MDSCs可調控Th1、Th2、Th17相關細胞因子水平加重哮喘小鼠肺損傷*

林隆, 彭峰, 金海麗, 肖鳳春

1浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市胸科醫(yī)院兒科(浙江杭州 310003)；2浙江省中醫(yī)院病理科(浙江杭州 310008)

支氣管哮喘是我國兒童常見的呼吸道慢性疾病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。國際報道稱80%的哮喘出現(xiàn)于3歲之前，嚴重影響兒童的身心健康及生長發(fā)育[2]，因此探究其作用機制及其預后措施是醫(yī)學領域的重要任務。髓系抑制細胞(myeliod-derived suppressor cells, MDSCs)最初是從腫瘤患者體內(nèi)分離出的異質性細胞群，在免負向疫調節(jié)中發(fā)揮了不可替代的作用[3]。同時，有關學者通過對致敏小鼠研究發(fā)現(xiàn)MDSCs能夠通過產(chǎn)生氧自由基對肺部炎癥和氣道高反應性起介導作用，提示MDSCs與哮喘發(fā)病密切相關[4]。許多研究表明，支氣管哮喘疾病與輔助性T細胞(helper T cell，Th)失衡關系密切。γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)由Th1細胞分泌，白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-10由Th2 細胞分泌，這些細胞因子均與肺部炎癥有密切關系[5]。Th17細胞是新發(fā)現(xiàn)的一種CD4+T細胞亞群，可分泌IL-17。Qin等[6]研究發(fā)現(xiàn)人類支氣管出現(xiàn)炎癥后會促進Th17分化從而更易引發(fā)哮喘。目前，MDSCs對哮喘的報道很少，MDSCs與Th1、Th2、Th17在該疾病中的關系更是鮮見報道。因此本研究組在2019年1月至2021年9月通過建立哮喘動物模型，探究了MDSCs與Th1、Th2、Th17之間的作用關系，從而為幼兒哮喘的治療和診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 96孔培養(yǎng)板，貨號：167008，Thermo。PAS染液套裝、HE染液套裝，貨號：G1008、G1003，SERVICEBIO。小鼠IFN-γ ELISA試劑盒，貨號：MM-0182M2，江蘇酶免實業(yè)有限公司。小鼠IL-10 ELISA檢測試劑盒、小鼠免疫球蛋白E(IgE)ELISA試劑盒、小鼠IL-17 ELISA試劑盒、小鼠IL-4 ELISA試劑盒，貨號：ml002285、ml037602、ml037866、ml063156-J，上海酶聯(lián)生物科技有限公司。過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒，貨號：A007-2-1、A003-1-2、A001-3-2，南京建成生物工程研究所有限公司。谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性檢測試劑盒，貨號：BC1190，Solarbio。

1.2 設備 JB-P5型包埋機(武漢俊杰電子有限公司),RM2016型組織切片機(上海徠卡儀器有限公司),NIKON ECLIPSE E100型正置光學顯微鏡、NIKON DS-U3型成像系統(tǒng)(日本尼康),AE2000型光學顯微鏡(Motic)。

1.3 動物及倫理 15只SPF級6～8周雌性BALB/c小鼠，體重(20±2)g，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(滬)2017-0005。杭州鷹旸生物科技有限公司動物中心飼養(yǎng)，動物使用SYXK許可證號為(浙)2020-0024。

1.4 模型建立及動物分組 小鼠分為生理鹽水組(對照組)、卵蛋白(ovalbumin，OVA)引起的哮喘(OVA)組和用腫瘤衍生的MDSCs處理(OVA+MDSCs)組，各組n=5。小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，除對照組外，其余小鼠在實驗的第1、8、15天用100 μg OVA和2 mL 10%氫氧化鋁注射，然后每隔1 d用2%的OVA吸入30 min，建立OVA模型[7]。在模型建立的第3周，將MDSCs細胞濃度調整至1×107細胞/mL，注射0.2 mL于小鼠尾靜脈，1次/d，共計7次。對照組及OVA組注射等體積生理鹽水。最后一次MDSCs注射后6 h處死小鼠，取血、分離肺組織。

1.5 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)細胞計數(shù) 實驗結束后收集小鼠BALF。小鼠肺部氣管插管，采用生理鹽水灌洗3次，收集BALF，離心，通過Neubauer室和Wright&Giemsa染色對BALF中細胞(嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞)進行總計數(shù)和差異計數(shù)。

1.6 ELISA檢測 小鼠取血后離心取上清，按照ELISA檢測試劑盒操作，測定血清中IFN-γ、IL-10、IgE、IL-17和IL-4含量。

1.7 氧化相關指標檢測 取肺組織制成勻漿液，按照試劑盒操作測定小鼠肺組織中MDA、CAT、SOD和GPX的含量。

1.8 HE染色 分離肺組織，固定，包埋，切片，依次入蘇木素和伊紅染色，后脫水封片，鏡檢。行HE半定量評分：0分代表組織形態(tài)正常，未見損傷；1分代表出現(xiàn)少量炎性細胞浸潤；2分代表炎性細胞浸潤情況明顯，出現(xiàn)少量的上皮細胞脫落；3分代表炎性細胞浸潤明顯，大量上皮細胞脫落；4分代表大量炎性細胞浸潤，組織損傷嚴重。

1.9 PAS染色 石蠟切片脫蠟至水，切片依次放入染液中進行染色，脫水，中性樹膠封片，鏡檢分析，并測定肺組織氣管壁厚度和上皮黏膜厚度。行PAS半定量評分：0分代表未見組織黏液及杯狀細胞增生；1分代表少量黏液及杯狀細胞增生產(chǎn)生；2分代表肺組織黏液分泌范圍達25%～50%；3分代表肺組織黏液分泌范圍達50%～75%；4分代表肺組織黏液分泌范圍>75%。

2 結果

2.1 BALF中中性粒細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)量變化情況 與對照組比較，OVA組及OVA+MDSCs組BALF中總細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)占比均顯著升高(P<0.01)。且與OVA組比較，OVA+MDSCs組BALF中總細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)及嗜酸性粒細胞占比均進一步顯著升高(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 BALF中中性粒細胞和嗜酸性粒細胞數(shù)量變化

2.2 血清中IFN-γ、IL-10、IgE、IL-17和IL-4含量水平 與對照組比較，OVA組與OVA+MSCs組小鼠血清中IgE、IL-17和IL-4含量水平均升高(P<0.01)，IFN-γ含量顯著降低(P<0.05)，OVA+MSCs組IL-10含量水平降低(P<0.01)。與OVA組比較，OVA+MDSCs組小鼠血清中IgE、IL-17和IL-4含量水平進一步顯著升高(P<0.01)，IFN-γ、IL-10含量水平顯著降低(P<0.01)。見表2。

表2 小鼠血清中IFN-γ、IL-10、IgE、IL-17和IL-4含量變化

2.3 氧化相關指標檢測 與對照組比較，OVA組與OVA+MDSCs組小鼠肺組織中MDA含量顯著升高，CAT、SOD和GPX含量顯著降低(P<0.01)；且與OVA組比較，OVA+MDSCs組小鼠肺組織中MDA含量進一步升高，CAT、SOD和GPX含量水平進一步降低(P<0.05，P<0.01)。見表3。

表3 小鼠右肺組織中MDA、CAT、SOD和GPX含量變化

2.4 HE染色 對照組小鼠肺組織支氣管結構完整，未見增生及肥大。OVA組與對照組相比出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，支氣管有較多黏膜皺襞，黏液分泌物增多半定量評分極顯著升高(P<0.01)。與OVA組比較，OVA+MDSCs組炎癥反應進一步加重，黏液分泌增多，損傷情況嚴重，半定量評分顯著增加(P<0.05)。見圖1和表4。

圖1 小鼠肺組織病理學改變(HE)

表4 小鼠肺組織HE半定量評分表

2.5 PAS染色 對照組小鼠氣道上皮周圍基本無杯狀細胞增生情況，氣管壁及上皮黏膜較薄，而OVA組杯狀細胞及黏液分泌增多，氣道細胞損傷嚴重，PAS評分及氣管壁、上皮黏膜厚度顯著增加(P<0.01)。與OVA組比較，OVA+MDSCs組小鼠杯狀細胞的增生進一步加重，半定量評分及氣管壁、上皮黏膜厚度進一步增加(P<0.05，P<0.01)。見圖2和表5。

表5 小鼠肺組織PAS染色

圖2 小鼠肺組織病理學改變情況(PAS)

3 討論

哮喘是兒童時期最常見的呼吸道變態(tài)反應性疾病，且以每年約4%的比例增加。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球受哮喘困擾人數(shù)總計33.4億人，居于兒童慢性疾病首位[8]。哮喘的臨床檢測和治療并非易事，因此探究其發(fā)病機制，尋求準確的診斷指標是目前醫(yī)學研究的熱點[9-10]。

Dong等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在進行同等OVA刺激時，雌性BALB/c小鼠支氣管肺泡中炎癥細胞聚集程度往往會比雄性高，反應程度明顯易于觀察，因此本實驗選用雌性BALB/c小鼠進行模型制備。嗜酸性粒細胞與中性粒細胞能夠分泌多種炎性介質刺激纖維母細胞生長并導致肺組織損傷。因此臨床常用嗜酸性粒細胞與中性粒細胞數(shù)量增多判斷患者是否為哮喘患者[12]。本實驗中OVA組嗜酸性粒細胞與中性粒細胞含量顯著升高，提示模型制備成功，確保了實驗結果的可靠性。OVA+MDSCs組BALF中總細胞數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞含量進一步升高，提示MDSCs能夠發(fā)揮一定的促炎作用。

哮喘疾病與患者體內(nèi)的Th1、Th2、Th17細胞功能失調有不可分割的關系。IL-4是Th2的典型細胞因子，能夠在免疫應答過程中與IL-4R結合，導致一系列磷酸化反應產(chǎn)生，同時它還能夠作用于B淋巴細胞，促進B淋巴細胞分泌IgE[13]。陳旭央等[14]在研究中指出血清IgE含量升高時，能夠通過釋放炎性介質導致支氣管平滑肌痙攣，影響肺部通氣功能而引發(fā)哮喘，所以臨床上可以通過檢測血清IgE觀察判斷兒童是否患有哮喘。IL-10主要由Th2細胞產(chǎn)生，某些還可能來源于Th1細胞。在生物學中主要發(fā)揮抑制促炎因子產(chǎn)生，促進未成熟和成熟胸腺細胞生長的作用[15]。研究表明[16]，在IL-10的產(chǎn)生受到抑制時，哮喘的誘發(fā)率往往上升，所以IL-10與哮喘疾病呈負相關關系。IFN-γ是Th1細胞的典型代表，能夠下調嗜酸性粒細胞趨化因子表達，還可以抑制IgE合成，所以可以在炎癥反應過程中負反饋調節(jié)。Th17是一種不同于Th1、Th2的細胞亞群，能夠分泌IL-17，誘導組織產(chǎn)生炎癥反應。施宇衡等[17]在探究中發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的血液中往往能檢測到大量的IL-17，可見IL-17的水平與哮喘疾病密切相關。在本研究中，OVA組與OVA+MSCs組小鼠血清中Th2型細胞因子IL-4、Th17型細胞因子IL-17和B淋巴細胞分泌的IgE含量均升高，Th1型細胞因子IFN-γ含量顯著降低，OVA+MSCs組Th2型細胞因子IL-10含量降低。而且與OVA組比較，OVA+MDSCs組小鼠血清中Th2型細胞因子IL-4、Th17型細胞因子IL-17和B淋巴細胞分泌的IgE含量顯著升高，Th1型細胞IFN-γ、IL-10含量顯著降低，提示MDSCs細胞能夠促進促炎炎癥因子IL-4、IL-17、IgE產(chǎn)生，而抑制反向調節(jié)炎癥反應的IFN-γ、IL-10產(chǎn)生，發(fā)揮加重哮喘的作用。

支氣管哮喘其發(fā)病根源在于氣道炎癥，氧自由基是與其關系密切的炎癥介質。哮喘發(fā)生時，炎性細胞大量產(chǎn)生并聚集，引發(fā)脂質過氧化反應。當自由基含量增多時，MDA含量也隨之增加，使得肺組織損傷加重。過量的氧自由基會導致SOD大量消耗，含量急劇減少，造成細胞膜損傷，并不斷形成惡性循環(huán)，損傷氣道上皮細胞，引發(fā)哮喘疾病[18]。哮喘中過量的活性氧能夠引發(fā)CAT及GPX的含量變化，當其含量急劇降低時，會導致呼吸道氧化/抗氧化失衡，引發(fā)氣道炎癥相關疾病，誘發(fā)哮喘[19]。張艷等[20]在研究過程中發(fā)現(xiàn)，哮喘模型組小鼠SOD、CAT活性顯著下降，MDA含量顯著升高，與本研究得出的結論一致。同時通過病理染色結果可以看出哮喘模型以及加入MDSCs細胞處理，均會導致起到腺體和杯狀細胞產(chǎn)生大量的黏液，氣管壁、上皮黏膜厚度增加，長期如此阻塞氣道，引發(fā)哮喘。病理染色結果表明MDSCs可增強小鼠肺組織炎性反應，加重平滑肌厚度，進一步加重哮喘。

綜上所述，本研究得出MDSCs能夠加重哮喘，其作用可能是通過調控Th1、Th2、Th17細胞水平，增加IL-4、IL-17分泌減輕IL-10及IFN-γ來實現(xiàn)的。

利益相關聲明：各作者聲明沒有利益沖突。

作者貢獻說明：林隆負責了整篇論文的撰寫、修改以及基金申請等工作，彭峰參與了實驗過程，進行了實驗數(shù)據(jù)的收集，金海麗對實驗數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析，并進行了論文作圖處理等，肖鳳春負責了整體實驗的方案設計以及實驗過程把控工作。