Nel樣1型基因?qū)υ缙诩毙匝浪柩子资笱浪钃p傷修復(fù)的作用及對(duì)Notch通路的影響*

武珂, 姜新亞, 陳穎, 張雪

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院牙體牙髓科(河南鄭州 450052)

急性牙髓炎主要指由細(xì)菌感染引起的牙髓組織急性炎癥，以發(fā)病急、疼痛劇烈為主要特點(diǎn)，患者常有自發(fā)性陣發(fā)性痛牙、夜間痛、疼痛無(wú)法自行定位等癥狀[1-2]。牙髓組織位于牙齒內(nèi)部的牙髓腔，包含血管、神經(jīng)、淋巴組織等，當(dāng)受到刺激時(shí)，表現(xiàn)為血管擴(kuò)張，伴有充血現(xiàn)象，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為急性牙髓炎[3]。臨床上急性牙髓炎的治療包括藥物及手術(shù)等方式，手術(shù)類型主要包括活髓切除術(shù)、根尖誘導(dǎo)成形術(shù)等，藥物治療多作為輔助手段，常用抗生素及鎮(zhèn)痛藥物進(jìn)行治療，且一般鎮(zhèn)痛藥物效果不顯著。由于部分患者存在恐懼、焦慮等不良情緒，往往因?yàn)楹ε露慌浜鲜中g(shù)治療，因此尋求可以替代手術(shù)的治療方法極為重要。Nel樣1型基因(Nel-like molecule-1，NELL-1)是一種在顱縫早閉患者早閉區(qū)過(guò)表達(dá)的基因，位于第11號(hào)染色體p15.1～p15.2，其編碼形成的蛋白與成骨細(xì)胞分化有關(guān)[4-5]。體外研究表明[6]，NELL-1作為一種成骨蛋白，不僅參與顱骨骨化，而且與骨骼維護(hù)有關(guān)，通過(guò)注射給藥可有效在動(dòng)物模型上誘導(dǎo)骨骼形成。Notch是高度保守的跨膜蛋白受體，與細(xì)胞之間信息傳遞、損傷修復(fù)密切相關(guān)[7-8]。2019年4—10月，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立幼鼠急性牙髓炎模型，明確NELL-1對(duì)牙髓損傷修復(fù)及對(duì)Notch信號(hào)通路的影響，研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)(ZDYFY-20190359)。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 含NELL-1序列(NELL-1)及其陰性對(duì)照(NELL-1 NC)，含NELL干擾序列(NELL-1-siRNA)及其陰性對(duì)照(NELL-1-siRNA-NC)的pcDNA3.1質(zhì)粒(長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司)，青霉素軟膏(上海瀚爾升進(jìn)出口有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，兔抗大鼠NELL-1、Notch一抗(武漢艾美捷科技有限公司)、兔抗大鼠Delta-1一抗(北京百奧萊博科技有限公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 儀器 腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，高速渦輪機(jī)(佛山市興斯醫(yī)療器械有限公司)，E-M10相機(jī)(日本Olympus公司)，WMS-1.35顯微鏡(上海無(wú)陌光學(xué)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡SD大鼠90只，體重(150±10)g，雌雄各半，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2018-0007。所有幼鼠鼠牙牙體、牙列完整，無(wú)齲病、外傷性牙折現(xiàn)象，上下頜咬合關(guān)系正常。適應(yīng)性飼喂7 d。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù) 隨機(jī)數(shù)字法將幼鼠分為對(duì)照組、模型組、NELL-1組、NELL-1-NC組、NELL-1-siRNA組、NELL-1-siRNA-NC組(n=15)。各組幼鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥進(jìn)行麻醉，置于手術(shù)板上，用腦立體定位儀將頭部固定后，四周放置暖水袋并略抬高軀體垂直高度，頭頸部備皮并消毒后，作一切口分離頸部肌肉，暴露第一寰椎及枕骨大孔，去除腦硬膜、蛛網(wǎng)膜并暴露延髓，將沾有腎上腺素的棉球置于延髓上方，根據(jù)腦定位圖譜，將0.4 μL pcDNA3.1、NELL-1-pcDNA3.1、NELL-NC-pcDNA3.1、NELL-1-siRNA-pcDNA3.1、NELL-1-siRNA-NC-pcDNA3.1分別注射于模型組、NELL-1組、NELL-1-NC組、NELL-1-siRNA組、NELL-1-siRNA-NC組幼鼠枕骨大孔至尾端延髓脊髓交界處無(wú)血管位置，對(duì)照組僅暴露延髓。結(jié)束后，碘伏進(jìn)行消毒，分層縫合肌肉皮膚，青霉素軟膏對(duì)外層皮膚切口進(jìn)行抗菌處理，室溫下蘇醒后，于溫度20℃、濕度55%的安靜環(huán)境下回籠飼養(yǎng)3周，期間正常飲食進(jìn)水。

1.5 建模 飼養(yǎng)結(jié)束后，除對(duì)照組外，其余各組幼鼠采用內(nèi)毒素誘導(dǎo)法[9]建模，用生理鹽水將LPS稀釋為5 mg/mL的溶液備用，腹腔注射0.3%戊巴比妥麻醉，將幼鼠呈仰臥位置于手術(shù)板上，固定四肢及上頜，充分暴露左側(cè)上頜磨牙，用75%酒精消毒后，用高速渦輪機(jī)005號(hào)球鉆在第一磨牙和第二磨牙頜面開髓，深度約1 mm，將浸潤(rùn)有LPS溶液的棉絮置于窩洞內(nèi)，用玻璃離子暫封，各幼鼠于37℃蘇醒后，放回飼養(yǎng)籠。建模結(jié)束3 d后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，其中模型組死亡2只，NELL-1組死亡1只、NELL-1-NC組死亡3只、NELL-1-siRNA組死亡4只、NELL-1-siRNA-NC組死亡2只。對(duì)照組正常飼養(yǎng)。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 痛行為學(xué)檢測(cè) 將各組幼鼠分別放入長(zhǎng)、寬、高均為20 cm的透明玻璃罩內(nèi)，底部放置相機(jī)實(shí)時(shí)拍攝記錄，待幼鼠適應(yīng)5 min后，記錄3 min內(nèi)每只幼鼠擦面行為總時(shí)間。結(jié)束后，75%酒精對(duì)玻璃罩內(nèi)部進(jìn)行徹底清洗，以防對(duì)下組實(shí)驗(yàn)造成影響。

1.6.2 血清中炎癥因子檢測(cè) 各組幼鼠尾靜脈取血2 mL，經(jīng)3 000 r/min離心5 min，取上層血清，根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α、IL-1β水平。

1.6.3 牙髓組織病理學(xué)觀察 取幼鼠左側(cè)上頜牙第一磨牙，于流動(dòng)水下反復(fù)沖洗并用多聚甲醛固定12 h，置于EDTA中脫鈣，梯度酒精中脫水后，用石蠟包埋，切片機(jī)切片，切片厚度4 μm。取切片用二甲苯脫蠟、酒精濃度由低到高脫水后，蘇木精進(jìn)行染色，經(jīng)鹽酸乙醇分化后，用伊紅復(fù)染，脫水后用二甲苯透明，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察牙髓組織病理變化。

1.6.4 牙髓組織NELL-1 mRNA表達(dá)量檢測(cè) 將幼鼠麻醉后，活體取出左側(cè)上頜牙第二磨牙，剝離磨牙并去除牙周軟組織，將磨牙牙髓用組織剪剪碎后磨成粉狀，取30 mg用于mRNA表達(dá)量檢測(cè)，其余牙髓粉末用于蛋白檢測(cè)。用Trizol提取總RNA，并計(jì)算濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，按照說(shuō)明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃延伸30 s共40個(gè)循環(huán)。所用引物序列，NELL-1正向引物：5′-CTGTGTGGCTCCTAACAAGTGTG-3′，反向引物：5′-GGATTCTGGCAATCACAAGCTGCT-3′，GAPDH正向引物：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反向引物：5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算牙髓組織中NELL-1表達(dá)水平。

1.6.5 牙髓組織NELL-1、Notch、Delta-1蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 用剩余磨牙牙髓粉末，經(jīng)裂解液裂解后提取總蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算上樣量。取蛋白，上樣、電泳后轉(zhuǎn)膜，并用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入兔抗大鼠NELL-1、Notch、Delta-1抗體一抗(均按1∶2 000稀釋)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(按1∶4 000稀釋)，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學(xué)反應(yīng)液，曝光顯影后，以GAPDH為內(nèi)參，目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參灰度值之比即為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 痛行為學(xué)比較 與對(duì)照組比較，模型組擦面行為時(shí)間增加(P<0.05)；與模型組、NELL-1-NC組比較，NELL-1組擦面行為時(shí)間減少(P<0.05)；與模型組、NELL-1-siRNA-NC組比較，NELL-1-siRNA組擦面行為時(shí)間增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組幼鼠痛行為學(xué)

2.2 血清中TNF-α、IL-1β水平比較 與對(duì)照組比較，模型組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；與模型組、NELL-1-NC組比較，NELL-1組TNF-α、IL-1β水平均降低(P<0.05)；與模型組、NELL-1-siRNA-NC組比較，NELL-1-siRNA組TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組幼鼠血清TNF-α、IL-1β水平

2.3 牙髓組織病理學(xué)觀察 HE染色顯示：對(duì)照組幼鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞排列規(guī)律，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管充血現(xiàn)象；模型組、NELL-1-NC組、NELL-1-siRNA-NC組大鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞層排列紊亂，有大量彌散性中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，血管充血明顯；NELL-1組大鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞部分排列紊亂，有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管輕度擴(kuò)張；NELL-1-siRNA組成牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)并聚集成團(tuán)，血管擴(kuò)張變形嚴(yán)重，管腔內(nèi)有紅細(xì)胞出現(xiàn)，有牙髓壞死現(xiàn)象。見圖1。

注：A：對(duì)照組；B:模型組；C:NELL-1組；D:NELL-1-NC組；E:NELL-1-siRNA組；F:NELL-1-siRNA-NC組

2.4 牙髓組織中NELL-1 mRNA表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組NELL-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組、NELL-1-NC組比較，NELL-1組NELL-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組、NELL-1-siRNA-NC組比較，NELL-1-siRNA組NELL-1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組幼鼠牙髓組織NELL-1 mRNA表達(dá)

2.5 牙髓組織NELL-1、Notch、Delta-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組NELL-1蛋白表達(dá)降低，Notch、Delta-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組、NELL-1-NC組比較，NELL-1組NELL-1蛋白表達(dá)升高，Notch、Delta-1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與模型組、NELL-1-siRNA-NC組比較，NELL-1-siRNA組NELL-1蛋白相對(duì)表達(dá)降低，Notch、Delta-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見表4，圖2。

表4 各組幼鼠牙髓組織NELL-1、Notch、Delta-1蛋白表達(dá)

圖2 Western Blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)情況

3 討論

急性牙髓炎的誘發(fā)因素包括外傷、飲食習(xí)慣、口腔衛(wèi)生情況差及氣壓驟變等，炎癥發(fā)生后，若感染未及時(shí)控制，毒素可通過(guò)根尖孔引起根尖感染，嚴(yán)重者發(fā)展為牙髓壞死，造成不可復(fù)性損傷[10]。作為牙髓病中最常見疾病之一，急性牙髓炎通常給患者帶來(lái)極大痛苦，因此尋找其治療靶標(biāo)在臨床中至關(guān)重要。NELL-1蛋白具有成骨特異性強(qiáng)、誘導(dǎo)形成的骨組織更致密、炎癥反應(yīng)更小的特點(diǎn)，被證實(shí)是骨穩(wěn)態(tài)和軟骨內(nèi)骨化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其大量失活可阻礙闌尾骨骼的生成[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建NELL-1重組質(zhì)粒，觀察其對(duì)急性牙髓炎幼鼠牙髓損傷的修復(fù)情況，明確其作用機(jī)制，為急性牙髓炎臨床治療提供新型治療方案。

機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)可參與牙髓組織對(duì)外來(lái)有害物質(zhì)的防御反應(yīng)。細(xì)菌及毒性物質(zhì)侵入牙髓組織后，通過(guò)免疫細(xì)胞及炎性介質(zhì)等的相互作用，在激活細(xì)胞釋放細(xì)胞因子以抵抗外來(lái)抗原的毒性作用的同時(shí)，會(huì)引起組織損傷，導(dǎo)致牙髓組織最終壞死。研究表明，NELL-1具有促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞遷移及血管生成的作用，將其與生物材料結(jié)合使用，可有效減輕疼痛及恢復(fù)時(shí)間，降低發(fā)病率[12]。NELL-1在多種動(dòng)物模型的骨誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，可減輕LPS誘導(dǎo)的人牙髓細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)[13]。本研究分別過(guò)表達(dá)和敲降NELL-1，分析其對(duì)牙髓炎幼鼠牙髓損傷的影響，結(jié)果顯示，NELL-1過(guò)表達(dá)可明顯減少擦面行為時(shí)間，降低炎癥因子水平外，對(duì)牙髓組織病理也有明顯的改善作用，而敲降NELL-1后上述結(jié)果則呈相反趨勢(shì)，提示過(guò)表達(dá)NELL-1可緩解疼痛反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)，利于牙髓損傷恢復(fù)。上調(diào)NELL-1可影響相關(guān)信號(hào)通路，保護(hù)人二尖瓣間質(zhì)細(xì)胞免受TNF-α誘導(dǎo)的炎性損傷[14]。由此推測(cè)，NELL-1可能通過(guò)某種機(jī)制發(fā)揮抑炎作用，從而改善幼鼠牙髓損傷。

Notch信號(hào)通路由受體、配體及細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子組成，不僅影響細(xì)胞正常形態(tài)，還通過(guò)與相鄰細(xì)胞間相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞、組織、器官的分化發(fā)育[15-16]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[17-18]，大鼠牙髓損傷后，牙髓細(xì)胞中Notch信號(hào)被激活，并呈動(dòng)態(tài)表達(dá)，相關(guān)藥物可能通過(guò)調(diào)節(jié)Notch相關(guān)途徑增強(qiáng)牙髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞或成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，在抗炎的同時(shí)，誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成。Delta-1作為Notch通路配體，可顯著增強(qiáng)體外牙髓干細(xì)胞的增殖、分化[19]。通過(guò)調(diào)節(jié)Notch相關(guān)途徑，可影響牙髓干細(xì)胞和根尖乳頭干細(xì)胞分化和增殖過(guò)程[20]。本研究進(jìn)一步探討NELL-1改善牙髓損傷的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NELL-1后，隨著NELL-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，而Notch蛋白及Delta-1蛋白表達(dá)明顯降低，敲降NELL-1后則與上述結(jié)果趨勢(shì)相反，提示NELL-1可能參與調(diào)節(jié)Notch通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，其抗炎作用可能與抑制Notch相關(guān)通路有關(guān)。

綜上所述，過(guò)表達(dá)NELL-1可以減輕急性牙髓炎幼鼠炎癥反應(yīng)，改善牙髓病理變化，從而達(dá)到損傷修復(fù)的目的，其機(jī)制可能與抑制Notch相關(guān)通路有關(guān)，可為臨床急性牙髓炎的靶向治療提供方案。

利益相關(guān)聲明：所有作者聲明無(wú)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：武珂對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了構(gòu)思和設(shè)計(jì)，姜新亞和陳穎進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程，張雪進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、收集及分析，武珂撰寫并修訂論文，姜新亞、陳穎和張雪審校論文。