基于電紡PNIPA-AA/PCL纖維基底的細(xì)胞膜片制備

湯曉涵，唐 寒，郭煦然，李東紅，李慧娟，張彥中

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620）

基于生物材料支架的傳統(tǒng)組織工程方法存在宿主反應(yīng)強(qiáng)或單細(xì)胞懸液注射治療體內(nèi)轉(zhuǎn)化率低[1]等局限性。細(xì)胞膜片是指通過(guò)細(xì)胞膜片技術(shù)[2]形成的包含完整細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）與細(xì)胞-細(xì)胞間連接的單層膜狀細(xì)胞集合體結(jié)構(gòu)，該技術(shù)可克服上述局限性，因此已受到組織工程領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前，單層或通過(guò)層-層堆疊的三維細(xì)胞膜片已應(yīng)用于臨床受損皮膚[3]、角膜[4]、心臟[5]、牙周[6]、肌腱[7]等的修復(fù)治療，功效十分顯著[8]。

經(jīng)典的細(xì)胞膜片技術(shù)通常使用溫敏材料如聚N-異丙基丙烯酰胺（PNIPA）在較溫和的條件下首先通過(guò)電子束輻照[9]、物理或化學(xué)吸附[10]、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（ATRP）[11]等方法使PNIPA固定在聚二甲基硅氧烷（PDMS）或聚苯乙烯（PS）培養(yǎng)皿表面形成一層溫敏層[12]，然后使目標(biāo)細(xì)胞在溫敏培養(yǎng)基底上培養(yǎng)至融合，最后通過(guò)將環(huán)境溫度從37 ℃降低至20 ℃獲得細(xì)胞膜片（目前已有商業(yè)化產(chǎn)品UpCell?用于臨床）。但這種通過(guò)表面接枝PNIPA的細(xì)胞培養(yǎng)基底通常存在細(xì)胞膜片脫落時(shí)間較長(zhǎng)的問(wèn)題，而長(zhǎng)時(shí)間處于較低溫度會(huì)損害細(xì)胞活性，影響細(xì)胞膜片的完整性與功能。為解決該問(wèn)題，通過(guò)化學(xué)接枝引入羧基（-COOH）或羥基（-OH）等親水基團(tuán)和使用多孔結(jié)構(gòu)增加基底的水浸潤(rùn)速率已被證明是較好的可加速細(xì)胞膜片脫落的改進(jìn)手段[13-15]。

通過(guò)電紡絲方法制備的納-微米纖維可以較好地仿生細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境ECM的超細(xì)纖維結(jié)構(gòu)，基于電紡的納-微米纖維狀拓?fù)浠撞粌H促進(jìn)細(xì)胞的增殖，快速形成細(xì)胞膜片，而且其較高的比表面積也有利于加速基底水潤(rùn)，促進(jìn)細(xì)胞脫落，這些優(yōu)點(diǎn)將為快速形成高質(zhì)量細(xì)胞膜片提供更合適的細(xì)胞生長(zhǎng)基底平臺(tái)。但PNIPA存在可電紡性較差、纖維水浸潤(rùn)后易溶解等問(wèn)題[16]，雖然提高PNIPA分子量[17]或與疏水性聚合物混和后電紡[18,19]可一定程度上解決上述問(wèn)題，如Allen等[19]制備了取向PNIPA/聚己內(nèi)酯（PCL）纖維，當(dāng)PNIPA在PNIPA/PCL混合物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，在其表面培養(yǎng)的細(xì)胞膜片可以較好地脫落，但纖維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性及細(xì)胞膜片脫落速率尚存在較大改進(jìn)空間。

丙烯酸（AA）改性的PNIPA常被制備成溫敏與pH雙響應(yīng)的智能水凝膠而應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[20]，不加入交聯(lián)劑聚合得到的鏈狀PNIPA-AA攜帶大量親水基團(tuán)，具有優(yōu)異的潤(rùn)濕性因而可用于加速細(xì)胞膜片脫落。PCL是一種生物相容性良好的疏水性彈性體，與PNIPA混紡不僅有利于改善PNIPA的生物相容性，還可以促進(jìn)細(xì)胞在纖維表面的黏附。本文首先將NIPA與AA通過(guò)自由基聚合得到PNIPA-AA聚合物，然后將PNIPA-AA與PCL混合，通過(guò)電紡絲方法制備PNIPA-AA/PCL纖維基底，對(duì)所制備的纖維基底進(jìn)行溫敏特性表征，最后以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（C3H/10T1/2）為模型細(xì)胞，研究了PNIPA-AA/PCL纖維基底對(duì)細(xì)胞膜片形成與脫落的影響及脫落細(xì)胞膜片的完整性及功能性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

N-異丙基丙烯酰胺（NIPA）：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；AA：化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；偶氮二異丁腈（AIBN）：分析純，上海阿拉丁試劑有限公司；聚己內(nèi)酯（PCL）：重均分子量為8×104，美國(guó)Sigma公司；2,2,2-三氟乙醇（TFE）：純度 ≥ 99.0%，上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司。

C3H/10T1/2：中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)；含有非必需氨基酸（NEAA）的完全培養(yǎng)基（EMEM）：細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，上海中喬新舟醫(yī)藥技術(shù)公司；Dulbecco’s磷酸鹽緩沖溶液（DPBS）：細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，武漢賽維爾生物科技有限公司；細(xì)胞活/死染色試劑盒，美國(guó)Thermo Fisher公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）：細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，碧云天生物科技公司；活細(xì)胞示蹤劑：細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，上海懋康生物科技有限公司；4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料、鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）染料：細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，美國(guó)Invitrogen公司；抗-纖連蛋白（Anti-Fibronectin）抗體、抗N-鈣黏素蛋白（Anti-N-Cadherin）抗體、山羊抗兔IgG H&L：細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)，英國(guó)Abcam公司。

1.2 PNIPA-AA的合成與表征

將單體NIPA經(jīng)低溫重結(jié)晶除去其中的阻聚劑，稱(chēng)取1.0 g NIPA和0.328 g AIBN，加入4 mL無(wú)水乙醇至雙口燒瓶攪拌均勻，在N2氛圍下鼓吹10 min，置于60 ℃水浴反應(yīng)24 h，制得PNIPA。

稱(chēng)取1.5 g NIPA、0.3 g AA和0.328 g 引發(fā)劑AIBN，加入5 mL的無(wú)水乙醇至雙口燒瓶攪拌均勻，在N2氛圍下鼓吹10 min，置于60 ℃水浴反應(yīng)24 h后，采用截留分子量為1.2×104～1.4×104的透析袋除去未反應(yīng)的單體與引發(fā)劑，在4 ℃冰箱中透析3 d（每隔12 h換水），將透析后溶液放入-80 ℃冰箱中冷凍過(guò)夜后冷凍干燥，得到白色固體PNIPA-AA。

將NIPA單體與PNIPA-AA用重水（D2O）溶解后置于核磁管中進(jìn)行核磁共振氫譜（1H-NMR，瑞士Bruker公司AVANCE400型）分析。 采用KBr壓片法，用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR，上海馭锘實(shí)業(yè)有限公司Nicolet 6700型）儀對(duì)合成的聚合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。通過(guò)變溫紅外光譜檢測(cè)所合成聚合物的溫敏特性（KBr壓片法+升溫附件）。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-Vis，日本島津公司UV3600型）在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)量聚合物水溶液在不同溫度下的透光率，以確定其低臨界溶解溫度（LCST）。為宏觀檢測(cè)溫敏性，將聚合物配制成質(zhì)量濃度為0.005 g/mL的水溶液，分別在25 ℃和40 ℃下觀察聚合物在水中的溶解和析出形態(tài)變化。

1.3 PNIPA-AA/PCL纖維基底的制備與表征

先將PNIPA以100 mg/mL的質(zhì)量濃度溶于無(wú)水乙醇，然后在已清洗處理并干燥后的圓形玻片（直徑14 mm）上滴加200 μL配制好的PNIPA溶液，最后用美國(guó)LaureⅡ公司W(wǎng)S-650MZ-23NPPB型勻膠機(jī)以3 000 r/min轉(zhuǎn)速旋涂30 s[21]，由此得到PNIPA薄膜涂層基底（PNIPA-c）。將得到的旋涂玻片放入真空干燥箱中備用。

將PNIPA、PNIPA/PCL（m(PNIPA)∶m(PCL)=9∶1）[19]、PNIPA-AA/PCL （m(PNIPA-AA)∶m(PCL)=3∶1）分別溶于TFE中，配制成質(zhì)量濃度為0.2 g/mL的紡絲液，然后將紡絲液裝入附有針頭（內(nèi)徑為0.6 mm）的5 mL塑料注射器中電紡（20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，紡絲速率1.1 mL/h，電壓9～11 kV，接收距離14～15 cm）。由此分別得到PNIPA純紡纖維（PNIPA-f）、PNIPA/PCL混紡纖維和PNIPA-AA/PCL混紡纖維。通過(guò)在直徑為14 mm的玻片上沉積電紡纖維制得用于細(xì)胞培養(yǎng)的纖維基底。將各電紡纖維樣品在真空干燥箱中干燥處理備用，其制備示意圖如圖1所示。

圖1 PNIPA-AA/PCL纖維基底的制備及細(xì)胞膜片獲取示意圖Fig. 1 Schematic of electrospun fibrous PNIPA-AA/PCL substrate formation and cell sheet harvest

使用掃描電子顯微鏡（SEM，日本JEOL公司JSM-5 600型）在10～15 kV加速電壓下觀察PNIPA-c及各電紡纖維基底（PNIPA-f、PNIPA/PCL、PNIPA-AA/PCL）的形貌，并使用Image J軟件分析纖維直徑（樣品數(shù)n≥ 50）。

使用接觸角測(cè)量?jī)x（德國(guó)克呂士公司DSA30型）分別在20 ℃和37 ℃下測(cè)試去離子水液滴（2 μL）滴落到基底表面30 s時(shí)的接觸角（樣品數(shù)n≥ 5），并通過(guò)攝像模式記錄20 ℃下液滴滴落在基底表面后完全浸潤(rùn)消失時(shí)的時(shí)間。

1.4 細(xì)胞膜片的制備與功能檢測(cè)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)將C3H/10T1/2在EMEM（含有NEAA）完全培養(yǎng)基中復(fù)蘇、培養(yǎng)和傳代。細(xì)胞接種前，將沉積在玻片上的纖維樣品放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并用定制的不銹鋼環(huán)固壓，紫外光照射滅菌12 h，種板前添加經(jīng)37 ℃水浴預(yù)熱過(guò)的培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)4 h，然后將C3H/10T1/2接種在PNIPA-c、PNIPA-f、PNIPA/PCL及PNIPA-AA/PCL這4組基底上（全程在37 ℃恒溫加熱臺(tái)上操作），在37 ℃、 CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，每2 d更換1次培養(yǎng)液。

1.4.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)將C3H/10T1/2以每孔2 × 104個(gè)的細(xì)胞密度接種于4組基底上，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)1、2、3 d。通過(guò)CCK-8比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖，具體步驟如下：吸出培養(yǎng)液，每孔加入285 μL培養(yǎng)基和15 μL CCK-8試劑的混合液，37 ℃孵育4 h后，取100 μL的細(xì)胞培養(yǎng)液至96孔板中，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（OD）。

1.4.3 細(xì)胞骨架染色將C3H/10T1/2以每孔1 × 104個(gè)的細(xì)胞密度接種于4組基底上，培養(yǎng)1 d后進(jìn)行DAPI和Phalloidin染色。具體步驟如下：吸去培養(yǎng)基，在37 ℃下用質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的多聚甲醛溶液對(duì)細(xì)胞固定20 min，加入Triton X-100溶液通透10 min；用200 μL Phalloidin染色液避光染色細(xì)胞骨架30 min，用200 μL DAPI染色液室溫避光染色細(xì)胞核10 min；通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察肌動(dòng)蛋白（F-actin）骨架形態(tài)。

1.4.4 免疫熒光染色將C3H/10T1/2以每孔5 × 105個(gè)的細(xì)胞密度接種于4組基底上，培養(yǎng)7 d后觀察細(xì)胞-細(xì)胞間連接及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。具體步驟如下：首先將形成的細(xì)胞膜片放在37 ℃恒溫加熱臺(tái)上，使用質(zhì)量濃度為0.04 g/mL的多聚甲醛溶液固定20 min，每孔加入Triton X-100溶液通透10 min；然后加入200 μL封閉液封閉30 min以阻斷非特異性染色；接著加入200 μL的N-鈣黏素（N-cad）與纖連蛋白（Fn）一抗稀釋液，4 ℃下孵育過(guò)夜；再添加200 μL帶熒光物質(zhì)標(biāo)記的二抗稀釋液山羊抗兔IgG，室溫下避光孵育2 h；最后每孔加入200 μL的DAPI染料對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。染色24 h內(nèi)使用倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。使用Image J進(jìn)行熒光定量分析。

1.4.5 細(xì)胞膜片的脫落通過(guò)降溫至20 ℃的方法使溫敏材料溶解，從而使細(xì)胞膜片從基底材料表面脫落。為減弱低溫下細(xì)胞在各表面的黏附，加入不含鈣鎂離子的DPBS以使細(xì)胞膜片分離更徹底[22]。步驟如下：吸去培養(yǎng)基，每孔加入1 mL預(yù)冷的DPBS緩沖液浸泡3次，每次間隔2 min；在20 ℃下靜置10 min后輕輕搖晃，將膜片輕緩分離。

1.4.6 活細(xì)胞示蹤劑染色通過(guò)活細(xì)胞示蹤劑染色檢測(cè)細(xì)胞膜片脫落情況。將C3H/10T1/2以每孔5 × 105個(gè)的細(xì)胞密度接種到4組基底并培養(yǎng)7 d后，每孔加入300 μL熒光示蹤劑染料，放入37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min（全程換液操作在37 ℃加熱臺(tái)上進(jìn)行）。通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞膜片形成情況；通過(guò)1.4.5節(jié)中的細(xì)胞脫落方法使細(xì)胞膜片脫落，之后再次通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察各基底上剩余的未脫落細(xì)胞。通過(guò)Image J軟件統(tǒng)計(jì)各基底上脫落前細(xì)胞數(shù)（n0）與脫落后剩余的細(xì)胞數(shù)（n1），計(jì)算細(xì)胞脫落率。

1.4.7 細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移將脫落的細(xì)胞膜片通過(guò)剪去尖端的1 mL無(wú)菌槍頭吸取后，立刻轉(zhuǎn)移釋放至新的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使用移液泵從液面最上層開(kāi)始，小心吸凈DPBS緩沖液，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)在37 ℃下培養(yǎng)。

1.4.8 活/死細(xì)胞染色通過(guò)活/死細(xì)胞染色方法評(píng)估轉(zhuǎn)移后細(xì)胞膜片的活力。步驟如下：將上述1.4.7節(jié)中轉(zhuǎn)移的細(xì)胞膜片在37 ℃下培養(yǎng)2 d后，使用PBS清洗細(xì)胞3次；將活/死細(xì)胞染料以每孔200 μL的量加入到孔板中，放入37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min；將染料吸去后用PBS清洗細(xì)胞3次，通過(guò)倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad Prism 8.0和Origin 8.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用單因素方差（One-Way ANOVA）分析數(shù)據(jù)間是否有顯著性差異。當(dāng)*p＜ 0.05時(shí)認(rèn)為有顯著性差異，當(dāng)**p＜ 0.01時(shí)認(rèn)為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 PNIPA-AA的表征

PNIPA和PNIPA-AA的1H-NMR圖譜如圖2（a）所示。化學(xué)位移為6.10處（峰a）的峰為=CH2的特征峰，5.70處（峰b）為不飽和雙鍵中的叔碳=C―的特征峰；3.87處（峰c）為酰胺基團(tuán)中的-NH-的特征峰；1.08處（峰d）為異丙基中的-CH3的特征峰；1.90和1.55處（峰e(cuò)、f）為雙鍵消失后的次甲基―CH―和亞甲基―CH2―的特征峰； 2.75處（峰g）為AA中的次甲基―CH―的特征峰； 4.24處（峰h）為AA部分的羥基―OH的特征峰。單體的雙鍵信號(hào)峰（a、b）消失，證明PNIPA與PNIPA-AA的成功聚合[23]。

圖2 （a）核磁共振氫譜圖；（b）紅外光譜圖；（c）PNIPA-AA變溫紅外光譜圖；（d）聚合物水溶液在不同溫度下的透光率曲線；（e）PNIPA和PNIPA-AA在不同溫度下的溶液中析出/溶解宏觀形貌變化Fig. 2 (a) 1H-NMR spectra; (b) FT-IR spectra; (c) Temperature-dependent FT-IR spectrum of PNIPA-AA; (d) Optical transmittance of aqueous polymer solutions at varied temperatures; (e) Macroscopic observation of morphological changes of precipitation/dissolution of PNIPA and PNIPA-AA

FT-IR光譜（圖2（b））顯示了PNIPA和PNIPA-AA的特征吸收峰，1 546 cm-1和1 650 cm-1處的吸收峰歸屬于PNIPA酰胺基團(tuán)中的-NH-鍵和C=O鍵的特征吸收峰；1 719 cm-1處的吸收峰為AA羧基的C=O拉伸振動(dòng)峰；1 368 cm-1和1 388 cm-1處的吸收峰為異丙基上雙甲基的對(duì)稱(chēng)彎曲振動(dòng)峰。以上結(jié)果也表明成功合成了PNIPA和PNIPA-AA[23]。

變溫紅外光譜[24]（圖2（c））顯示，不同檢測(cè)溫度下，PNIPA-AA僅在3 300～3 600 cm-1有明顯區(qū)別，這一范圍內(nèi)3 420 cm-1處吸收峰為AA中羥基的拉伸振動(dòng)峰，這是PNIPA-AA與空氣中水分子結(jié)合形成氫鍵的體現(xiàn)。隨著溫度升高，吸收峰面積變小，氫鍵穩(wěn)定性變差，與水分子結(jié)合能力下降，說(shuō)明PNIPA-AA具有溫敏性，且其溫敏性與分子結(jié)構(gòu)中同水分子結(jié)合形成氫鍵的穩(wěn)定性有關(guān)。

LCST是聚合物水溶液在500 nm波長(zhǎng)下透光率降至一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度[25]。聚合物溶液在不同溫度下的透光率曲線（圖2（d））表明，PNIPA與PNIPA-AA的LCST分別為30.4 ℃和33.6 ℃，接近人體溫度，從而確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞膜片可通過(guò)降溫方法實(shí)現(xiàn)脫落。AA單體中親水基團(tuán)-COOH的引入提高了聚合物PNIPAAA的LCST[23]。聚合物溶液宏觀上（圖2（e））表現(xiàn)為：室溫下呈澄清狀態(tài)，隨著溫度升高逐漸變渾濁，最后從溶液中析出。

2.2 PNIPA-AA/PCL纖維基底的表征

各組基底的SEM形貌結(jié)果如圖3（a）顯示，PNIPA-c表面旋涂平整；PNIPA-f纖維較細(xì)并存在極細(xì)的纖維，形貌不均，平均直徑為（133.9 ± 60.1）nm；引入PCL后，PNIPA/PCL纖維直徑變粗，局部出現(xiàn)紡錘形串珠結(jié)構(gòu)[26]，平均直徑為（507.9 ± 127.3）nm；嫁接AA并與PCL混紡后，可電紡性明顯提升，且所制備的PNIPAAA/PCL纖維形貌更加均一，平均直徑為（472.4 ± 72.9）nm。

圖3 各組基底的（a）SEM形貌圖；（b）水接觸角；（c）水浸潤(rùn)速率Fig. 3 (a) SEM images, (b) water contact angles and (c) water infiltration rates of different substrates

水接觸角測(cè)試結(jié)果（圖3（b））顯示，在低溫（20 ℃）下4組基底均具有親水特性，在高溫（37 ℃）下4組基底表面相對(duì)疏水。比較而言，PNIPA-AA/PCL溫敏纖維在37 ℃下比其他2組更能維持相對(duì)疏水狀態(tài)，說(shuō)明疏水組分PCL的引入可增加PNIPA纖維在水溶液中的疏水性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。4組基底在20 ℃下水完全浸潤(rùn)表面的時(shí)間統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3（c）顯示，PNIPA-AA/PCL纖維基底表面液滴約28 s完全浸潤(rùn)表面，表明通過(guò)引入親水基團(tuán)-COOH可以實(shí)現(xiàn)快速浸潤(rùn)。以上結(jié)果顯示，4組基底均存在溫敏性，符合用于制備細(xì)胞膜片的基底溫敏特性要求。

2.3 PNIPA-AA/PCL纖維基底對(duì)細(xì)胞膜片形成與脫落的影響

細(xì)胞增殖結(jié)果（圖4（a））顯示，細(xì)胞在4組基底均能增殖，第3 d時(shí)PNIPA/PCL與PNIPA-AA/PCL纖維基底對(duì)細(xì)胞的增殖能力顯著高于PNIPA-c和PNIPA-f組，且PNIPA-AA/PCL組顯示出較好的促細(xì)胞增殖能力，這有利于快速形成細(xì)胞膜片。

圖4 （a）第1 d、2 d、3 d的細(xì)胞增殖情況；（b）第7 d時(shí)的 N-cad與Fn免疫熒光染色（細(xì)胞核藍(lán)色和蛋白綠色）；（c）第7 d時(shí)的活細(xì)胞示蹤劑染色；（d）細(xì)胞膜片的細(xì)胞脫落率統(tǒng)計(jì)；（e）第7 d時(shí)的細(xì)胞膜片脫落前后的細(xì)胞骨架形貌（細(xì)胞核藍(lán)色和細(xì)胞骨架紅色）；（f）細(xì)胞膜片實(shí)物圖Fig. 4 (a) Cell proliferation at 1 d, 2 d, and 3 d; (b) Immunofluorescence staining of N-cad and Fn at 7 d (Nuclei blue and protein green);(c) Live cell tracking staining at 7 d; (d) Cell detachment rates; (e) Cytoskeletal morphology before and after detachment of cell sheets at 7 d (Nuclei blue and cytoskeleton red); (f) Photographs of detached cell sheets

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至融合后即具有脫落的潛力，為獲取ECM更完整的細(xì)胞膜片，各組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間統(tǒng)一設(shè)定為7 d。N-cad是一種介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞相互連接的糖蛋白分子，常被用于檢測(cè)細(xì)胞膜片的完整性；而在細(xì)胞與其胞外基質(zhì)黏附中起重要作用的Fn則可用于評(píng)估成纖維細(xì)胞膜片中的ECM分泌情況。培養(yǎng)7 d的免疫熒光染色結(jié)果（圖4（b））顯示，PNIPA-AA/PCL纖維組N-cad表達(dá)量更高，細(xì)胞間連接緊密，且PNIPA-AA/PCL纖維組分泌的Fn更多，形成的細(xì)胞外基質(zhì)更完整。說(shuō)明適當(dāng)提高PCL的含量，一方面提高了PNIPA的生物相容性[19]，有利于緩解PNIPA可能存在的降解毒性[27]，另一方面也為細(xì)胞提供更多疏水位點(diǎn)黏附，并且仿生ECM纖維的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而更好地促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)分泌，快速形成良好的細(xì)胞膜片。

細(xì)胞膜片脫落結(jié)果（圖4（c））顯示，降溫后4組細(xì)胞膜片均能脫落，PNIPA/PCL 和PNIPA-AA/PCL纖維基底組獲取的細(xì)胞膜片更緊密，完整性更好。統(tǒng)計(jì)脫落后基底剩余細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞脫落率（圖4（d）），PNIPA-c組的細(xì)胞脫落率僅為70%，其余3組均在90%以上，并以PNIPA-AA/PCL纖維基底組最高。

通過(guò)細(xì)胞骨架染色觀察培養(yǎng)至第7 d的細(xì)胞膜片脫落前后的細(xì)胞骨架變化（圖4（e）），未脫落前各組細(xì)胞膜片骨架輪廓清晰，應(yīng)力纖維明顯，整體比較致密整齊；脫落后PNIPA-c、PNIPA-f和PNIPA/PCL組細(xì)胞膜片骨架變得不規(guī)整，輪廓逐漸不清晰，而PNIPA-AA/PCL纖維基底上的細(xì)胞卻能較好克服這種收縮力，骨架依舊維持原型，這可能與膜片快速脫落及完整度更高的細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞骨架重排影響較少有關(guān)[28]。

從各組細(xì)胞膜片實(shí)物圖（圖4（f））可以看出，PNIPA-c組細(xì)胞膜片破碎明顯且完整性較差，PNIPA-f和PNIPA/PCL纖維基底細(xì)胞膜片較完整，而PNIPA-AA/PCL纖維基底細(xì)胞膜片完整度最高。PNIPA-c、PNIPA-f、PNIPA/PCL基底的平均脫落時(shí)間分別為30、14、16 min，而PNIPA-AA/PCL纖維基底僅需約10 min即可達(dá)到細(xì)胞膜片完全分離，脫落時(shí)間顯著縮短。

以上結(jié)果表明，PNIPA-AA/PCL纖維基底由于側(cè)鏈富含親水基團(tuán)以及比表面積較大，水浸潤(rùn)程度更高，細(xì)胞膜片從基底表面分離更徹底，低溫下水浸潤(rùn)速率更快，細(xì)胞膜片分離所需時(shí)間大大縮短，細(xì)胞處于低溫環(huán)境時(shí)間更短，導(dǎo)致細(xì)胞膜片收縮程度更小。

2.4 PNIPA-AA/PCL纖維基底對(duì)脫落后膜片完整性與功能的影響

4組細(xì)胞膜片脫落后N-cad和Fn免疫熒光染色照片及脫落前后熒光定量對(duì)比如圖5（a，b）所示。相比于其他3組，PNIPA-AA/PCL纖維基底細(xì)胞膜片脫落前后細(xì)胞間連接蛋白、ECM蛋白表達(dá)不存在顯著性差異，說(shuō)明降溫脫落后細(xì)胞膜片仍保留較緊密的細(xì)胞-細(xì)胞間連接與較完整的ECM。這可能是由于細(xì)胞脫落時(shí)間短，對(duì)細(xì)胞造成的損害更?。煌瑫r(shí)在DPBS的協(xié)同作用下，細(xì)胞膜片分離更徹底，保留了更完整的胞外基質(zhì)蛋白。這種保持較高完整性與功能性的細(xì)胞膜片通過(guò)移植修補(bǔ)，或代替受損組織，或細(xì)胞膜片的旁分泌作用釋放生長(zhǎng)因子治療功能失調(diào)組織。

圖5 （a）脫落后細(xì)胞膜片N-cad和Fn的免疫熒光染色（細(xì)胞核藍(lán)色和蛋白綠色）；（b）分別對(duì)圖4（b）和圖5（a）中的熒光強(qiáng)度定量分析；（c）脫落后再黏附細(xì)胞活/死染色（活細(xì)胞綠色和死細(xì)胞紅色）Fig. 5 (a) Immunofluorescence staining of N-cad and Fn after detachment of cell sheets (Nuclei blue and protein green); (b) Quantitative analysis of fluorescence intensity in Fig.4(b) and Fig.5(a); (c) Live/dead staining of adherent cells after being harvested (Live cells green and dead cells red)

將收獲的細(xì)胞片轉(zhuǎn)移到新的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入完全培養(yǎng)基并在37 ℃下培養(yǎng)2 d，活/死染色結(jié)果（圖5（c））表明，4組細(xì)胞膜片健康且質(zhì)量良好，移植后均可再黏附增殖，細(xì)胞存活率分別為（69.0 ± 2.6）%、（72.0 ± 2.4）%、（84.0 ± 1.9）%和（91.0 ± 2.3）%。說(shuō)明從PNIPA-AA/PCL纖維基底組獲取的細(xì)胞膜片完整性與功能性保持良好，且再轉(zhuǎn)移后細(xì)胞活力仍處于較高水平。

3 結(jié) 論

（1） 通過(guò)AA嫁接PNIPA后與PCL混紡成功制備了攜帶親水基團(tuán)并具有高比表面積的PNIPA-AA/PCL溫敏仿生纖維基底，相比于PNIPA-c、PNIPA-f和PNIPA/PCL 基底， PNIPA-AA/PCL基底有利于細(xì)胞黏附與增殖、增強(qiáng)ECM分泌、且顯著縮短細(xì)胞膜片完全脫落的時(shí)間。

（2） 在PNIPA-AA/PCL纖維基底上，脫落后的細(xì)胞膜片具有抗收縮性及較好的細(xì)胞活力，細(xì)胞-細(xì)胞連接緊密且ECM保持完好。