)胞內(nèi)分泌治療敏感性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月至2016年9月于本院收治的ER陽性乳腺癌患者106例(ER陽性乳腺癌組)，均為女性。ER陽性乳腺癌組年齡45～78歲，平均(62.75±9.27)歲。腫瘤最大徑<2.0 cm有75例，腫瘤最大徑≥2.0 cm有31例。65例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。TNM分期Ⅰ期9例，Ⅱ期62例，Ⅲ期35例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)ER陽性乳腺癌組癌組織經(jīng)病理檢查證實(shí)為乳腺癌組織；(2)年齡>18歲；(3)患者臨床資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)妊娠期、哺乳期女性；(2)存在自身免疫缺陷疾病；(3)合并其他惡性腫瘤；(4)肝、腎功能嚴(yán)重異常。

同期選擇在本院確診為乳腺增生并行乳腺增生手術(shù)的患者80例(乳腺增生組)，術(shù)中留取的乳腺增生組織置于液氮中凍存。乳腺增生組年齡43～76歲，平均(60.65±9.68)歲。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會討論批準(zhǔn)(SS-2014-03)。

1.2 治療方法 106例患者治療前均行空心針穿刺，取乳腺癌組織，分成兩份，置于液氮中凍存，一份用于后續(xù)試驗，一份用于組織病理檢查。病理檢查確定乳腺癌分型、組織學(xué)分級，并檢測PR、Her-2。ER陽性乳腺癌患者依據(jù)病理分期行術(shù)后放、化療及內(nèi)分泌治療在內(nèi)的綜合治療，其中62例患者接受內(nèi)分泌治療，未絕經(jīng)的內(nèi)分泌治療患者接受他莫昔芬內(nèi)分泌治療，他莫昔芬(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31021545，規(guī)格10 mg×60片/瓶，生產(chǎn)廠家：上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司)，劑量為20 mg/d；絕經(jīng)后女性行芳香化酶抑制劑治療，阿那曲唑(批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20093556，生產(chǎn)廠家：浙江海正藥業(yè)股份有限公司)，劑量為2.5 mg/d。28 d為1個周期，3個周期后，化療過程中，每周監(jiān)測血常規(guī)、肝腎功能，

1.3 化療效果評價 遠(yuǎn)期療效評價：乳腺癌根治術(shù)后進(jìn)行隨訪，對ER陽性乳腺癌患者隨訪60個月，隨訪截止時間2021年9月。記錄患者總生存時間(開始內(nèi)分泌治療至患者死亡或末次隨訪時間)，即到至因任何原因引起死亡的時間。

1.4 檢測乳腺癌組織中miR-1-3p、SOX9表達(dá)水平 采用實(shí)時熒光定量PCR檢測ER陽性乳腺癌組織和乳腺增生手術(shù)留取的乳腺增生組織miR-1-3p、SOX9表達(dá)水平。使用TRIzol試劑(武漢科昊佳生物科技有限公司)提取組織總RNA，采用PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(美國Promega公司)反轉(zhuǎn)錄總RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。采用StepOne Plus實(shí)時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)對miR-1-3p、SOX9及內(nèi)參U6、GAPDH進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。按照GoTaq? qPCRMaster Mix(美國Promega公司)說明書建立反應(yīng)體系，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔，反應(yīng)條件：95℃，3 min；95℃，30 s；60℃，1 min；72℃，40 s；38個循環(huán)；72℃，3 min。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計算miR-1-3p、SOX9 mRNA的相對表達(dá)量。引物設(shè)計見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 SOX9、miR-1-3p在ER陽性乳腺癌組和乳腺增生組中表達(dá)水平 與乳腺增生組相比，ER陽性乳腺癌miR-1-3p相對表達(dá)水平較低(P<0.05)，SOX9 mRNA相對表達(dá)水平較高(P<0.05)。見表2。

表2 SOX9、miR-1-3p在乳腺癌中表達(dá)水平

2.2 SOX9、miR-1-3p表達(dá)水平與ER陽性乳腺癌臨床病理特征關(guān)系 miR-1-3p、SOX9均與ER陽性乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，均與患者年齡、腫瘤大小、TNM分期、PR表達(dá)、HER-2表達(dá)無關(guān)(P>0.05)，見表3。

表3 SOX9、miR-1-3p表達(dá)水平與ER陽性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 不同SOX9、miR-1-3p表達(dá)水平與ER陽性乳腺癌患者預(yù)后關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析顯示，miR-1-3p高表達(dá)組ER陽性乳腺癌患者生存時間為(52.93±1.69)個月，顯著長于miR-1-3p低表達(dá)組(36.69±2.76)個月，Log-rank檢驗，2=16.132，P<0.05(圖1)。SOX9低表達(dá)組ER陽性乳腺癌患者生存時間為(53.03±1.74)個月，顯著長于SOX9高表達(dá)組(36.49±2.72)個月，Log-rank檢驗，2=19.003，P<0.05(圖2)。

圖1 乳腺癌組織miR-1-3p表達(dá)與五年內(nèi)總生存率的關(guān)系

圖2 乳腺癌組織SOX9表達(dá)與5年內(nèi)總生存率的關(guān)系

2.4 ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療療效影響因素分析 以ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療長期療效為因變量，以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-1-3p、SOX9為自變量，行COX多因素生存分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、miR-1-3p、SOX9是ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療長期療效的獨(dú)立影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療長期療效影響因素分析

2.6 ER陽性乳腺癌組織中SOX9和miR-1-3p共表達(dá)與患者臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)性 (1)Pearson相關(guān)性分析顯示，ER陽性乳腺癌組織中SOX9和miR-1-3p呈負(fù)相關(guān)(r=-0.682，P<0.05)。(2)將miR-1-3p低表達(dá)和SOX9高表達(dá)(miR-1-3p-/SOX9+)分為一組，共47例，miR-1-3p高表達(dá)和SOX9低表達(dá)(miR-1-3p+/SOX9-)分為一組，共34例。臨床病理特征分析SOX9和miR-1-3p共表達(dá)與ER陽性乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，見表6。預(yù)后分析顯示，miR-1-3p-/SOX9+組生存時間顯著長于miR-1-3p+/SOX9-組(Log-rank檢驗，2=13.016，P<0.05)。見圖3。

圖3 SOX9和miR-1-3p共表達(dá)與乳腺癌患者內(nèi)總生存率的關(guān)系

表6 SOX9和miR-1-3p共表達(dá)與ER陽性乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

3 討論

miRNA是不編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA，miRNA可通過沉默靶基因mRNA，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移[8]。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miRNA與乳腺癌的發(fā)展進(jìn)程、腫瘤耐藥性密切相關(guān)[9]。miR-1-3p具有多種生物學(xué)功能。miR-1-3p高表達(dá)具有調(diào)節(jié)肺血管重塑的作用，miR-1-3p在缺氧的肺動脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)水平呈下調(diào)[10]。衛(wèi)江華等[11]研究顯示，過表達(dá)miR-1-3p可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖能力，抑制細(xì)胞周期G1期至S期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，為miR-1-3p作為骨肉瘤的治療靶點(diǎn)及腫瘤標(biāo)志物提供了可能。Tao等[12]研究顯示，乳腺癌細(xì)胞中miR-1-3p升高可抑制細(xì)胞活力和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并抑制了腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移，此外，轉(zhuǎn)染miR-1-3p模擬物的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡可提高miR-1-3p表達(dá)水平以抑制癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移方面更有效。Zhang等[13]研究顯示，外泌體miR-1-3p是腺癌術(shù)后蒽環(huán)類藥物性肝損傷發(fā)病機(jī)制中必不可少的外泌體miRNA，高表達(dá)miR-1-3p可通過調(diào)控白細(xì)胞介素-6激活免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激而參與蒽環(huán)類藥物性肝損傷發(fā)展。本研究顯示ER陽性乳腺癌組miR-1-3p相對表達(dá)水平明顯低于乳腺增生組，提示miR-1-3p可能參與ER陽性乳腺癌病理進(jìn)程。Jiao等[4]研究顯示，miR-1-3p通過抑制腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對吉非替尼藥的敏感性。本研究顯示Kaplan-Meier法顯示，miR-1-3p高表達(dá)組ER陽性乳腺癌患者生存時間為顯著長于miR-1-3p低表達(dá)組，且miR-1-3p是ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療長期療效的獨(dú)立影響因素，提示miR-1-3p可能與ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療效果有關(guān)，會影響患者預(yù)后。

SOX9在人類早期胚胎中具有重要作用，在心臟發(fā)育、骨骼肌發(fā)育中也扮演關(guān)鍵角色，可參與腫瘤細(xì)胞的分化、侵襲等[14]。本研究顯示ER陽性乳腺癌組SOX9相對表達(dá)水平明顯較乳腺增生組高，提示SOX9可能在乳腺癌病理進(jìn)程發(fā)揮重要作用。Gao等[15]研究顯示，在乳腺癌中SOX9是miR-215-5p的靶基因，SOX9過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。Yang等[16]研究顯示，在ATP處理后乳腺癌細(xì)胞中，SOX9表達(dá)上調(diào)，但抑制SOX9表達(dá)后，裸鼠乳腺癌腫瘤生長減少，對藥物敏感性增強(qiáng)。本研究顯示Kaplan-Meier法顯示，SOX9低表達(dá)組ER陽性乳腺癌患者生存時間顯著長于SOX9高表達(dá)組，且SOX9是ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療長期療效的獨(dú)立影響因素，提示SOX9可能會影響ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療療效，影響患者預(yù)后。為探究SOX9和miR-1-3p在ER陽性乳腺癌組織中相關(guān)性，本研究發(fā)現(xiàn)SOX9和miR-1-3p呈負(fù)相關(guān)，且miR-1-3p-/SOX9+組生存時間顯著長于miR-1-3p+/SOX9-組，表明SOX9和miR-1-3p可能共同對ER陽性乳腺癌患者預(yù)后產(chǎn)生影響。本研究結(jié)果與Zhang等[6]研究一致，SOX9與miR-1-3p存在相關(guān)性。

綜上所述，miR-1-3p、SOX9與ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療敏感密切相關(guān)，檢測miR-1-3p、SOX9表達(dá)水平有助于評估ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療療效。但本研究從mRNA水平分析SOX9在ER陽性乳腺癌組織中表達(dá)，未從蛋白水平分析SOX9表達(dá)，分析結(jié)果可能存在偏倚，本研究尚未深入探究miR-1-3p、SOX9在ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌治療中的作用，后續(xù)將增加樣本量，同時用免疫組化分析SOX9表達(dá)水平，繼續(xù)深入研究。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：張亞娜負(fù)責(zé)實(shí)驗設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、論文撰寫；周倩梅，李嘉昊負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析、修改；李靖若負(fù)責(zé)指導(dǎo)。